4连接酶连接，得到目的质粒，然后鉴 定插入正反向后，将正向插入的阳性克隆质粒进行PCR和测序验证。PCUM01301载体为图 2所示，它是在pCAMBIA1301载体的基础上接了一个玉米泛素启动子（组成型高表达启动 子，化ipromoter),将组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704(如SEQIDNO. 1的第93位到1964 位碱基所示）接在此启动子后面，构建成组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704超表达载体，将 此重组载体命名为pCUbi01301-0sHDA704。
[0038] 2.重组质粒pCUbiO1301-0sHDA704 转化到农杆菌EHA105
[0039] 取1y1重组质粒表达载体PCUM01301-化HDA704与农杆菌EHA105感受态细胞混 匀，冰上放置30min。然后液氮速冻Imin后，迅速转到37°C放置5min。加800y1无抗生素 的YM培养基，在28°C中，100RPM转速中培养2-化。将培养物涂到25血YM平板，YM培养基 中含卡那霉素和硫酸链霉素，浓度都为50mg/L。将平板倒置放在28°C的培养箱中培养，直 至菌落长出（约2天）。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，菌落鉴定的PCR引物为HDA7040X-F 和HDA7040X-R。选取转入了超表达载体pCUbiO1301-0SHDA704的农杆菌EHA105克隆作为 阳性克隆。
[0040] 3.农杆菌介导的水稻遗传转化
[0041] (1)水稻成熟胚的诱导
[0042] 水稻成熟种子去壳后，用70%己醇浸泡lmin，0. 1%升隶浸泡15min，再用无菌水 清洗4次，种子放在无菌滤纸上惊干后，接种在诱导培养基上，26°C暗培养。约10-15天后， 切去胚根和胚乳，转接到继代培养基上，26°C暗培养。两周后继代培养一次，挑选适合大小、 紧密和色泽淡黄的愈伤组织预培养3天。
[0043] (2化HA105农杆菌的培养
[0044] 将含有超表达载体pCUbiO1301-0SHDA704的农杆菌EHA105在含有50mg/LKan 和50mg/LStr的YM平板上划线，28°C黑暗培养3天，挑取单克隆于加有同样抗生素的5ml 液体YM中培养12~2化，然后W1 ;30的比例于同样的液体YM(30ml)中进行扩大培养4~ 化，550化pm离屯、lOmin后收集菌液，用液体AAM培养基（内含己酷了香酬（As)，浓度为100 微摩尔每升）重新悬浮（0D600约为0. 5)，置于28°C摇床轻微振荡培养15-30min，该农杆菌 悬浮液即可用于转化水稻愈伤。
[0045] (3)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养
[0046] 挑选状态较好（预培养3天、色泽淡黄）的颗粒状愈伤组织放入50ml无菌=角瓶 中，加入准备好的农杆菌悬浮液，静置培养20min，每隔5min轻轻摇一下S角瓶。倒掉菌液， 将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基 上，22°C黑暗培养3天。
[0047] (4)抗性愈伤组织的筛选
[0048] 将共培养3天后的愈伤组织放在含有500mg/L的头抱霉素（Cef)的灭菌水中清 洗，每次4-5min，共4-5次。然后将愈伤组织置于灭菌过的滤纸上吸干水分。将干燥后的愈 伤组织放在含有50mg/L潮霉素（Hyg)和500mg/L的头抱霉素（Cef)的筛选培养基上，26°C 暗培养2周，转到新配制的筛选培养基上继续筛选2周（大部分愈伤组织在筛选后10天左 右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织）。
[0049] (5)抗性愈伤组织的分化
[0化0] 从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选一定大小、乳黄色致密的抗性愈伤 组织转至含有50mg/LHyg和500mg/LCef的预分化培养基上暗培养7天，然后转至分化培 养基上在1化光/她黑暗的光周期条件下培养，温度为26°C，光照强度为lOOOOlux，一般经 过6-10天就会有绿点出现，20-30天后进一步分化出小苗。
[0051] (6)生根、壮苗和移栽
[0化2] 当抗性愈伤组织分化的芽长至约8厘米左右时，将小苗移到生根培养基上，培养 两周左右。选择高约10厘米、根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入±。
[005引 （7)GUS染色检测转基因阳性植株
[0化4] 将转化得到的苗进行GUS染色。染色后为藍色的为转基因阳性植株，反之为阴性 植株。
[0化5] 4.转基因植株的分子鉴定
[0056] (1)转基因阳性植株的初步分子鉴定；DNA的提取采用CTAB的方法，W转基因植株 的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增引物为HDA7040X-F和HDA7040X-R，用1 %琼脂糖 凝胶电泳进行检测。如图3所示；其中M为Marker2000 ;2和10为转基因阴性植株；1，3， 4，5，6，7，8和9和为阳性植株。结果表明，pCUbi01301 -化HDA704重组质粒已经插入到水稻 基因组中，得到转组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704水稻。
[0化7] (2)超表达转基因植株目的基因化HDA704的表达量鉴定：选取5个转基因阳性植 株和野生型植株，取叶片为材料提取RNA，逆转录成cDNA后用引物地DA704-F和地DA704-R扩增化HDA704。结果如图4所示，在转基因阳性植株中组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704的 表达水平都有不同程度的提高，表明组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704超表达转基因体系 成功，转化所得的化HDA704转基因材料可用于后续的实验。
[005引实施例4 ;转基因植株抗旱抗盐性鉴定 [0化9] 1.种子萌发期对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性
[0060] 每个处理选取30粒饱满的种子，3个生物学重复。将种子去壳后用75%己醇浸泡 Imin后，用0. 1%升隶浸泡15min(每5min振荡一次），后用无菌水清洗3-4次，在无菌的滤 纸上惊干后转接到含有相应胁迫处理的培养基上，在规定的时间点统计萌发率。如图5所 示，在没有胁迫处理下转基因阳性植株的（组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704超表达）种子 在前60个小时萌发速率比野生型稍快，用5^1484、15〇1111化(：1和15%?66处理后转基因 阳性植株的（组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704超表达）种子的萌发速率显著地高于野生 型。表明，超表达组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704后，在种子萌发期增强了对盐胁迫和干 旱胁迫的耐受性。
[0061] 2.幼苗对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性
[0062] 组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704超表达转基因株系幼苗干旱胁迫生长实验结果 表明；标准营养液中生长两周的幼苗在含15%PEG6000的营养液中模拟干旱处理3天后， 移到水稻营养液中恢复培养7天，组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704超表达转基因株系的存 活率明显比野生型高，如图6所示。两周的幼苗在含150mM化C1营养液中处理3天后，移 到水稻营养液中恢复培养7天，组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704超表达转基因株系的存活 率明显也比野生型高，如图7所示。因此，与野生型植株相比，超表达组蛋白脱己酷化酶基 因化HDA704基因后能够显著提高水稻抵御高盐和干旱胁迫的能力。
[0063] 3.幼苗抗旱性测定
[0064] 用标准营养液水培水稻至两周，取苗的地上部分，每个株系取30棵，设置3个生物 学重复。将所取样品在培养室中自然放置，每隔30min称取一次重量，在210min内连续称 量7次。拿第一次的重量减去相应时间点称取的重量为该个时间点的失水量。称量完后在 l〇5°C的烘箱里放置化，称重，用失水前的重量减去干重即为植株的含水量。相对失水量为 各时间点的失水量除W含水量的百分比。组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704超表达转基因 株系的失水速率明显低于野生型植株，如图8所示，说明转基因植株保水能力较好，抗旱能 力比野生型强。
【主权项】
1. 一种组蛋白脱乙酰化酶0sHDA704,其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
2. -种编码权利要求1所述的组蛋白脱乙酰化酶0sHDA704的组蛋白脱乙酰化酶基因 0sHDA704,其特征在于，其序列如SEQIDNO. 1的第93位到1964位碱基所示。
3. -种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的组蛋白脱乙酰化酶基因 0sHDA704〇
4. 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为任意一种可 用于农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹攻击的载体。
5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pCAMBIA系列 载体、pBI系列载体、pBin系列载体或Gateway?系列载体。
6. 权利要求2所述的组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA704在增强植物耐盐和抗旱中的应 用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用为在培育耐盐和抗旱植物品 种中的应用。
8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用是将所述的组蛋白脱乙酰化 酶基因0sHDA704导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成 植株，使组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA704在植物中表达，得到耐盐和抗旱的转基因植物。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA704 是通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官的。
10. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物为水稻。
【专利摘要】本发明公开了一种组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用，属于基因工程技术领域。本发明从水稻(Oryza Sativa L.)中克隆得到了组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示第93位到1964位碱基；编码组蛋白脱乙酰化酶OsHDA704，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因属于水稻组蛋白脱乙酰化酶家族RPD3/HDA1亚家族，其作为正调控因子参与了水稻对高盐和干旱胁迫的应答过程。通过转基因及功能鉴定证实超量表达OsHDA704能提高水稻对高盐和干旱的抗性，OsHDA704基因在培育抗逆植物尤其是水稻新品种方面具有非常重要的理论及应用价值。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-82, C12N15-55, C12N9-80
【公开号】CN104774826
【申请号】CN201510124763
【发明人】段俊, 赵金会, 张建霞, 吴坤林, 张新华
【申请人】中国科学院华南植物园
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年3月20日