腈水解酶突变体及其应用
【专利说明】腊水解酶突变体及其应用 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种膳水解酶，特别设及一种突变膳水解酶及其在R-邻氯扁桃酸合 成中的应用。 (二）【背景技术】
[000引膳水解酶巧C3.5.5. 1);膳水解酶超级家族中一类重要的工业用酶，具有曰0 0 a折叠结构和催化S联体Glu-Lys-切S，一般W同源多聚体形式存在，且亚基数 一般为偶数个，其单亚基分子量多数在30-45kDa之间，其主要功能在于水解膳类化合物 生成相应的駿酸，按照催化底物的不同，可W将膳水解酶分为S大类，即脂肪膳水解酶 (ali地atic nitrilase)、芳香膳水解酶（aromatic nitrilase,主要水解芳香膳、杂环膳） 和芳基脂肪膳水解酶（airlaliphatic nitrilase)。利用膳水解酶的催化活性是降解环境 污染中高毒性膳的有效途径。故膳水解酶不但能应用于环境污染问题，而且能生产重要的 医药中间体。在自然界中，膳水解酶来源广泛，主要有细菌，丝状真菌，酵母，植物等，并W细 菌为主要来源。从生物技术应用角度，微生物膳水解酶作为绿色催化剂更具有商业价值，在 催化应用上也更易于控制。膳水解酶的催化机理，W及蛋白结构和催化特性的关系尚不清 楚，测定精确的蛋白质结构和对催化机理的探索十分重要。根据蠕虫NiFhit晶体结构分 析，其活性部位含有Glu-Lys-切S3个残基，Brenner小组推测整个膳水解酶大家族可能是 通过Glu-Lys-切S3个残基来催化的。其具体作用机制如下图1所示；膳水解酶先攻击CN 共价键，形成酶与底物共价结合的中间体，继而加上一分子的水，并放出一分子的氨，当加 上第二分子的水时，生成酸和酶。
[0003] 膳水解酶已被广泛应用，但许多反应参数需要进一步改进，从而建立可行的工业 过程。为解决该一问题，现主要是利用W下几种方法，筛选新的膳水解酶，酶活提高，底物结 构优化，培养基和工程参数的优化。新酶的发现主要是基因组挖掘和宏基因组方法。蛋白 质工程的目的是改变对底物特异性，活性W及立体选择性，改变膳水解酶中的酷胺比。底物 结构的变化会影响反应的立体和化学选择性。如果在应用过程中和其他的酶W及化学催化 剂相结合，并且没有昂贵的分离费用，可W得到更广泛的应用。
[0004] R-邻氯扁桃酸：
[0005]
【主权项】
1. 一种腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQIDNO. 2所示氨基酸序列的 第132位苏氨酸或第189位苯丙氨酸进行单突变或双突变获得的。
2. 如权利要求1所述腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQIDNO. 2所示 氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸或丙氨酸。
3. 如权利要求1所述腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQIDNO. 2所示 氨基酸序列第189位苯丙氨酸突变为丝氨酸、半胱氨酸、组氨酸、苏氨酸或赖氨酸。
4. 如权利要求1所述腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体为下列之一 ：（1)将SEQ IDNO. 2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，氨基酸序列为SEQIDNO. 4所示； (2)将SEQIDNO. 2所示氨基酸序列第189位苯丙氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQ IDNO. 6所示；（3)将SEQIDNO. 2所示氨基酸序列第189位苯丙氨酸突变为苏氨酸，氨基 酸序列为SEQIDNO. 8所示；(4)将SEQIDNO. 2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为 精氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为半胱氨酸，氨基酸序列为SEQIDNO. 10所示；（5) 将SEQIDNO. 2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，同时将第189位苯丙氨酸 突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQIDNO. 12所示；(6)将SEQIDNO. 2所示氨基酸序列第 132位苏氨酸突变为精氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列为SEQID NO. 14所示；（7)将SEQIDNO. 2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，同时将第 189位苯丙氨酸突变为组氨酸，氨基酸序列为SEQIDNO. 16所示；（8)将SEQIDNO. 2所示 氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为赖氨酸，氨基酸 序列为SEQIDNO. 18所示；（9)将SEQIDNO. 2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为丙 氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列为SEQIDNO. 20所示。
5. -种由权利要求1-4之一所述腈水解酶突变体构建的重组载体。
6. -种由权利要求5所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
7. -种权利要求1-4之一所述腈水解酶突变体在拆分邻氯扁桃酸制备（R)-邻氯扁桃 酸中的应用。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含腈水解酶突变体编码基 因的重组工程菌经诱变培养获得的湿菌体为酶源，以外消旋邻氯扁桃酸为底物，以PH为 7. 5的Tris-HCl缓冲液为反应介质，以甲苯为助剂构成反应体系，在40°C、400rpm条件下反 应，反应完全后，获得含（R)-邻氯扁桃酸的混合液，将混合液分离纯化，获得（R)-邻氯扁桃 酸；所述湿菌体的用量以反应体系总体积计为l〇g/L，所述助剂体积终浓度为10-30%，所 述底物用量以反应体系总体积计为100-500mmol/L。
9. 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含腈水解酶突变体编码基 因的重组工程菌经诱变培养获得的湿菌体用pH7. 5、0.lmol/L的Tris-HCl缓冲液悬浮 制成菌悬液，以菌悬液为酶源，以外消旋邻氯扁桃酸为底物，于含体积终浓度5%甲醇、pH 为4-9的pH缓冲液中构成反应体系，在30-75°C、200rpm条件下反应，反应结束后，获得含 (R)-邻氯扁桃酸的混合液，将混合液分离纯化，获得（R)-邻氯扁桃酸；所述湿菌体的用量 以反应体系总体积计为l-5g/L，所述底物用量以反应体系总体积计为20mmol/L。
10. 如权利要求8或9所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含腈水 解酶突变体编码基因的重组工程菌接种至含终浓度40yg/mL卡那霉素的LB液体培养基 中，37°C、150rpm/min振荡培养到OD6qq= 0. 6~0. 8 ;培养液以体积浓度2%接种量接种到 新鲜的含有终浓度40yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、150rpm/min振荡培养至菌体浓00_=0.6~0.8，加入终浓度0.51111的1?了6,281：、150卬111/111111诱导培养1011，于 4°C、9000rpm/min离心lOmin，收集湿菌体。
【专利摘要】本发明公开了一种腈水解酶突变体及其在R-邻氯扁桃酸合成中的应用，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第132位苏氨酸或第189位苯丙氨酸进行单突变或双突变获得的；本发明所述的腈水解酶突变体较未突变的腈水解酶比酶活提高3.70倍，达到1.08U/mg，对映体选择性达到99％，且结果表明，腈水解酶突变体在两相体系中(甲苯：水＝2：8)，可催化300mM邻氯扁桃腈，产率90.8％，通过流加底物的方式，最高可催化500mM邻氯扁桃腈，产率90％，对映体选择性大于99％。
【IPC分类】C12N9-78, C12N1-21, C12N15-70, C12P7-42, C12P41-00
【公开号】CN104774825
【申请号】CN201510127744
【发明人】薛亚平, 郑裕国, 施成赐, 徐喆, 柳志强
【申请人】浙江工业大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年3月23日