将脐带间充质干细胞诱导分化成γ-氨基丁酸能神经元的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及神经生物学领域，特别涉及一种将厮带间充质干细胞诱导分化成Y-氨基下酸能神经元的方法，本发明还涉及培养得到的神经细胞。
【背景技术】
[0002] 自2000年化ices等报道厮带血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞W来， 因厮带血间充质干细胞的多向分化潜能，免疫调节作用和无伦理问题等优点，备受研究者 的关注。随后，有学者分别报道了厮带血间充质干细胞在体外可诱导表达神经元标志物和 神经胶质细胞标志物。目前人们已经可W成功地体外分离培养厮带血间充质干细胞，并且 对其生物学特性、表面标志和免疫原性有了进一步的了解。近年来成功地诱导厮带血间充 质干细胞分化为骨、脂肪、软骨、肝脏及神经等成体细胞，展示了厮带血间充质干细胞的无 限分化潜能和广阔的应用前景，从而为体外诱导厮带血间充质干细胞分化各种成体细胞和 各种疾病的治疗提供了新的思路。
[0003]厮带间充质干细胞（MSC)是中胚层起源的，能够进行自我更新，并具备向成骨、软 骨和脂肪H种中胚层系细胞分化潜能的一种成体干细胞。近年来研究发现MSC在中胚层之 夕F，还可W跨胚层进行转分化，如分化成外胚层系的神经细胞和上皮细胞W及内胚层系的 肝细胞和膜腺细胞。因为MSC来源广泛，易于分离培养，免疫原性较低，且不存在胚胎干细 胞所面临的伦理学问题，该使其在再生医学方面的应用具备了其他干细胞所没有的优势。 中枢神经系统的神经退行性疾病如帕金森氏综合征W及外部创伤造成的神经损伤等长期 困扰人类的问题也因此将有更为现实可行的解决之道。
[0004]CN104004713A公开了一种将厮带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法，采用 预诱导和诱导二步结合法，并配制了优化的预诱导培养液和诱导培养液，通过该诱导方式， 诱导周期短、细胞分化均一度高，而且电生理检测发现该神经细胞具有诱导放电功能，成功 得到诱导的神经细胞。
[0005]CN103585177A公开了间充质干细胞和基因修饰的间充质干细胞的用途，特别是间 充质干细胞和基因修饰的间充质干细胞在制备用于治疗牙周病、修复牙周骨组织或软组织 缺损和/或促进牙周组织再生的产品中的用途，还涉及包含间充质干细胞和/或基因修饰 的间充质干细胞的组合物和细胞膜片。
[0006]CN103695369A公开了一种厮带间充质干细胞体外培养和扩增方法，其步骤如下： 先将清洗液清洗厮带并破碎，然后加入等体积的0. 〇5w/v%胶原酶于37C消化后，清洗3次 W上，而得厮带间充质细胞。用不含血清的a-MEM培养基重息细胞，加入经纯化的CD271 - 抗，避光赔育，之后用磯酸缓冲液清洗，继续用不含血清的a-MEM培养基重息细胞，加入二 抗并赔育，再次用磯酸缓冲液液洗，并用不含血清的a-MEM培养基重息细胞，W流式细胞 仪无菌分选，将所得到CD271+亚群细胞接种，加入浓度lOv/v%的自体厮带血血清，于37C、 5%C02扩增培养6天。
[0007]CN103031275A公开了一种厮带间充质干细胞扣C-MSCs)分化为神经干细胞的诱 导方法，所述诱导方法包括如下步骤；UC-MSCs的分离、原代培养，UC-MSCs的传代培养与扩 增，UC-MSCs体外诱导转化为神经干细胞，神经干细胞的分化培养W及免疫英光法检测，该 诱导方法应用全反式维甲酸联合碱性成纤维细胞生长因子化FGF)、表皮生长因子巧G巧诱 导厮带间充质干细胞分化为神经干细胞，经分裂增殖多次传代后仍然保持较强的活力。
[0008]CN102250829A公开了一种人厮带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法，包 括W细胞爬片技术提取人厮带间充质干细胞进行分离培养，并加入表皮生长因子、地塞米 松、肝细胞生长因子、抑瘤素将所述细胞分阶段定向诱导分化为肝细胞。
[0009]CN101914493A公开了一种厮带间充质干细胞分化为神经细胞的诱导方法，其特征 是采用W下步骤：（1)将厮带间充质干细胞在MSC培养基中培养至铺满培养皿；（2)取稳定 传代的间充质干细胞在铺有胞外基质的培养皿中WMSC培养基培养至70%汇合；（3) 70% 汇合的间充质干细胞依次经过添加有如下因子的四种诱导培养基培养，第一种诱导培养 基；添加5-氮胞巧和H醜叠氮脂蛋白，第二种诱导培养基：添加碱性成纤维细胞生长因子 和Noggin蛋白，第H种诱导培养基：添加碱性成纤维细胞生长因子、维甲酸、成纤维细胞生 长因子8和Wnt3a蛋白，第四种诱导培养基：添加骨成形蛋白4、S化蛋白、维甲酸、神经生长 因子和脑源性神经营养因子。
[0010]CN101831401A公开了一种体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，在添 加了bFGF、成纤维细胞生长因子FGF8、S皿和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培养体系 中预诱导间充质干细胞；在添加了bFGF、FGF8和甜H的无血清neurobasal-medium培养体 系中将预诱导的细胞定向分化为神经干细胞。
[0011]CN103146642A公开了一种定向诱导干细胞分化的方法，包括如下步骤：将离体的 诱导细胞接种并吸附于聚碳酸醋膜的下表面，将离体的间充质干细胞接种至所述聚碳酸醋 膜的上表面，然后将所述诱导细胞和所述间充质干细胞共培养，促使所述间充质干细胞分 化为目标细胞；所述间充质干细胞和所述诱导细胞均不能通过所述聚碳酸醋膜的孔径。
[0012]CN102191217A公开了一种诱导厮带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法，该方 法将厮带间充质干细胞与许胚细胞用0. 4ym孔径的Transwell小室隔离共培养，所用培 养液为许胚细胞培养液；每H天全量或者半量换一次液，培养两周即可得到类神经细胞。
[0013]MSC定向诱导分化为神经细胞的实验研究有少数研究机构正在进行，而且现有报 道的诱导分化方法诱导周期长，得到的神经细胞分化效率低、细胞分化均一度低。在上述现 有技术中，CN104004713A公开的方法通过该诱导方式，诱导周期短、细胞分化均一度高，而 且电生理检测发现该神经细胞具有诱导放电功能，成功得到诱导的神经细胞，是一种可行 性比较高的方法。然而，该专利文献没有公开如何有效地将MSC定向诱导分化为Y-氨基 下酸能神经元，并且如何将MSC有效地定向诱导分化为y-氨基下酸能神经元的研究在其 它现有技术中也非常少。
【发明内容】
[0014]为克服现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种将厮