专利名称：采用非均相酶催化法生产d－对羟基苯甘氨酸的方法
技术领域：
本发明属于医药原料的生产，特别是指采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法。
背景技术：
D-对羟基苯甘氨酸主要用于生产阿莫西林、头孢羟氨苄、头孢哌酮和头孢曲嗪等半合抗。采用生物法生产的技术目前报道的有“两步酶法”和“一步酶法”两种，其酶源有假单孢杆菌Pseudomonas sp.和土壤放射菌Agrobacterium radiobacter。在均相工艺中这两株菌产生的酶可以用于DL-对羟基苯海因转化水解生产D-对羟基苯甘氨酸，而在非均相工艺中凸显其催化能力的不足，转化率低且反应时间过长。上述现有技术存在着装置的生产能力严重地受到D-对羟基苯甘氨酸本身溶解度很小的限制，液-液转化溶液体积过大，产量低，能耗高的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法以解决现有均相转化工艺中存在的产量低、能耗高的问题。
本发明属于一步酶法，其技术能实现的基础是以产生海因酶的菌株Arthrobacter aurescens和热稳定性的氨甲酰胺水解酶的菌株Agrobacterium radiobacter。并利用生物发酵制备海因酶制剂和N-氨甲酰胺水解酶制剂，以下所说的酶制剂包括海因酶制剂和N-氨甲酰胺水解酶制剂。
本发明的整体技术解决方案是采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，包括如下工艺步骤(1)在酶催化反应罐中，投入DL-对羟基苯海因和溶剂，调整DL-对羟基苯海因投料量为溶剂体积的4％-28％；(2)加入酶活高于0.3U/mL的酶制剂，加入量为反应液总质量的1-12％，在pH为6.2-8.6、温度为30-44℃条件下，开始搅拌反应；
(3)取样并用高压液相色谱检测反应情况，当反应进行6-12h后，则有D-对羟基苯甘氨酸晶体开始析出，待反应体系中N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸浓度降至0.25％以下时，反应结束。
本发明的具体工艺步骤和工艺条件是步骤(1)中溶剂选用水。其中优选无氧水。
步骤(2)中酶制剂的酶活高于0.4U/mL能满足实际要求，步骤(2)中酶制剂溶液的酶活高于0.55U/mL是比较适宜的，其中酶制剂溶液的酶活最好为高于0.65U/mL。
步骤(3)中的取样采用间隔3-6小时取样。
步骤(2)中的搅拌转速为40-110r/min。
步骤(2)中罐内压力低于0.06Mpa。
1、转化液转化率的测定及计算这里的转化率指的是将D，L-对羟基苯海因转化成D-对羟基苯甘氨酸的百分数。测定采用高压液相色谱法。
具体测定步骤为待转化反应完成后取10ml转化液于离心试管中，在3500-4000r/min的离心机上离心30min。待离心结束后取上清液1ml用事先配制好的流动相稀释200倍用高压液相色谱仪进行测量，并根据测量结果计算峰峰面积及转化率。
转化率的计算公式如下所示Y＝X1/(X1+X2+----+Xn)×100％式中，Y为样品的转化率；X1为样品中的D-对羟基苯甘氨酸的峰面积；X2、....Xn分别为样品中其它成分的峰面积。
2、根据转化的反应原理，在高浓度转化的过程中有氨气、二氧化碳及D-对羟基苯甘氨酸的产成，因此pH在转化过程中会呈现有规律的变化。在进入反应的后期，pH快速升高，从而强烈地抑制了N-氨甲酰胺水解酶的催化活性，导致反应速度减慢，甚至停止。
3、pH值对转化率的影响根据取样检测结果，pH选用6.2-8.6是较为适宜的，且在该pH值下反应过程较短。pH增大或减小后，转化液达到相同转化率所需时间都显著变长。
4、D，L-对羟基苯海因的加入量是一个较为重要的技术参数，当其投料量高于4％时，由于反应过程中生成的产物部分以晶体的方式析出，因此称为“非均相转化”，但是当其投料量过高，则会影响电机的转速，严重的甚至导致电机停转，影响物料的传质过程。所以，DL-对羟基苯海因投料量以不超过28％较为适宜。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于在水系中实现了微生物催化转化从液——液到固——固工艺的革新，与现有一步酶法结合后形成了D-对羟基苯甘氨酸的全新生产技术；产率达到78-80％(w/w)，能耗降低40％以上，节水效果明显，产品一次合格率达到99％以上，达到了清洁生产的要求。
具体实施例方式
实施例1在300L的酶催化反应罐中，先加入无氧水210kg，然后投入D，L-对羟基苯海因27-28kg。在搅拌转速45r/min的条件下，再加入湿的酶活为0.5U/mL的酶制剂15kg。蒸汽加热、控制温度为32-44℃、罐内压力不超过0.05Mpa的条件下，搅拌反应。间隔3-6h取样并用高压液相色谱检测反应情况，当反应进行6-12h后，则有D-对羟基苯甘氨酸晶体开始析出，待反应体系中N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸0.25％以下时，反应基本结束，转化率在99％以上。分离获得的粗晶经重结晶得到纯产品约13.5kg，溶液经提炼，得到成品约9kg，合计产率在80％以上。
实施例2在300L的酶催化反应罐中，加入无氧水210kg，然后投入对羟基苯海因32-38kg。在搅拌转速65r/min的条件下，加入湿的酶活为0.62U/mL的酶制剂约15kg。加热、控制温度为32-44℃条件下搅拌反应。间隔3-6h取样用高压液相色谱检测反应情况，当反应进行6-8h后，则有D-对羟基苯甘氨酸晶体开始析出。待反应体系中N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸0.25％以下时，反应基本结束，转化率在99％以上。粗晶和溶液部分提炼后得到产品，合计收率在79％以上。
权利要求
1.采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于它包括如下工艺步骤(1)在酶催化反应罐中，投入DL-对羟基苯海因和溶剂，调整DL-对羟基苯海因投料量为溶剂体积的4％-28％；(2)加入酶活高于0.3U/mL的酶制剂，加入量为反应液总质量的1-12％，在pH为6.2-8.6、温度为30-44℃条件下，开始搅拌反应；(3)取样并用高压液相色谱检测反应情况，当反应进行6-12h后，则有D-对羟基苯甘氨酸晶体开始析出，待反应体系中N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸浓度降至0.25％以下时，反应结束。
2.根据权利要求1所述的采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步骤(1)中溶剂选用水。
3.根据权利要求1所述的采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步骤(2)中酶制剂的酶活为高于0.55U/mL。
4.根据权利要求1所述的采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步骤(3)中的取样采用间隔3-6小时取样。
5.根据权利要求1所述的采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步骤(2)中的搅拌转速为40-110r/min。
6.根据权利要求1或5所述的采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步骤(2)中罐内压力低于0.06Mpa。
7.根据权利要求1或2所述的采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步骤(1)中溶剂选用无氧水。
8.根据权利要求1或3所述的采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步骤(2)中酶制剂溶液的酶活为高于0.65U/mL。
全文摘要
本发明属于医药原料的生产，特别是指采用非均相酶催化法生产D－对羟基苯甘氨酸的方法。在酶催化反应罐中，投入DL－对羟基苯海因和溶剂，调整DL－对羟基苯海因投料量为溶剂体积的4％－28％；加入为反应液总量的1－12％且酶活高于0.3U/mL的酶制剂，在pH为6.2－8.6、温度为30－44℃条件下搅拌反应；取样并用高压液相色谱检测反应，反应进行6－12h后，则有D－对羟基苯甘氨酸晶体开始析出，待反应体系中N－氨甲酰对羟基苯甘氨酸浓度降至0.25％以下时，反应结束。本发明解决了现有技术存在的溶液体积过大，产量低，能耗高的问题。具有在水系中实现了微生物催化转化从液——液到固——固工艺的革新，与现有一步酶法结合后形成了D－对羟基苯甘氨酸的全新生产技术；产率高，能耗低，合格率达99％以上等优点。
文档编号C12P13/00GK1928103SQ200610048209
公开日2007年3月14日 申请日期2006年8月30日 优先权日2006年8月30日
发明者刘守信, 崔哲锋, 周志辉, 付建忠 申请人:石家庄经济技术开发区中天化工有限责任公司