催化天麻素合成的糖基转移酶及编码该酶的基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体地，设及两种催化天麻素合成的糖基转移酶 及应用。
【背景技术】
[0002] 天麻是兰科植物天麻（GastrodiaelataB1.)的茎块，为常用名贵中药。植物天麻 生于疏林下，林中空地、林缘，灌丛边缘，海拔400-3200米，已被世界自然保护联盟（IUCN) 评为易危物种，并被列入《溯危野生动植物物种国际贸易公约KCITE巧的附录II中，同时也 被列入中国《国家重点保护野生植物名录（第二批）》中，为II级保护植物。其根茎入药用 W治疗头晕目眩、肢体麻木、小儿惊风癒痛抽摇等症。另据研究表明，天麻还具有刺激神经 系统、健脑、延缓衰老、增强机体免疫力和预防骨质疏松等作用。天麻的主要药用活性成分 是天麻素及其巧元对哲基节醇等。近年来，W天麻素作为主要原料生产的药剂和食品等产 品种类越来越多，其巧元对哲基节醇是一种具有重要工业价值的酪类化合物，对哲基节醇 及其衍生物是多种有机化合物的合成前体。人们对天麻素及其巧元对哲基节醇的关注程度 不断提高。除天麻素和对哲基节醇外，天麻植物中还含有其它一些化学物质，例如，对哲基 苯甲醒。对哲基苯甲醒主要用于医药工业和香料工业的重要中间体，目前工业生产主要有 苯酪、对甲酪、对硝基甲苯等原料路线。
[0003] 天麻素（Gastrodin, GA巧具有W下特征：化学名称为4-化y化oxymethyl)地en}d beta-D-glucopyranoside，分子式为。3也〇7,分子量为 286.1〇53, CAS号为624"-27-8， 结构式为'其巧元对哲基节醇（4-Hy化oxybenzylalcohol)具有W下特 征；化学名称为p-Hy化oxybenzylalcohol,分子式为CyHs化，分子量为124. 0524,CAS号为 623-05-2,结构式为HO--严
[0004] 目前，天麻素的生产主要是通过化学合成及对天麻植株进行萃取。化学合成法从 前体开始需要多步反应，且副产物多、反应专一性差，另外该过程中需要使用毒性较强的 漠素、红磯等物质造成了严重的=废问题；植株萃取法存在含量太低，资源浪费、成本高、 破坏生态环境等缺陷，比如西藏波密县仿野生种植天麻的天麻素含量在0. 41-2. 28g/kg，其 平均含量为0.88g/kg，而野生天麻的天麻素含量不到其四分之一。除化学合成和植株萃取 夕F，微生物转化及组织培养生产天麻素也是研究热点。
[0005] 周俊等W对漠代2'，3'，4'，6'-四己酷-a-D-化喃葡萄糖及对哲基苯甲醒 为原料，成功合成了天麻巧。（周俊，杨雁宾，杨崇仁，天麻的化学研究II-天麻巧及其类似 物的合成，化学学报，1980, 38 (2) : 162-166)。
[0006] 戴晓畅等W漠代己酷糖基化化合物中间体和酪性化合物为底物，探索出了一种无 需红磯和漠素合成天麻巧的方法，产率在20%左右。（戴晓畅，彭啸，吴松福，杨万松，毛宇， 天麻素及其类似酪性糖武的化学合成工艺研究，催化学报，2004, 13 (2) : 83-85)。
[0007] 朱宏莉等在38株霉菌和12株细菌中筛选出一株华根霉巧hizopuschinensis StaitoAS3. 1165)，具有将对哲基苯甲醒转化成天麻素的能力。转化过程中发挥主要作 用的是糖基化酶和还原酶；底物对哲基苯甲醒的转化率为87.6%，天麻素的得率为11%。 (朱宏莉，宋纪蓉，黄建新，张嘉，马震宇，杨明谈，微生物转化法合成天麻素，药学学报， 2006,41(11):1074-1077)〇
[0008] 蔡洁等报道了在人参毛状根中进行天麻素的生物合成，在Bg液体培养基中培养22 天的人参毛状根，添加1M对哲基节醇的生物转化，2化合成的天麻素含量占干重的6. 65%， 对哲基节醇的转化率达到84.8%。（蔡洁，家宜，华亚男，李楠，人参毛状根生物合成天麻素 转化体系的建立，植物资源与环境学报，2005, 14(2) ;29-31)。
[0009] 化学合成工艺较为成熟，但是由于重金属催化剂的添加会对环境造成较大破坏； 而不需要红磯和漠素的化学合成方法，得率较低；微生物转化效率较低，需要添加外源底 物；植物组织培养反应周期长，效价较低。至今还没有天麻素微生物从头合成的相关报道。 因此，实现天麻素的微生物体内生物全合成途径具有重要的科研价值及社会效益。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供催化天麻素合成的糖基转移酶。
[0011] 本发明的第二个目的是提供编码上述催化天麻素合成的糖基转移酶的基因。
[0012] 本发明的第S个目的是提供含有上述基因的大肠杆菌。
[0013] 本发明的第四个目的是提供催化天麻素合成的糖基转移酶的应用。
[0014] 本发明的第五个目的是提供另一种催化天麻素合成的糖基转移酶。
[0015] 本发明的第六个目的是提供编码另一种催化天麻素合成的糖基转移酶的基因。
[0016] 本发明的第走个目的是提供含有编码另一种催化天麻素合成的糖基转移酶的基 因的大肠杆菌。
[0017] 本发明的第八个目的是提供另一种催化天麻素合成的糖基转移酶的应用。
[0018] 本发明的技术方案概述如下；
[0019] 催化天麻素合成的糖基转移酶，用SEQIDNo;1所示。
[0020] 编上述催化天麻素合成的糖基转移酶的基因，用SEQIDNo;3所示。
[0021] 含有上述基因的大肠杆菌。
[0022] 催化天麻素合成的糖基转移酶在催化合成天麻素的应用。
[0023] 另一种催化天麻素合成的糖基转移酶，是用SEQIDNo;2所示。
[0024] 编码另一种催化天麻素合成的糖基转移酶的基因，是用SEQIDNo;4所示。
[00巧]含有编码另一种催化天麻素合成的糖基转移酶的基因的大肠杆菌。
[0026] 另一种催化天麻素合成的糖基转移酶在催化合成天麻素的应用。
[0027] 本发明的两种催化天麻素合成的糖基转移酶均可W催化对哲基节醇转化为天麻 素，能够显著提高天麻素的产量。
【附图说明】
[0028] 图1为菌株发酵产物W及对哲基节醇和天麻素标准品的HPLC检测结果，其中，
[0029]1是天麻素标准品，
[0030] 2是对哲基节醇标准品，
[0031] 3是菌株化21 0E3,pET28a)的发酵产物，
[0032] 4 是菌株化2UDE3，pET28a-ugt73b6)的发酵产物，
[0033] 5是菌株化21 〇)E3,祀T28a-ugt73b6Ps)的发酵产物的发酵产物，峰I为对哲基节 醇，峰II为天麻素，
[0034]6是菌株化21 〇)E3,祀T28a-ugt73b6Ps+*?)的发酵产物的发酵产物，峰I为对哲基 节醇，峰II为天麻素，
[00巧]图 2 为菌株BL21 〇)E3,祀T28a-ugt73b6Fs)、BL21 〇)E3,祀T28a-ugt73b6Fs+*)发酵 产物的对哲基节醇（峰I)天麻素（峰II)的MS图谱。
【具体实施方式】
[0036]W下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，应当理解的是，此处所描述的
【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0037] 本发明中，对表达载体的种类没有特殊要求，可W为能够在大肠杆菌中表达目的 基因的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。本领域技术人员应该理解的是，表达载 体的构建方法可W采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体 中，在此不再寶述。
[0038]W下实施例中，大肠菌株化21值日3)和大肠杆菌D册a均可市售获得，大肠菌株 BL2UDE3)用于本发明中所有基因的表达，大肠杆菌D册a用于本发明中所有基因的克隆。
[0039] 大肠杆菌表达载体祀T28a，购自Novagen，货号69864。
[0040] 下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆： 实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。
[00川实施例1
[0042]基因ugt73b6Fs、ugt73b6Fs+*? 及大肠杆菌表达载体祀T28a-ugt73b6FS、 祀T28a-ugt73b6Fs* 获得方法；
[004引对ugt73b6(SEQIDNo;5,该序列文献已报道，来源于植物库页红景 天Miodiolasachalinensis)进行error-PCR随机突变，将得到的片段酶切连 接到商业化载体祀T28a中，之后经定向进化筛选巧ichardW.Gantt,Pauline Peltier-Pain,ShanteriSingh，MaoquanZhou，andJonS.Thorson，Broadening thescopeofglycosyltr过nsfer过se-c过t过lyzedsugarnucleotidesynthesis， PNAS, 2013, 110(19):7648-7653；GavinJ.Williams,RandalD.Goff,Changsheng Zhang，andJonS.Thorson，Optimizingglycosyltransferasespecificityvia<hot spot'saturationmutagenesispresentsanewcatalystfornovobiocin glycorandomization，ChemBiol. 2008, 15(4) :393-409)，获得含突变基因ugt73b6Fs的大 肠杆菌表达载体祀T28a-ugt73b6Ps。具体的糖基转移酶ugt73b6第389位苯丙氨酸突变为 丝氨酸，得到的催化天麻素合成的糖基转移酶的氨基酸序列为SEQIDNo;1，相应的碱基由 ttc突变为tcc、其核巧酸序列为SEQIDNo;3 (该序列的最后3个核巧酸为终止密码子）。
[0044] 表达载体祀T28a-ugt73b6Fs?是由祀T28a-ugt73b6FS进行定点突变得到，点突变 的方法为本领域技术人员所公知，在此不再寶述。具体的糖基转移酶ugt73b6第264位甲硫 氨酸突变为赖氨酸、第389位苯丙氨酸突变为丝氨酸，得到的另一种催化天麻素合成的糖 基转移酶的氨基酸序列为SEQIDNo;2,相应的碱基由atg突变为aag、由ttc突变为tcc， 其核巧