带间充质干细胞 诱导分化成Y-氨基下酸能神经元的方法，本发明还涉及培养得到的神经细胞。
[0015] 为此，本发明提供了如下方法，该方法包括如下步骤： (1) 、厮带间充质干细胞的培养和扩增；获得厮带间充质干细胞单体，将厮带间充质干 细胞单体按1-5XlOVml接种于厮带间充质干细胞培养液中，每3-8天换液传代一次，得到 培养的细胞；所述厮带间充质干细胞培养液含DMEM/F12基本培养基，2%B27(重量)，2-4mM k谷氨醜胺，ImM硫代甘油，1%非必需氨基酸(重量)，EGF20-40ng/ml，bFGF20-30ng/ml， 80-90U/ml青霉素，60-70yg/ml链霉素； (2) 、预诱导分化；将步骤（1)得到的培养细胞按1~5XlOYml的细胞密度接种进行贴 壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3-4天时终止 诱导；其中在该步骤的培养过程中，在培养液中添加巧类诱导物和全反式维甲酸，并且保持 培养液中所述巧类诱导物的浓度为5-10yg/mU所述全反式维甲酸的浓度为5-10ymol/ L;并且，其中所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nM~50nM 的维生素C，10-20U/ml人白细胞抑制因子，l-8mMk谷氨醜胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ ml青霉素，80-100yg/ml链霉素，所述预诱导培养液另外含有0. 01M磯酸盐缓冲液（PBS)。
[0016]所述巧类诱导物为抗氧化剂类物质，该类物质具有耐缺氧、清除自由基、抑制细胞 内巧超载的作用，可在体外可促进厮带间充质干细胞向神经元细胞分化，其通过作用于干 细胞激活了与神经细胞定向分化相关的信号通路Wnt/目-cantine、BMPs/Smad和Nother 等，促进干细胞向神经细胞分化，或者可促进干细胞表达与神经生长、分化有关的如NGF、 NT-3和抓NF等细胞因子，该些细胞因子能诱导干细胞向神经细胞定向分化。
[0017] 在一个最优选的实施方式中，为了进一步促进厮带间充质干细胞向神经元细胞分 化的有效性例如分化效率和选择性，本发明人在一些天然巧类物质的基础上，进行了结构 改进，使得厮带间充质干细胞向神经元细胞分化的效率和选择性得到明显提高。本发明人 经过大量试验和复杂的结构分析，设计出具有如下结构式（I)所示的巧类物质：
【主权项】
1. 一种将脐带间充质干细胞诱导分化成Y-氨基丁酸能神经元的方法，其特征在于该 方法包括以下步骤： (1) 脐带间充质干细胞的培养和扩增：获得脐带间充质干细胞单体，将脐带间充质 干细胞单体按1-5XIO5Ail接种于脐带间充质干细胞培养液中，每3-8天换液传代一次， 得到培养的细胞；其中所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12基本培养基，2%B27， 2-4mML-谷氨酰胺，ImM硫代甘油，1%非必需氨基酸，EGF20-40ng/ml，bFGF20-30ng/ml， 80-90U/ml青霉素，60-70iig/ml链霉素；和 (2) 预诱导分化：将步骤（1)得到的培养细胞按1~5X104/ml的细胞密度接种进行贴 壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3-4天时终止 诱导；其中在该步骤的培养过程中，在培养液中添加苷类诱导物和全反式维甲酸，并且保持 培养液中所述苷类诱导物的浓度为5-10iig/mL，所述全反式维甲酸的浓度为5-10iimol/ L;并且，其中所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nM~50nM 的维生素C，10-20U/ml人白细胞抑制因子，l-8mML-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ ml青霉素，80-100iig/ml链霉素，所述预诱导培养液另外含有0.OlM磷酸盐缓冲液。
2. 根据权利要求1所述的将脐带间充质干细胞诱导分化成Y_氨基丁酸能神经元的方 法，其特征在于：还包括步骤（3)诱导分化：将步骤（2)得到的细胞按1~5XIO4Ail的细 胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量 换液，第3-6天时终止诱导，得到神经细胞；所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此 基础上还含有20nmol~50nmol的维生素C，30nM~40nM的维生素B1，0. 01-0. 02%的二甲 基亚砜，0. 巯基乙醇，10-20U/ml人白细胞抑制因子，10-30U/ml碱性成纤维细胞 生长因子，1-8禮1^-谷氨酰胺，2-51111硫代甘油，80-10(^/1111青霉素，80-1001^/1111链霉素。
3. 根据权利要求1或2所述的将脐带间充质干细胞诱导分化成Y_氨基丁酸能神经 元的方法，其特征在于：所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12,2%B27,4mML-谷氨 酰胺，ImM硫代甘油，1%非必需氨基酸，EGF20ng/ml，bFGF20ng/ml90U/ml青霉素，70iig/ ml链霉素；所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生 素C，20U/ml人白细胞抑制因子，8mML-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，80U/ml青霉素，80iig/ ml链霉素；所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素 C，30nmol的维生素B1，0. 01%的二甲基亚砜，0. 巯基乙醇，10U/ml人白细胞抑制 因子，30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，8mML-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，lOOU/ml青霉素，IOOiig/ml链霉素。
4. 根据权利要求1或2所述的将脐带间充质干细胞诱导分化成Y-氨基丁酸能神经元 的方法，其特征在于：在所述步骤（2)中，培养液的pH维持在7. 2-7. 8。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的方法培养得到的神经细胞。
【专利摘要】公开了一种将脐带间充质干细胞诱导分化成γ-氨基丁酸能神经元的方法。该方法采用预诱导和诱导二步结合法，并配制了优化的预诱导培养液和诱导培养液，其中通过加入结构改进的苷类化合物作为诱导物，成功诱导脐带间充质干细胞分化成γ-氨基丁酸能神经，并且分化比例较高。
【IPC分类】C12N5-0793
【公开号】CN104774808
【申请号】CN201510140299
【发明人】安沂华, 董健伸
【申请人】安沂华
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年3月27日