一种分离骨髓单个核细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种分离骨髓单个核细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 骨髓中单个核细胞包括造血干细胞化SC)、骨髓间充质干细（MSCs)、内皮细胞 巧PC)、和基质细胞等多种细胞的混合体。就目前而言，骨髓单个核细胞中的造血干细胞已 用于移植术并大量运用于临床治疗各种血液疾病且取得了很好的疗效。近年来大量实验研 究证明骨髓中也含有一定数量的骨髓间充质干细胞炬MSCs)，所述骨髓间充质干细胞是指 一群可向成骨细胞、成脂细胞、骨髓基质细胞、肝脏细胞、神经细胞等多种细胞分化的多潜 能组织干细胞，具有W下优点；（1)体外易获得、易分离培养，增殖快；（2)具有独特的免疫 学特性；不表达MHCII类分子和共刺激分子B7-1、B7-2,故不能刺激机体产生免疫反应； 将BMSCs输入体内之后不会被排斥，可W在宿主体内长期存活；（3)具有诱导免疫耐受的潜 力；（4)易于基因操作，组织相容性好；（5)不受伦理学限制。因此，BMSCs成为近年来细胞 治疗和细胞工程中的首选种子细胞，有着广阔的应用前景。其阳性表面标志为甜-2、CD44\ CD7r、CD90、和CD106,目前认为典型标记为CD44\CD7r。目前用于分离骨髓间充质干细胞 的方法有；贴壁筛选法、密度梯度离屯、法、流式细胞仪法和免疫磁珠法。由于流式细胞仪法 对细胞损伤较大，免疫磁珠法价格相对较高，因此现实中多采用密度梯度离屯、法和贴壁筛 选法结合使用，W提高所得BMSCS的纯度。
[0003] 但目前对骨髓单个核细胞的分离方法报道还不多，国内外常用的方法为Ficoll 一步法。由于应用此方法离屯、后部分红细胞仍悬浮于Ficoll溶液中致使收集的MNCs可能 混杂红细胞，不利于MNCs收集。因而寻找一种更为简便高效的MNCs分离培养方法具有十 分重要的现实意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，设计研发一种新型分离骨髓单个核 细胞的方法。所述方法利用明胶溶液可W破坏红细胞表面电荷而加速红细胞的沉积，对其 他主成分包括单个核细胞无影响该一点W及骨髓中单个核细胞与其他成分存在密度差异， 利用淋己细胞分离液作密度梯度离屯、时各种细胞成分按密度梯度重新分布聚集，从而获得 单个核细胞该一原理进行骨髓中单个核细胞的分离。利用本方法分离骨髓单个核细胞不会 增加MNCs的损失，且能更好地保留骨髓造血干细胞和骨髓间充质干细胞，操作简单方便， 可进行临床推广。
[0005] 本发明提供一种分离骨髓单个核细胞的方法，包括如下步骤：
[0006] 步骤1 ;取骨髓液与明胶混匀，自然沉降一段时间。
[0007] 步骤2;取步骤1中得到的明胶悬液层进行离屯、分离操作，弃去上清液，加入 PRMI1640培养液重悬细胞。
[0008] 步骤3 ;取步骤2中得到的重悬细胞液与低糖DMEM培养液混匀，缓慢加入到 Ficoll溶液表面，室温下进行离屯、分离操作。
[0009] 步骤4 ;离屯、完毕后，小屯、吸取步骤3中得到的混悬液中层云雾状细胞层，用PBS 洗漆后进行离屯、分离操作，W含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液配成一定浓度的悬液，即 得。
[0010] 进一步地说，所述步骤1中的明胶的质量百分比为3%，骨髓液与明胶的体积比为 1 : 1，沉降时间为比。
[0011] 进一步地说，所述步骤2中的离屯、分离操作参数为取350g明胶悬液层离屯、分离 8min。
[0012] 进一步地说，所述步骤3中的重悬细胞液与低糖DMEM培养液及Ficoll溶液的体 积比为1 : 1 : 2,离屯、分离操作参数为取800g上述混悬液离屯、分离20min。
[0013] 进一步地说，所述步骤4中的用PBS洗漆次数为2~3次，离屯、分离操作参数为取 上述用PBS洗漆后的混悬液中层云雾状细胞层600g离屯、分离5min，配制悬液浓度为1X1〇6 个/ml。
[0014] 本发明的有益效果在于；利用本发明的方法分离骨髓单个核细胞不会增加MNCs 的损失，且能更好地保留骨髓造血干细胞和骨髓间充质干细胞，操作简单方便，可进行临床 推广。
【具体实施方式】
[0015] 本发明提供一种分离骨髓单个核细胞的方法，包括如下步骤：
[0016] 步骤1 ;取骨髓液与明胶混匀，自然沉降一段时间。
[0017] 步骤2;取步骤1中得到的明胶悬液层进行离屯、分离操作，弃去上清液，加入 PRMI1640培养液重悬细胞。
[001引步骤3 ;取步骤2中得到的重悬细胞液与低糖DMEM培养液混匀，缓慢加入到Ficoll溶液表面，室温下进行离屯、分离操作。
[0019] 步骤4 ;离屯、完毕后，小屯、吸取步骤3中得到的混悬液中层云雾状细胞层，用PBS 洗漆后进行离屯、分离操作，W含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液配成一定浓度的悬液，即 得。
[0020] 进一步地说，所述步骤1中的明胶的质量百分比为3%，骨髓液与明胶的体积比为 1 : 1，沉降时间为比。
[0021] 进一步地说，所述步骤2中的离屯、分离操作参数为取350g明胶悬液层离屯、分离 8min。
[0022] 进一步地说，所述步骤3中的重悬细胞液与低糖DMEM培养液及Ficoll溶液的体 积比为1 : 1 : 2,离屯、分离操作参数为取800g上述混悬液离屯、分离20min。
[0023] 进一步地说，所述步骤4中的用PBS洗漆次数为2~3次，离屯、分离操作参数为取 上述用PBS洗漆后的混悬液中层云雾状细胞层600g离屯、分离5min，配制悬液浓度为1X1〇6 个 /ml。
[0024] 下文将结合具体实施例对本发明进行详细描述。应当注意的是，下述实施例中描 述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可W被相互组合从而达到 更好的技术效果。
[0025] 标本来源：选择健康志愿者30人，男15人，女15人。年龄25~45岁。无菌条件 下行骼后上崎抽取骨髓液40mU肝素抗凝。标本采集后立即分离MNCs。
[0026] 实施例1
[0027] Ficoll-步法分离MNCs
[00測取骨髓液20血与等量的低糖DMEM培养液（购买于美国invitrogen公司）混合。 混合均匀后，缓慢加入到等量的Ficoll溶液液面上。室温下进行离屯、分离（离屯、分离操作 参数为800g，20min)。离屯、分离完毕后，小屯、吸取中层云雾状细胞层，用PBS洗两次后再次 进行离屯、分离（离屯、分离操作参数为600g，5min)。化含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液 配成浓度为1X106mm0l/L的悬液备用，然后作MNCs计数及采用台盼藍拒染法检测其活力。
[0029] 实施例2
[0030] 明胶-Ficoll两步法分离MNCs
[0031] 取20血骨髓液与等量3%明胶（购买于美国SIGMA公司）混匀后自然沉降比，取 明胶悬液层进行离屯、分离（离屯、分离操作参数为350g，8min)，弃去上清液，加入PRMI1640 培养液（购买于美国Hyclone公司）重悬细胞，然后参照Ficoll-步法分离MNCs。
[0032] 实施例3
[0033] 流式细胞术检测MNCs表面CD34+和CD44 7CD7r
[0034] 取MNCs悬液2血离屯、洗漆2次，用PBS调整浓度至5X106个/ml,取上述细胞悬 液lOOuL分别加入相应抗体后，避光4°C解育30min。
[0035] 所述抗体加入量如下表：
[0036] 表1加入的抗体名称及其含量
[0037]
【主权项】
1. 一种分离骨髓单个核细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤1:取骨髓液与明胶混匀，自然沉降一段时间； 步骤2 :取步骤1中得到的明胶悬液层进行离心分离操作，弃去上清液，加入PRMI1640 培养液重悬细胞； 步骤3 :取步骤2中得到的重悬细胞液与低糖DMEM培养液混匀，缓慢加入到Ficoll溶 液表面，室温下进行离心分离操作； 步骤4 :离心完毕后，小心吸取步骤3中得到的混悬液中层云雾状细胞层，用PBS洗涤 后进行离心分离操作，以含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液配成一定浓度的悬液，即得。
2. 如权利要求1所述的一种分离骨髓单个核细胞的方法，其特征在于，所述步骤1中的 明胶的质量百分比为3%，骨髓液与明胶的体积比为1 : 1，沉降时间为lh。
3. 如权利要求1所述的一种分离骨髓单个核细胞的方法，其特征在于，所述步骤2中的 离心分离操作参数为取350g明胶悬液层离心分离8min。
4. 如权利要求1所述的一种分离骨髓单个核细胞的方法，其特征在于，所述步骤3中的 重悬细胞液与低糖DMEM培养液及Ficoll溶液的体积比为I: 1 : 2,离心分离操作参数为 取800g上述混悬液离心分离20min。
5. 如权利要求1所述的一种分离骨髓单个核细胞的方法，其特征在于，所述步骤4中的 用PBS洗涤次数为2~3次，离心分离操作参数为取上述用PBS洗涤后的混悬液中层云雾 状细胞层600g离心分离5min，配制悬液浓度为IXIO6个/ml。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离骨髓单个核细胞的方法。所述方法利用明胶溶液可以破坏红细胞表面电荷而加速红细胞的沉积，对其他主成分包括单个核细胞无影响这一点以及骨髓中单个核细胞与其他成分存在密度差异，利用淋巴细胞分离液作密度梯度离心时各种细胞成分按密度梯度重新分布聚集，从而获得单个核细胞这一原理进行骨髓中单个核细胞的分离。利用本发明的方法分离骨髓单个核细胞不会增加MNCs的损失，且能更好地保留骨髓造血干细胞和骨髓间充质干细胞，操作简单方便，可进行临床推广。
【IPC分类】C12N5-0789, C12N5-0775, C12N5-071
【公开号】CN104774805
【申请号】CN201510156170
【发明人】银广悦, 杨洪涛, 丁俊丽, 刘继勇, 周志伟, 孙岩, 徐翠玲, 武彩虹, 汪方圆, 张龙
【申请人】银广悦
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月3日