sinRice,PlantPhysiology, 2005,V139 (1)296-305;公众可从中 国科学院遗传与发育生物学研究所获得）的RNA，反转录得到cDNA为模板，用eTM1432-Pl和eTM1432-P2进行PCR扩增，得到353bp的扩增产物，经过测序，该扩增产物具有序列表中 序列3所示的核苷酸。
[0059] 将上述PCR产物用XbaI和PstI限制性内切酶酶切，与经过同样酶切的表达载 体PCAMBIA2300 (购自CAMBIA，澳大利亚）连接，得到重组载体，命名为0E-eTM1432,为将序 列3所示的DNA分子替换表达载体pCAMBIA2300的XbaI和PstI酶切位点间的DNA片段。
[0060] 5、转基因水稻的获得
[0061] 1)农杆菌转化获得转基因水稻
[0062] 将上述3获得的重组载体0E-miR1432和上述4获得的重组载体0E-eTM1432分别 导入农杆菌AGL1(ATCCNo.BAA-101，购自ATCC)，得到重组菌AGLl/0E-miR1432和重组菌 AGLl/0E-eTM1432。
[0063] 将重组菌AGLl/0E-miR1432和重组菌AGLl/0E-eTM1432通过农杆菌介导的方法转 入日本晴水稻（〇·SativaL.spp.japonica，varnipponbare，以下也称为野生型水稻；Loss ofFunctionofOsDCLIAffectsMicroRNAAccumulationandCausesDevelopmental DefectsinRice,PlantPhysiology, 2005,V139(l)296-305;公众可从中国科学院遗传与 发育生物学研究所获得）中，得到TO代转0E-miR1432水稻和TO代转0E-eTM1432水稻。
[0064] 2)PCR鉴定
[0065] 提取T0代转0E-miR1432水稻和T0代转0E-eTM1432水稻的基因组DNA，然后用 35S启动子的特异引物P3和miR1432-P2的特异引物和eTM1432-P2的特异引物，分别进行 0E-miR1432和0E-eTM1432转基因植物的PCR鉴定。
[0066] P3 引物序列如下：P3:TGCTTCGTCAGGCTTAGATGTG
[0067] 引物P3和miR1432-P2的特异引物扩增TO代转0E-miR1432水稻，得到369bp的 为阳性T0代转0E-miR1432水稻。
[0068] 引物P3和eTM1432-P2的特异引物扩增T0代转0E-eTM1432水稻，得到515bp的 为阳性T0代转0E-eTM1432。
[0069] 将上述PCR鉴定均为阳性的植株命名为阳性TO代转0E-miR1432水稻和阳性TO 代转0E-eTM1432水稻。
[0070] 使用复能基因的miRNA检测试剂盒（All-in-One?miRNAqRT-PCRDetection Kit，购自GeneCopoeia)，使用miR1432 特异引物miR1432-qs(ATCAGGAGAGATGACACCGAC)与 试剂盒里的引物按照试剂盒的方法进行定量PCR检测，发现0E-eTM1432水稻中miR1432表 达显著下降（图2)。
[0071] 6、功能验证
[0072] 将阳性T0 代转 0E-miR1432 水稻 1 (0E-miR1432-l)、阳性T0 代转 0E-miR1432 水稻 2 (0E-miR1432-3)、阳性TO代转 0E-eTM1432 水稻 1 (0E-eTM1432-l)和阳性TO代转 0E-eTM1432水稻1 (0E-eTM1432-2)水培生长约15天，移栽到含有20% (质量百分含量） PEG的水培液中处理12天，而后正常培养，观察其萎蔫及复水后水稻生长情况。以野生型水 稻为对照。每个株系30株，实验重复3次，结果取平均值。
[0073] 阳性T0代转0E-miR1432水稻水培生长约15天后（图3A)，转移到含有20%PEG的 水培液中培养12天（图3B)，可以看出0E-miR1432萎蔫程度远远大于对照。而后复水，4天 时（图3C)，可以明显看出0E-miR1432存活率显著低于对照。将阳性TO代转0E-miR1432水 稻1 (0E-miR1432-l)和阳性TO代转0E-miR1432水稻2 (0E-miR1432-3)的叶皮进行了离体 叶片失水实验。取正常生长日本晴叶片和〇E_miR432的叶片，快速放于滤纸上称重M1，然后 放于室内自然晾干，并按照不同的时间间隔同时记录日本晴和〇E-miR432叶片的失水后重 量M2。每个样本取10个叶片，三个重复。通过公式，失水率=(M1-M2)/M1，计算不同时间的 失水率，结果如图3D所示，显示0E-miR1432转基因水稻的叶片失水显著快于对照。阳性T0 代转 0E-eTM1432 水稻 1 (0E-eTM1432-l)和阳性TO代转 0E-eTM1432 水稻 1 (0E-eTM1432-2) 结果如图4所示，其中，图4A为20%PEG处理之后复水2d结果，可以看出，0E-eTM1432长 势明显好于对照，图4B为离体叶片失水实验，可以看出，0E-eTM1432的失水显著慢于对照。
[0074] 通过以上实验证明，降低miR1432表达可以增强水稻抗旱能力。
【主权项】
1. miR1432或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组 菌或重组病毒在调控植物抗旱性中的应用； 所述miR1432为序列表中序列1所示的核酸编码的RNA。 2. miR1432或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组 菌或重组病毒在培育高抗旱性植物中的应用。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于： 所述miR1432编码基因的核苷酸序列为序列1 ; 所述植物为单子叶植物或双子叶植物； 或所述植物为单子叶植物，所述双子叶植物为水稻。4. 抑制miR1432表达的物质在调控植物抗旱性中的应用。5. 抑制miR1432表达的物质在提高植物抗旱性中的应用。6. 根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述抑制miR1432表达的物质为如 下1)或2): 1) 核苷酸序列为序列3的DNA片段； 2) 含有1)的组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。7. 根据权利要求4-6中任一所述的应用，其特征在于： 所述植物为单子叶植物或双子叶植物； 或所述植物为单子叶植物，所述双子叶植物为水稻。8. -种培育抗旱性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中 miR1432表达，得到转基因植物； 所述转基因植物的抗旱性高于所述目的植物。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述抑制目的植物中miR1432表达为将 抑制miR1432表达的物质导入目的植物； 所述抑制miR1432表达的物质为如下1)或2): 1) 核苷酸序列为序列3的DNA片段； 2) 含有1)的组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒； 所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物； 或所述植物为单子叶植物，所述双子叶植物为水稻。10. -种抑制miR1432表达的物质，为如下1)或2): 1) 核苷酸序列为序列3的DNA片段； 2) 含有1)的组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
【专利摘要】本发明公开了miR1432在水稻干旱胁迫中的应用。本发明提供了miR1432或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在调控植物抗旱性中的应用；所述miR1432的核苷酸序列为序列表中序列1。本发明的实验证明，本发明通过干扰野生型水稻中的miR1432的表达，得到转基因水稻，其与未干扰的野生型水稻相比，抗干旱胁迫。因此，miR1432可用于水稻高抗旱育种，丰富现有的水稻育种材料的遗传多样性。
【IPC分类】C12N1/21, A01H5/00, C12N15/113, C12N7/01, C12N15/82
【公开号】CN105274113
【申请号】CN201510817378
【发明人】王秀杰, 王猛, 储成才, 方军, 曹守云
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月23日