一种抗人dab2ip的单克隆抗体及其细胞株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗体，具体涉及的是一种抗人肿瘤抑制因子DAB2IP的抗体。本发 明还涉及生产该单克隆抗体的细胞株及其制备方法。
【背景技术】
[0002] DAB2IP (D0C2/DAB2interaction protein)是一种新发现的肿瘤抑制基因，为 Ras GT化se-activating protein (Ras GAP)家族的新成员。它与DAB2/D0C2蛋白的N 末端相结合，是DAB2信号途径的下游效应器，而DAB2是一个重要的肿瘤抑制基因，在肿瘤 的发生中发挥重要作用，并在多种肿瘤中低或缺失表达。DAB2IP作为一种新的GWase激活 蛋白，是Ras和肿瘤坏死因子介导的调亡通路等多条信号通路中的重要环节，并且参与多 种基因表达调节W及细胞的生长调控，因而具有功能多样性。研究发现DAB2IP基因在多个 信号通路中都与肿瘤发生密切相关，通过Ras-Erk途径，Askl-化k途径和PI3K-Akt途径等 来控制细胞的增值、扩散、调亡和生存。
[0003] DAB2IP在体内的表达变化与多种肿瘤的发生发展W及转移密切相关，因而倍受人 们的关注。该基因的低表达可见于前列腺癌、乳腺癌、胃肠肿瘤、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、膀 脫移形细胞癌等多种肿瘤中。在DAB2IP与各种肿瘤的关系中，研究最早、最多的当属其与 前列腺癌发生发展的关系。化en等发现人正常前列腺上皮细胞有DAB2IP基因表达，而在前 列腺癌细胞DAB2IP基因表达缺失或下调，转染DAB2IP基因后前列腺癌细胞停止生长。还 有人发现DAB2IP基因的降低可引起前列腺上皮中致癌基因Skp2的升高，引发肿瘤生长，而 在正常的细胞中，DAB2IP基因会抑制致癌基因Skp2的表达。另外，研究表明DAB2IP基因 的表达与前列腺癌的分级和预测预后呈负相关，故将DAB21P的低表达用于前列腺癌的预 测和诊治中有重要意义。Dote等发现DAB2IP的基因沉默对胃肠癌和乳腺癌的发生起重要 作用。Yano等认为DAB2IP可作为肺癌发生的一个生物标志物。
[0004] W上研究表明该基因在多种肿瘤的发生、发展和预后等方面都发挥了举足轻重的 作用。DAB2IP可能提供预兆的生物标记和潜在的治疗癌症转移的祀点，将DAB2IP的低表达 用于癌症的早期诊断和治疗中具有很好的前景。因此有效准确的检测DAB2IP成为一项关 键的技术，而制备该蛋白特异性的单克隆抗体更成为一种迫切的需要，意义重大。
[0005] 吴建祥等公开了 "蚕豆萎慧病毒单克隆抗体研制"（浙江农业大学学 报，1999,25(2) : 147-150)，其全文引入本文作为参考。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种抗DAB2IP单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的的单 克隆抗体。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种制备上述单克隆抗体杂交瘤细胞株的方法。
[000引本发明的再一目的是提供一种上述单克隆抗体在DAB2IP检测中的应用。
[0009]本发明通过如下技术方案实现：
[0010] 一种抗DAB2IP单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中也 (CCTCC)，保藏号为CCTCCNo.C2013148,保藏时间为2013年10月23日，保藏名称为杂交瘤 细胞株DAB2IPMabl。
[0011] 经鉴定此抗体为IgGl亚类（中国典型培养物保藏中也地址；中国湖北省武汉市武 昌巧珊山武汉大学保藏中也，邮编；430072)。
[0012] 本发明还提供了一种制备上述杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，所述方法包括： 将DAB2IP基因（SEQIDNO. 1)重组表达，得到DAB2IP蛋白（SEQIDNO. 2)，利用该蛋白免 疫动物，再经细胞融合得到可W分泌DAB2IP单克隆抗体的细胞株。所述动物是能够制备抗 体的动物，优选哺乳动物，例如兔，小鼠，大鼠等。
[0013] 在一个具体的实施方案中，所述制备上述杂交瘤细胞株的方法包括，将DAB2IP基 因（SEQIDNO. 1)重组到改造过的祀T32a载体上，该载体同时含有細istag和TRXtag,并 在細istag和多克隆位点之间含有TEV酶切位点；将重组质粒在大肠杆菌化21菌株中进 行表达，所表达的蛋白为TRX-6His-DAB2IP(SEQIDNO. 2)融合蛋白，经TEV酶（S219V)切 及二次媒柱和分子筛纯化，得到纯化的DAB2IP(SEQIDNO. 1)蛋白，利用该蛋白免疫小鼠， 再经细胞融合及亚克隆化得到单克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0014] 本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
[0015] 本发明还提供了DAB2IP蛋白（SEQIDNO. 2)作为抗原的应用，并且提供了一种 DAB2IP蛋白（SEQIDNO. 2)作为抗原免疫动物得到抗体。
[0016] 本发明还提供了利用上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体或DAB2IP蛋白（SEQID NO. 2)作为抗原免疫动物得到抗体在检测人DAB2IP蛋白的应用。
[0017] 本发明还提供了用于检测人DAB2IP蛋白的试剂盒、试剂或药剂，其包括上述杂交 瘤细胞株分泌的单克隆抗体或DAB2IP蛋白（SEQIDNO. 2)作为抗原免疫动物得到抗体。
[0018] 本发明具有如下有益效果：
[0019] 本发明人发现了SEQIDNO. 2表示的DAB2IP蛋白的多肤片段(编码该多肤片段的 DNA为SEQIDNO. 1表示的序列）。本发明重组人DAB2IP(SEQIDNO. 2)蛋白作为免疫抗 原，免疫小鼠，采用细胞融合技术，通过筛选获得一株能稳定分泌抗DAB2IP的特异性单克 隆抗体(亚型鉴定为IgGl亚类）的杂交瘤细胞株(保藏号为C2013148)。经化ISA检测，该 单克隆抗体可W很特异性结合DAB2IP蛋白，且效价达到1(T8,表明制备的单克隆抗体具有 高特异性和高灵敏度。该抗体可W用于DAB2IP蛋白的检测，并且可W用于开发相关的检测 产品。
【附图说明】
[0020] 图 1 为DAB2IP的cDNA序列（SEQIDNO. 1)和氨基酸序列（SEQIDNO. 2)。
[002。 图2为DAB2IP(SEQIDNO. 1)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检巧Ij(A)及载体构 建示意图（B)。
[002引图3为DAB2IP蛋白表达与纯化的SDS-PAGE电泳检测；A;M，marker;1，TEV酶切前 即TRX+6His+DAB2IP(SEQIDNO. 1)蛋白；2，TEV酶切后即DAB2IP(SEQIDNO. 1)蛋白。
[0023]B;M，marker;1-7 经superdexS200 纯化的DAB2IP(沈QIDNO. 1)样品。
【具体实施方式】
[0024] 下面将结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】做进一步详细描述。W下实 施例将有助于说明本发明，但本领域技术人员理解，下述实施例不W任何形式限制本发明。 任何在本发明基础上做出的改进和变化，都在本发明的保护范围之内。
[0025] 1DAB2IP表达载体的构建
[0026] 1. 1DAB2IP基因片段（SEQIDNO. 1)的获得
[0027] 为了获得SEQIDNO. 1表示DAB2IP基因片段序列，根据已公布DAB2IPcDNA序列 设计一对特异性引物；正义链：5'-CGGGATCCAGGTCCTCCGGGGTCCAGC-3'（SEQIDNO. 3);反 义链；5，-ATTTGCGGCCGCTTACTGGGCATCAATGATCTTCTGTTT-3'（SEQIDNO. 4);其中正义链含 有BamHI酶切位点（GGATCC)，反义链含有Notl酶切位点（GCGGCCGC)和终止密码子（TAA)。 WDAB2IP全长cDNA为模板，用高保真酶（Primer服STAR)DM聚合酶(大连宝生物工程 (TaKaRa)有限公司产品)进行PCR扩增，模板为扩增的含DAB2IP全长cDNA的PMD18T质粒， 质粒浓度大约lOOug/ml。
[002引反应体系是：
[0029] 2XPrimeSTARGC缓冲液：25y1
[0030]dNTP(每种均 2. 5mM) : 4y1
[0031] 正义引物（lO