一种右旋糖酐酶冻干粉的工业化生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种右旋糖酢酶冻干粉的工业化生产方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 右旋糖酢酶是一种将右旋的高分子糖酢催化降解为低分子量多糖的酶。该酶及其 催化产物在医药、食品、化工等工业领域具有重要的应用价值与广泛的工业用途。如制药行 业用右旋糖酢酶制备中、低、小分子量的右旋糖酢;制糖工业生产中用于提高收率及产品质 量;用于離齿的防治及離齿疫苗的开发;如食品添加剂行业;如在人们使用的牙膏添加保护 牙齿等;酶催化反应条件单一、溫和、能源消耗少等特点。
[0003] 众多微生物如细丽毛壳、青酶、曲霉、链球菌、申克抱子丝菌、镶刀霉菌、口腔拟杆 菌等都可产右旋糖酢酶。目前，商品化的右旋糖酶主要是从自然界中筛选自身产右旋糖酢 酶的细菌或真菌，进而通过各种诱变方法选育高产右旋糖酢酶、性状优良的突变株。此外， 培育基因工程菌生产右旋糖酢酶也是极具发展前景的路线。相对国外而言，我国关于重组 右旋糖酢酶的研究较少。近年来，甲醇诱导型毕赤酵母工程菌产外源右旋糖酢酶是研究右 旋糖酢酶的重点。Roca等通过化发酵罐培养获得了酶活为3000U/mL的右旋糖酢酶，化en等 用化发酵罐培养获得了 83.9U/mL的酶活。然而，通过基因工程获得的菌株，由于后期质粒的 丢失，因此，菌株不稳定。
【发明内容】
[0004] 针对上述问题，本发明提供了一种右旋糖酢酶冻干粉的工业化生产方法。本发明 右旋糖酢酶冻干粉的生产菌为化35-3,菌种从广西北海甘薦田的±壤中分离获得。所述菌 株化35-3的菌种保藏编号为CGMCC No. 11945;保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中屯、;保藏日期为2015年12月28日；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，分类命名为细丽毛壳化aetomi皿gracile。
[0005] -种右旋糖酢酶冻干粉的工业化生产方法，步骤如下：
[0006] (1)-代斜面的制备
[0007] 将菌株接种到一代斜面培养基上进行一代斜面培养，在28°C，湿度为40-60%的条 件下培养6-7天；
[000引（2)二代斜面的制备
[0009] 将一代斜面培养基上活化的菌株接种到二代斜面培养基上进行二代斜面培养，在 28°C，湿度为40-60%的条件下培养6-7天；
[0010] (3)种子培养
[0011] 将二代斜面培养的菌株制作菌悬液，按1.5-2% (体积比）的量接种入种子培养基 中，开启揽拌转速80转/min、在27-29 °C条件下培养30-4化;种子培养30-4化时，pH为3.65-4.30,单位酶活为8-12u/mL，菌种的质量浓度大于15%，总糖含量（质量浓度）大于等于 0.15%。
[001^ (4)发酵培养
[0013]将种子液按1.5-2 % (体积比）的量接种入发酵培养基中，在27-29°C，转速为80转/ min的条件下培养85-lOOh;培养过程中菌种的生长速率小于lOg/h。
[0014] 培养基
[0015] 一代斜面培养基:薦糖1.5g、马铃馨20g、琼脂2g，加水定容至lOOmL。
[0016] 二代斜面培养基:薦糖1.5g、马铃馨20g、琼脂2g，加水定容至lOOmL。
[0017] 种子培养基：酵母浸粉5-lOg/L，憐酸氨二钟2-4g/L，硫酸儀0.2-0.5g/L，氯化钟 0.1-0.3g/L，右旋糖酢大分子1000 10-15g/L，硫酸亚铁0.005-0.0 lg/L，甜菜碱消沫剂 0.0 Ol-0.005g/L，憐酸氨二钢0.005-0.0 lg/L，其余为自来水。
[0018] 发酵培养基:酵母浸粉10-15g/L，憐酸氨二钟2-4g/L，硫酸儀0.2-0.5g/L，氯化钟 0.1-0.3g/L，右旋糖酢大分子1000 10-15g/L，硫酸亚铁0.005-0.0 lg/L，甜菜碱消沫剂 0.0 l-0.05g/L，憐酸氨二钢0.005-0.0 lg/L，其余为自来水。
[0019] 本发明中酵母浸粉购自安琪酵母股份有限公司，批号2014110603A9，FM902型酵母 浸粉。
[0020] (5)发酵培养结束，检测发酵液的单位酶活，利用蒸汽通过盘管将发酵液加溫到 60°C，进行灭活；
[0021] (6)经过灭活的发酵液，通过0.5mm孔板过滤器;主要是去除发酵液中颗粒状杂质 或发酵过程中可能带入的异物，过滤液进入发酵液储罐。
[0022] (7)发酵液经过0.5mm孔板过滤器过滤后，再通过带式过滤机，将95% W上的菌体 进行截留。
[0023] (8)料液经过带式过滤机后送入超滤膜循环罐内的物料通过膜的保安过滤器(主 要防止异物进入膜系统，造成膜的损伤），进入超滤膜，去除分子量大于200道尔顿的物质， 接着清液进入纳滤膜储罐。
[0024] (9)在纳滤膜储罐中料液通过膜的保安过滤器(主要防止异物进入膜系统，造成膜 的损伤），进入纳滤膜去除分子量小于20道尔顿的物质，物料进入纳滤液储罐；
[0025] (10)在纳滤液储罐中的料液经过0.45um液体过滤器、0.22um液体过滤器两组除菌 过滤器进行除菌过滤，料液进入冻干机的冻干盘；
[0026] (11)用螺杆真空冷冻干燥机冻干机进行冻干、升华干燥处理。
[0027] 冻干机装入288个300mm X 300mm X 12mm的冻干盘;每个装量的厚度为9.5 ± 0.5mm， 总装量在24化；
[00%]冻干时的参数设定为：
[0029] 溫度降至负46°C时开始计算冻干时间，控制负47± TC维持15-16小时；结束后将 溫度升至负30.5±0.5°(：，维持150-180111111;再次将溫度升高到负20.5±0.5°(：，维持120-150min;后将溫度升至负10.5±0.5°C，维持120-150min;再次将溫度升高到负0.5 ±0.5°C， 维持120min;再次将溫度升高到9.5 ± 0.5°C，维持120-150min;再次将溫度升高到负19.5 ± 0.5°C，维持ISOmin;再次将溫度升高到负29.5±0.5°C，维持13-14小时;升华完毕停机出 料。
[0030] (12)收集的物料进入500L无菌药品混合机，开机120min进行混合；
[0031] (13)用真空包装机进行包装，得到右旋糖酢酶冻干粉。
[0032] 本发明与现有技术相比具有W下优点：
[0033] 本发明菌株化35-3发酵过程中比较稳定，产酶快，且制备的右旋糖酢酶活力高。本 发明中右旋糖酢酶的酶活总收率达到80-83%之间，冻干粉的酶活单位大约在10万-15万 之间，实现了右旋糖酢酶大工业化的生产。
【附图说明】
[0034] 图1是批号为20150505的冻干粉的检验报告书；
[0035] 图2是批号为20150506的冻干粉的检验报告书；
[0036] 图3是批号为20150703的冻干粉的检验报告书。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应 该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可W对本发明技术方案的细节和形式进行修 改或替换，但运些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0038] 本发明生产菌为化35-3,菌种保藏编号为CGMCC No. 11945;保藏单位为中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、;保藏日期为2015年12月28日；保藏地址为北京市 朝阳区北辰西路1号院3号。
[0039] 将本发明生产菌，进行一、二代斜面培养后，进行下一步培养。
[0040] 实施例1利用本发明生产菌GL35-3进行发酵制备右旋糖酢酶
[0041 ] (1)种子培养(流水号201-20150505):按照消后45化配料
[0042]
[0043] 用饱和蒸汽进行消毒，灭菌后体积44化，降溫到28°C，按2% (体积比）接入二代斜 面培养后悬浮液，开启揽拌转速80转/min、27°C-29°C条件进行下，培养至40h;检测种子