ym) :2y1
[003引反义引物（lOym) :2y1
[0033]模板值AB2IPcDNA50ng/y1) : 2y1
[0034] (1地2〇:14.5yl
[0035] Prime HS STAR:0. Sul
[0036] 扩增条件是：
[0037] 98°C变性 10s，
[0038] 55°C退火 15s，
[0039] 72°C延伸lm30s，
[0040] 上述条件共循环33次。
[0041] 取PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳（附图1)，将该PCR产物测序确认正确扩增了 DAB2IP基因序列。
[0042] 1. 2祀T32a-TRX-His-DAB2IP(SEQIDNO. 1)载体的构建及大肠杆菌转化
[0043] 将步骤1. 1得到的PCR产物和祀T32a载体(购自Novagen)同时进行BamHI(购自 TAKARA)和Notl(购自TAKARA)双酶切，酶切产物回收后用T4DNA连接酶(购自TAKARA)进 行连接，连接产物转化大肠杆菌D册a。随后用步骤1. 1中的特异性引物SEQIDNO. 3和 SEQIDNO. 4对用质粒提取试剂盒（OMEGA,PlasmidMiniKitI)从转化子中提取的质粒 DM(分光光度计测量浓度为5(K)ng/y1，使用时稀释至50ng/y1)进行PCR(反应体系和 扩增条件同上）W鉴定阳性转化子。提取阳性转化子的质粒进行BamHI和Notl双酶切，经 1%琼脂糖凝胶检测可W得到与目标条带大小一致的序列，经测序确认序列正确。
[0044] 将重组质粒按如下条件转化表达菌株大肠杆菌化21，得到含有 祀T32a-TRX-6化S-DAB2IP质粒的大肠杆菌化21菌株；从-80°C冰箱中取100y1感受态细 胞，置于冰上解冻。待完全解冻后，加入连接产物，轻轻吹打均匀，冰浴30min，随后42C温 浴90砂，迅速置于冰浴中冷却3-5分钟。加入800iilLB液体培养基，混匀后37°C，150巧m振荡培养比，之后涂布于含AMP抗性的平板上，37°C培养12-1化。
[0045] 1. 3化口2a-TRX-His-DAB2IP(SEQIDNO. 1)融合蛋白的诱导表达及纯化
[0046] 将含有祀T32a-TRX-6His-DAB2IP(SEQIDNO. 1)质粒的大肠杆菌化21菌株在 含0.ImM氨予青霉素（lOOmg/ml)的LB培养基（1%W/V化C1，1%W/V膜蛋白腺和0. 5%W/V酵 母提取物）中培养至0D值0. 5-0.6之间，加入诱导剂IPTG(异丙基-目-D-硫代半乳糖化 喃糖巧）至终浓度0. 3mmol/L，未加IPTG的菌液作为阴性对照。将上述菌液在16C下培养 12-1化，7000rpm离也5min收集菌体。将诱导的菌体和阴性对照菌体煮沸10分钟裂解，然 后进行SDS-PAGE电泳分析。随后，选择阳性菌株按上述条件进行大量诱导，收集菌体后在 裂解液（P服.OTris-Hc1，500mM化C1，5%甘油）中进行超声破碎(功率380W，破碎30min)，通 过媒离子亲和层析（GEHealthcare)纯化，再用TEV蛋白酶切除标签后再通过媒离子亲和 层析（同前)及分子筛（superdexS200，GEHealthcare)进行进一步纯化，用SDS-PAGE电泳 检测蛋白纯度达到90%左右（图2 )，用于后续单克隆抗体制备。
[0047] 1. 4抗人DAB2IP单克隆抗体的制备
[004引 1.4.1免疫小鼠
[0049] 将步骤1. 3中纯化的DAB2IP蛋白与完全弗氏佐剂（sigma)或不完全弗氏佐剂 (sigma)按1 : 1比例混合乳化。取5只4-6周龄的健康小鼠（BAlB/c小鼠)，用上述DAB2IP 蛋白与完全弗氏佐剂的乳化物进行腹腔免疫，每只小鼠每次50yg蛋白。8天后，用DAB2IP 蛋白与不完全弗氏佐剂的乳化物对小鼠再次进行腹腔免疫。随后每隔7-10天用不加佐剂 的DAB2IP蛋白进行一次免疫。细胞融合前4天，用DAB2IP蛋白进行加强免疫，分离小鼠脾 细胞。
[0050] 1. 4. 2细胞融合
[0051] 取SP2/0骨髓瘤细胞与步骤1. 4. 1中得到的小鼠脾细胞按常规方法进行细胞融合 后(吴建祥等，1999)，加入HAT培养基(不完全培养基中含有15-20%V/V的FBS及2%V/V的 HAT),轻轻吹打使细胞息浮，最后加入到已有饲养细胞层（小白鼠腹水巨瞻细胞）的96孔培 养板中，每孔100y1，然后置5%C02、37°C赔箱培养进行融合。融合10天后，检测培养基上 清中的特异性抗体(步骤见下文)。
[0052] 1. 4. 3阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆
[0053] 筛选过程是W步骤1. 3制备的DAB2IP蛋白作为抗原，取有杂交瘤细胞生长的培养 孔的细胞培养上清液用间接化ISA方法检测。选择其中化ISA反应为阳性的杂交瘤细胞在 HAT培养基中进行连续3次亚克隆培养，直至得到单克隆。
[0054] 1. 5单克隆抗体的Ig亚类鉴定
[00巧]取1. 4. 3种筛选的单克隆细胞培养液上清各100y1加于包被有步骤1. 3制备的DAB2IP蛋白的酶联条上，通过化ISA方法进行抗体类型鉴定，共检测6个类型，包括IgA、 IgM、IgGl、IgG2A、IgG2B和IgG3,每种类型重复检测两次，经洗涂、免疫反应、显色及终止反 应等步骤后，在化ISA读数仪（Thermo，MK3)上，双波长（630nm和450nm)处读数，结果如表 1所示，所得到的单克隆抗体为IgGl亚类。
[0056]表1 DAB2IP蛋白单克隆抗体的Ig亚类的ELISA鉴定
[0057]
[0058]
【主权项】
1. 一种制备单克隆抗体杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，所述方法包括，将DAB2IP 基因（SEQ ID NO. 1)重组表达，得到DAB2IP蛋白（SEQ ID NO. 2)，利用该蛋白免疫动物，再 经细胞融合得到可以分泌DAB2IP单克隆抗体的细胞株。
2. 权利要求1的方法，其特征在于，所述方法包括，将DAB2IP基因（SEQ ID NO. 1)重组 到改造过的pET32a载体上，该载体同时含有6His tag和TRX tag，并在6His tag和多克隆 位点之间含有TEV酶切位点；将重组质粒在大肠杆菌BL21菌株中进行表达，所表达的蛋白 为TRX-6His-DAB2IP (SEQ ID NO. 2)融合蛋白，经TEV酶切及二次镍柱和分子筛纯化，得到 纯化的DAB2IP蛋白（SEQ ID NO. 2)，利用该蛋白免疫小鼠，再经细胞融合及亚克隆化得到可 以分泌DAB2IP单克隆抗体的细胞株。
3. -种抗人肿瘤抑制因子DAB2IP单克隆抗体杂交瘤细胞株。
4. 权利要求3的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC No. C2013148。
5. 根据权利要求3或4的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述细胞株由权利要求1或2的 方法制备。
6. -种由权利要求3-5任一项所述的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
7. -种DAB2IP蛋白（SEQ ID NO. 2)作为抗原免疫动物得到的抗体。
8. 权利要求5或6所述的抗体在DAB2IP检测中的应用。
9. 一种用于检测人DAB2IP蛋白的试剂盒、试剂或药剂，其包括权利要求6或7所述的 抗体。
【专利摘要】本发明公开了一种可以抗人肿瘤抑制因子DAB2IP的单克隆抗体。本发明还公开了生产上述单克隆抗体的细胞株[CCTCC保藏号为C2013148]，由该细胞株分泌的单克隆抗体可以特异性识别人DAB2IP蛋白，从而为DAB2IP蛋白的检测及基于DAB2IP蛋白检测的应用研发奠定基础。CCTCC No:C201314820131023
【IPC分类】C07K16-18, G01N33-68, C12N5-20, C12R1-91
【公开号】CN104774810
【申请号】CN201410009739
【发明人】吴允昆, 李生平, 苏银桃, 谢佐福, 施方媛, 赵艳和, 吴秀玲, 曾占壮
【申请人】中国科学院福建物质结构研究所
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2014年1月9日