专利名称：带有氯霉素抗性的分泌高产戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶的菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及头孢菌素酰化酶，尤其是关于一种重组戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因的重组表达质粒以及该基因在大肠杆菌中的分泌高表达。
7-氨基头孢烷酸(7-amino cephalosporanic acid，7-ACA)是医药工业合成大多数头孢菌素衍生物的起始原料。7-ACA可以通过发酵产物头孢菌索C(cephalosporin C，CPC)的化学去氨酰化得到。由于化学方法诸如亚胺醚和亚硝酰氯法包括多个造价昂贵的步骤，所以人们一直试图探索用酶法来解决这个问题[Vandamme E J，Voets J P.Adv Appl Micrbiol，1974,17311]。目前已经发现两类头孢菌素酰化酶(cephalosporin acylase，CA)，分别为戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(glutaryl-7-ACA acylase，GL-7ACA酰化酶)和头孢菌素C酰化酶(cephalosporin C acylase，CPC酰化酶)，它们分别催化GL-7ACA和CPC的水解反应，又因为CPC可以在D-氨基酸氧化酶催化下(D-AAO)很容易生成GL-7ACA[Isogai T et al J Biochem，1990，1081063]。所以GL-7ACA酰化酶和CPC酰化酶一样，在酶法合成7-ACA上具有重要的应用价值(见图1)。
根据已有的报道，现已有个10头孢菌素酰化酶的基因被克隆[见Matsuda A，Komatsu K I.JBacteriol，1985，1631222；YangY et al.Chin JBiotech，1991，799；Ishii Y et al.JFerment Bioeng，1994，77591；MatsudaA et al.J Bacteriol，1987，1695815；Matsuda A et al.J Bacteriol，1987，1695821；Ishiye M，Niwa M.Biochim Biophys Acta，1992，1132233；Aramori I et al.，J Ferment Bioeng，1991，72232；Aramori I et al.JBacteriol，1991，1737848]。杨蕴刘等从假单胞菌中克隆到GL-7-ACA酰化酶的基因[Yang Y et al.J Bacteriol，1991，799]，并测定了其全序列。该酰化酶与GK16酰化酶[Matsuda A.Komatsu K I.J Bacteriol，1985，1631222]和C430酰化酶[Ishii Y et al.J Ferment Bioeng，1994，77591]很相似，这三个酶基因具有95％左右的同源性。酶分子量为70千道尔顿，由两个亚基组成，β-亚基分子量为54千道尔顿，α-亚基分子量16千道尔顿；它们最引人注目的特点是在很宽的pH值范围内(pH6.5-9.0)对GL-7ACA都有很高的水解活力；这一点在工业生产上十分有利，因为GL-7ACA水解过程中生成戊二酸，反应液的pH值变化较大。
GK16酰化酶基因最先被一家日本公司克隆[Tsuzuki K et al.NipponNougeikagaku Kaishi，1989，631847]。但是该基因只有公开报道的α-亚基的全部序列和β-亚基的部分序列。随后日本另一家公司克隆了C430酰化酶基因，并公开发表了全基因序列[Ishii Y et al.J Ferment Bioeng，1994，77591]。由于酶基因在假单胞菌中表达量极低，这两家日本公司都对酶基因在大肠杆菌中进行了不同程度的高表达工作，得到的高表达菌株产酶量比原宿主菌(假单胞菌)高出许多倍。杨蕴刘等从假单胞菌克隆的酰化酶基因片段约为3.5kb(kb表示DNA的长度为1000个碱基对)，该基因在假单胞菌中表达极低，即使在大肠杆菌中表达量也很低，粗抽液比活仅为每毫克蛋白0.42单位(0.42unit/mg)[周宏伟等。微生物学报，1997，37196]，需经复杂的五个步骤才能纯化。李勇等采用基因工程方法改造了此酶基因，改造后的基因在大肠杆菌中得到高表达，菌株产酶量达到每克湿菌2040单位酶，粗抽液酰化酶活力为每毫克蛋白3.5单位，而且粗抽液经过简单的两步层析柱纯化后比活力就已达到每毫克蛋白12单位[YongLi et al.Protein Expressionand Purification，1998，12233-238]。
但以上高表达基因的方法最后得到的都是非分泌型的表达菌株，不可避免的要涉及到酶的分离纯化以及固定化酶等一系列生产上难以应付的问题，其结果是对技术、仪器设备的要求很高，使生产成本大大提高。为此，陈剑峰等借助Pseudomonas sp.130表达元件和信号肽构建了GL-7ACA的分泌型表达质粒pTrcCAlS和pKKCAlS，该表达元件介导GL-7ACA酰化酶的基因在大肠杆菌中获得了高表达，表达的产物GL-7ACA酰化酶在信号肽的引导下直接被转运到周质空间。测得完整细胞的酰化酶比活力分别为每克菌体23.9单位和每克菌体183单位[陈剑峰等，生物化学与生物物理学报，1998，30(4)393-396]。由于GL-7ACA酰化酶的底物GL-7ACA和产物7-ACA都可以自由进出周质空间，可以通过在培养基中加入底物而获得产物，从而有可能简化生产工艺，降低生产成本。但这两个质粒有一个共同缺点，即它们带有氨苄青霉素抗性，具有β-内酰氨酶基因。尽管β-内酰氨酶对GL-7ACA和CPC水解活力极低，但在大批量的工业生产中，还是有可能破坏底物(GL-7ACA和CPC)。因此本发明特构建了不带β-内酰氨酶基因的分泌表达质粒，使其在大肠杆菌中获得高表达，以便在7-ACA的酶法生产过程中发挥重要作用。
本发明目的是提供一种重组GL-7ACA酰化酶基因，和含有该基因及其表达元件和信号肽的带氯霉素抗性的分泌型高表达重组质粒，以及将该重组分泌表达质粒转化到特定大肠杆菌中成为能高分泌表达该酰化酶的基因工程菌株。
本发明提供一种从假单胞菌中克隆的并经基因工程方法改造的长为2.5kb的重组GL-7ACA酰化酶基因及其表达元件和信号肽，它们的全序列见图3、图6及图7。用限制性内切酶Apa LI将该基因以及杂合启动子trp/lac从质粒pTrcCAlS[陈剑峰等，生物化学与生物物理学报，1998，30(4)393-396]上切下，同时以PCR[聚合酶链式反应]方法从载体pSU2719上扩增下两端带有Apa LI位点的1.8kb片段，该片段包括氯霉素抗性基因和p15A复制子。将以上两个片段经限制性内切酶Apa LI酶切后，连接成重组高分泌表达质粒pSuperCAlS。转化该质粒到大肠杆菌TGl中，则得分泌型、高表达基因工程菌株TGl/pSuperCAlS。
1．重组GL-7ACA酰化酶基因以及其表达元件、信号肽的克隆
GL-7ACA酰化酶基因以及其表达元件、信号肽由杨蕴刘等克隆[杨蕴刘等，生物工程学报，1991，7(2)99-107]，但未公开发表它们的序列。杨蕴刘等构建的质粒pMR24，它带有来自假单胞菌长为3.5kb片段的GL-7ACA酰化酶基因。将pMR24以限制性内切酶BamHⅠ酶切后，得到0.7kb的片段，它包含有GL-7ACA酰化酶α-亚基的相应核苷酸序列以及该酶的表达原件、信号肽。表达元件介导GL-7ACA酰化酶基因在大肠杆菌中获得高表达，信号肽引导GL-7ACA酰化酶分泌到周质空间。将该0.7kb片段与经限制性内切酶BamHⅠ酶切后的载体pBluescript SKⅡ连接成重组质粒pBlue3。陈剑峰等利用pBlue3以及pKKCAl[Yong Li et al.Protein Expression and Purification，1998，12233-238]构建了重组分泌表达质粒pTrcCAlS[陈剑峰等，生物化学与生物物理学报，1998，30(4)393-396]，它包含有长为2.5Kb的重组GL-7ACA酰化酶基因，但未公开发表其序列。
2．重组分泌型表达质粒pSuperCAlS的构建利用一对引物寡核苷酸引物，序列分别为CGG TTT GCG TAT TGT GCA CTA GCG GAG和AAA CAG AAG CCA CTG GTG CAC CTC，通过PCR[聚合酶链式反应]方法从载体pSU2719上扩增下长度为1.8kb的一段DNA序列，该序列包含有p15A复制子和氯霉素抗性基因。同时在该1.8kb序列的5’引入了两个定点突变(序列由CGG TTT GCG TAT TGG GCG CTA GCG GAG突变为CGG TTTGCG TAT TGT GCA CTA GCG GAG，引入一个Apa LI位点)，在3’端引入了一个定点突变(序列由AAA CAG AAG CCA CTG GAG CAC CTC突变为AAA CAGAAG CCA CTG GTG CAC CTC，引入一个Apa LI位点)。用限制性内切酶ApaLI从质粒pTrcCAlS上切下3.8kb的DNA片段，该片段包含有trp/lac杂合启动子和重组GL-7ACA酰化酶基因。将以PCR方法从pSU2719上克隆的1.8kb片段用限制性内切酶Apa LI酶切后，与用同样的限制性内切酶从pTrcCAlS上酶切下的3.8kb片段连接成表达质粒pSuperCAlS(见图2)。在该质粒中，酰化酶基因依靠trp/lac杂合启动子、自身的表达元件以及转录终止子和终止密码子而表达，然后依靠信号肽引导GL-7ACA酰化酶分泌到周质空间。
3．基因工程菌株TGl/pSuperCAlS的获得将表达质粒pSuperCAlS转化到大肠杆菌TGl{遗传特征为supEhsd△5thi△(lac-proAB)F`[traD36 proAB+lacIQ lacZ△M15]}中，得到转化子TGl／pSuperCAlS即为本发明的基因工程菌株(菌种保藏号CGMCCNO.0474，日期2000年7月11日，保藏地北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。
4．完整细胞GL-7ACA酰化酶活力的测定完整细胞的GL-7ACA酰化酶活力的测定参照Ichikawa等人的方法[Ichikawa et al.Argric Biol Chem，1981，45(10)，2225-2229.]进行。酶活力单位(unit)定义为37℃、pH7.0时每分钟水解GL-7ACA产生1微摩尔的7-ACA所需要的酶量。酶的比活力定义为每克菌体所具有的酶活力单位。该菌株在普通LB培养基中于30℃培养至对数后期，测得比活力的最高值为每克菌体120个单位(八次实验的平均值)，高于TGl/pTrcCAlS(每克菌体23.9个单位)和TGl/pKKCAlS(每克菌体18.3个单位)。
5．LB培养基pH值对重组GL-7ACA酰化酶基因表达的影响基因工程菌株TGl/pSuperCAlS分别在pH值为7.5、8.0、8.5、9.0的LB培养基中培养至对数后期，分别测定GL-7ACA酰化酶活力，发现在pH值为8.5的LB培养基中表达产量最高。(见图4)6．菌种的稳定性实验在氯霉素浓度达到25微克/毫升的LB平板上划线培养，连续传代达50次，测定第10、20、30、40、50代基因工程菌产生的GL-7ACA酰化酶的活力，未见活力降低，可见该基因在大肠杆菌中相当稳定(见图5)。
本发明的优点本发明是一种高产GL-7ACA酰化酶，分泌型及带有氯霉素抗性的新型基因工程菌。用限制性内切酶Apa LI将重组GL-7ACA酰化酶基因以及杂合启动子trp/lac从质粒pTrcCAlS上切下，与以PCR方法从载体pSU2719上克隆下的1.8kb片段连接成重组高分泌表达质粒pSuperCAlS，再将该质粒转化到大肠杆菌TGl中得到高分泌表达基因工程菌株TGl／pSuperCAlS。与JM109/pKKCAl、TGl/pKKCAlS及TGl/pTrcCAlS相比，它具有以下优点1．高分泌表达以前构建的基因工程菌株JM109/pKKCAl[Yong Li et al.ProteinExpression and Purification，1998，12233-238]，由于它是非分泌型表达菌株，一旦用于生产就不可避免要涉及到酶的分离纯化以及固定化酶等复杂的技术问题，生产成本大大提高。而本发明基因工程菌株TGl／pSuperCAlS使用了GL-7ACA酰化酶的信号肽，得到的是高分泌表达菌株，表达的GL-7ACA酰化酶直接分泌到周质空间，而且底物GL-7ACA及产物7-ACA都能自由进出周质空间，所以完全可以采用传统发酵法生产，从而大大降低生产成本。
2．以氯霉素抗性取代了氨苄青霉素抗性虽然TGl/pTrcCAlS及TGl/pKKCAlS都是分泌型表达菌株[陈剑峰等，生物化学与生物物理学报，1998,30(4)393-396]，由于质粒带有氨苄青霉素抗性，都带有β-内氨酰酶基因，尽管β-内酰氨酶对GL-7ACA和CPC水解活力极低，但在大批量的工业生产中，仍有可能破坏底物(GL-7ACA和CPC)。本发明的基因工程菌株用氯霉素抗性取代了氨苄青霉素抗性，克服了以上缺点。而且，氯霉素价格比氨苄青霉素的价格要便宜很多，在工业生产中能显著降低成本。
3．不需要使用诱导剂TGl/pTrcCAlS虽然可以分泌高表达重组GL-7ACA酰化酶基因，但需要昂贵而有毒的IPTG诱导。本发明菌株不需要添加任何诱导剂，即可实现基因的高表达。降低了成本，简化了培养条件。
4．目前得到的最高表达菌株李勇和陈剑锋构建的基因工程菌株的表达产量比起始构建的基因工程菌已提高很多[Yong Li et al.Protein Expression and Purification，1998，12233-238；陈剑峰等，生物化学与生物物理学报，1998，30(4)393-396]。但本发明中构建的表达质粒pSuperCAlS使含该质粒的转化子中GL-7ACA酰化酶的表达量大大提高，完整细胞的比活力可达到每克菌体120单位。这是目前报道的最高分泌表达GL-7ACA酰化酶的菌株。
5．本发明菌株易培养且表达稳定本发明菌株在普通LB培养基中于30℃培养24小时即可。本发明菌株表达GL-7ACA酰化酶极稳定，传代50代未见表达产量下降和酶活丧失。
通过以下附图和实施例对本发明作进一步阐述。
图1是GL-7ACA酰化酶和CPC酰化酶所催化的反应示意图。CPC头孢菌素C；D-AAOD-氨基酸氧化酶；7-ACA7-氨基头孢烷酸；GL-7ACA戊二酰-7-氨基头孢烷酸。
图2是重组分泌表达质粒pSuperCAlS的构建示意图。
图3是本发明2.5kb的GL-7ACA酰化酶基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。
图4是培养基的pH值对GL-7ACA酰化酶分泌表达的影响。
图5是传代实验第1、10、20、30、40、50代GL-7ACA酰化酶活力。
图6是表达元件的核苷酸序列。
图7是信号肽的核苷酸序列及相应的氨基酸序列。
实施例1重组分泌型表达质粒pSuperCAlS的构建大肠杆菌克隆载体pSU2719[Eduardo Martinez et al.，Gene，1988，68159-162]长度为2338kb，它包含有氯霉素抗性基因、p15A复制子、BanⅡ到HindⅢ多克隆位点。利用一对引物寡核苷酸，序列分别为CGG TTT GCGTAT TGT GCA C TA GCG GAG和AAA CAG AAG CCA CTG GTG CACCTC，以PCR方法从克隆载体pSU2719上克隆下长度为1.8kb的一段DNA序列，该序列包含有p15A复制子和氯霉素抗性基因。同时在该1.8kb序列的5’引入了两个定点突变(序列由CGG TTT GCG TAT TGG GCG CTA GCGGAG突变为CGG TTT GCG TAT TGT GCA CTA GCG GAG，引入一个ApaLI位点)，在3’端引入了一个定点突变(序列由AAA CAG AAG CCACTG GAG CAC CTC突变为AAA CAG AAG CCA CTG GTG CAC CTC，引入一个Apa LI位点)。将质粒pTrcCAlS用限制性内切酶Apa LI酶切后，分离得到3.8kb的DNA片段，该片段包含有trp/lac杂合启动子和重组GL-7ACA酰化酶基因。将以PCR方法从pSU2719上克隆的1.8kb片段以限制性内切酶Apa LI酶切后，与从pTrcCAlS上酶切下的3.8kb片段连接成表达质粒pSuperCAlS.(见图2)实施例2基因工程菌株TGl／pSuperCAlS的获得将大肠杆菌TG1{遗传特征为supEhsd△5thi△(lac-proAB)F`[traD36proAB+lacIq lacZ△M15]}中，用氯化钙法(Sambrook，J et al.(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual.Cold Spring Harbor，New York)制备成感受态细胞(转化率为106pfu)。将pSuperCAlS转化到该细胞中，得到的转化子命名为TGl/pSuperCAlS，即为本发明的基因工程菌株。在普通LB培养基[Luria-Bertani培养基，每升培养基的配制在950毫升去离子水中加入细菌培养用胰化蛋白胨10克，细菌培养用酵母抽提物5克，氯化钠10克，溶质完全溶解后，以5摩尔/升的氢氧化钠调节至所需要的pH值，加入去离子水至总体积为1升，在1.034×105帕斯卡的高压下蒸汽灭菌20分钟。]中于30℃培养24小时后，离心收集菌体并测GL-7ACA酰化酶活力，测得比活力为每克菌体120个单位。
实施例3完整细胞的酶活力测定完整细胞的GL-7ACA酰化酶活力的测定参照Ichikawa等人的方法[Ichikawa et al.Argric Biol Chem，1981，45(10)，2225-2229.]进行。酶活力单位(unit)定义为37℃、pH7.0时每分钟水解GL-7ACA产生1微摩尔的7-ACA所需要的酶量。酶的比活力定义为每克菌体所具有的酶活力单位。在普通LB培养基[同实施例2]中于30℃培养24小时后，取4毫升菌液，8000转/分钟离心10分钟收集菌体，沉淀悬浮于3毫升pH7.0、0.1摩尔每升的磷酸钠缓冲液中。取100微升菌液于37℃预热5分钟，加入100微升已同时于37℃预热了5分钟的16毫摩尔/升的GL-7ACA，于37℃混合保温30分钟；加入600微升终止液(20％的醋酸和50毫摩尔每升的NaOH以2∶1的体积比混合)混合，15000转每分钟离心10分钟，取上清；最后加入100微升0.5％的对二甲氨基苯甲醛(Merk公司，美国)显色；测定最终混合液在415纳米处的光吸收值，即可算出水解产物7-ACA的量。此外，取菌液作适当稀释，测在600纳米处的光吸收值。以7-ACA产量对菌浓度即可算出比活力。
实施例4培养基的pH值对GL-7ACA酰化酶分泌表达的影响菌株分别于pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、的LB培养基[同实施例2]中培养24小时后，测定各自的完整细胞的GL-7ACA酰化酶活力，发现菌株在pH值为8.5的培养基中培养时GL-7ACA酰化酶的表达量最高。(见图4)实施例5传代实验在含氯霉素浓度达到25微克/毫升的LB平板上划线培养，连续传代达50次，测定第10、20、30、40、50的比活力，活力稳定，可见该基因在大肠杆菌中很稳定(见图5)。
权利要求
1.一种重组戊二酰-7-氨基头胞烷酸酰化酶基因，其特征在于它编码GL-7ACA酰化酶的核苷酸序列以及相应的氨基酸序列如下1CTGGCCGAGCCGACCTCGACGCCGCAGGCGCCGATTGCGGCCTATAAACCGAGAAGCAATGAGATCCTG 691LeuAlaGluProThrSerThrProGlnAlaProIleAlaAlaTyrLysProArgSerAsnGluIleLeu 2370 TGGGACGGCTACGGCGTCCCGCACATCTACGGGGTCGACGCGCCCTCAGCCTTCTACGGCTACGGCTGG 13824 TrpAspGlyTyrGlyValProHisIleTyrGlyValAspAlaProSerAlaPheTyrGlyTyrGlyTrp 46139 GCCCAGGCGCGCAGCCACGGCGACAATATCCTGCGCCTGTATGGAGAAGCGCGGGGCAAGGGGGCCGAA 20747 AlaGlnAlaArgSerHisGlyAspAsnIleLeuArgLeuTyrGlyGluAlaArgGlyLysGlyAlaGlu 69208 TACTGGGGCCCGGATGACGAACAGACGACCGTCTGGCGTCTGACCAACGGCGTGCCGGAGCGTGCCCAG 27670 TyrTrpGlyProAspAspGluGlnThrThrValTrpArgLeuThrAsnGlyValProGluArgAlaGln 138277 CAGTGGTATGCGCAGCAGTCGCCTGATTTCCGCGCCAACCTCGACGCCTTCGCGGCGGGCATCAACGCC 345139 GlnTrpTyrAlaGlnGlnSerProAspPheArgAlaAsnLeuAspAlaPheAlaAlaGlyIleAsnAla 207346 TATGCGCAGCAGAACCCCGACGACATCTCGCCCTGACTGCGGCAGGTGCTGCCGGTCGCCGGCGCCGAC 414208 TyrAlaGlnGlnAsnProAspAspIleSerProAspValArgGlnValLeuProValAlaGlyAlaAsp 276415 GTGGTGGCCCACGCCCATCGCCTGATGAACTTCCTCTATGTCGCGTCGCCCGGCCGCACCCTGGGCGAG 483277 ValValAlaHisAlaHisArgLeuMetAsnPheLeuTyrValAlaSerProGlyArgThrLeuGlyGlu 345484 GGCGACCCGCCGGACCTGGCCGATCAGGGATCCAACTCCTGGGCTGTGGCGCCGGGCAAGACGGCCAAT 552346 GlyAspProProAspLeuAlaAspGlnGlySerAsnSerTrpAlaValAlaProGlyLysThrAlaAsn 414553 GGGAACGCCCTGCTGCTGCAGAACCCGCACCTGTCCTGGACGACGGACTACTTCACCTACTACGAGGCG 621415 GlyAsnAlaLeuLeuLeuGlnAsnProHisLeuSerTrpThrThrAspTyrPheThrTyrTyrGluAla 483622 CATCTCTTCACGCCGGACTTCGAAATCTATGGCGCGACCCAGATCGGCCTGCCGGTCATCCGCTTCGCC 690484 HisLeuPheThrProAspPheGluIleTyrGlyAlaThrGlnIleGlyLeuProValIleArgPheAla 552691 TTCAATCAGCGGATGGGCATCACCAATACCGTCAACGGCATGGTGGGGGCCACCAACTATCGGCTGACG 759553 PheAsnGlnArgMetGlyIleThrAsnThrValAsnGlyMetValGlyAlaThrAsnTyrArgLeuThr 621760 CTTCAGGGCGACGGCTATCTGTATGACGGTCAGGTGCGGCCGTTCGAGCGGCGTCAGGCTTCGCATCGC 828622 LeuGlnGlyAspGlyTyrLeuTyrAspGlyGlnValArgProPheGluArgArgGlnAlaSerHisArg 690829 CTGCGTCAGGCGGACGGGTCGACGGTCGACAAGCCGTTGGAGATCCGTTCCAGCGTCCATGGCCCGGTC 897691 LeuArgGlnAlaAspGlySerThrValAspLysProLeuGluIleArgSerSerValHisGlyProVal 759898 TTCGAGCGCGCGGACGGCACGGCCGTCGCCGTTCGGGTCGCCGGTCTGGATCGGCCGGGCATGCTCGAG 966760 PheGluArgAlaAspGlyThrAlaValAlaValArgValAlaGlyLeuAspArgProGlyMetLeuGlu 828967 CAGTATTTCGACATGATCACGGCGGACAGCTTCGACGACTACGAAGCCGCTATGGCGCGGATGCATGTG 1035829 GlnTyrPheAspMetIleThrAlaAspSerPheAspAspTyrGluAlaAlaMetAlaArgMetHisVal1036 CCGACCTTCAACATCGTCTACGCCGACCGCGAAGGGACCATCAACTACAGCTTCACGGCGTGGCGCCCA 1104ProThrPheAsnIleValTyrAlaAspArgGluGlyThrIleAsnTyrSerPheThrAlaTrpArgPro1105 AACGGGCCGAGGGCGACATCGCCTTCTGGCAGGGGCGCGGCCGGGCCATTCCTCGCGTTACTGTGGACT 1173AsnGlyProArgAlaThrSerProSerGlyArgGlySerAlaGlyProPheLeuAlaLeuLeuTrpThr1174 GAGACACACCCCTGGACGATCTGCCGCGCGTCACCAATCCGCCGGCCCGCTTCGTGCAGAACTCCAATG 1242GluThrHisProTrpThrIleCysArgAlaSerProIleArgArgProAlaSerCysArgThrProMet1243 ATCCGCCGTGGACGCCGACCTGGCCCGTCACCTACACGCCCAGGGACTTCCCCTCCTATCTGGCGCCCC 1311IleArgArgGlyArgArgProGlyProSerPROThrArgProGlyThrSerProProIleTrpArgPro1312 AGACGCGCACTCCCTGCGCGCTCAGCAAAGCGTGCGTCTGATGTCGAGAACGACGACCTGAGGCTGGAA 1380ArgArgAlaLeuProAlaArgSerAlaLysArgAlaSerAspValGluAsnAspAspLeuArgLeuGlu1381 CGCTTCATGGCGCTGCAGTTGAGCCACCGCGCCGTCATGGCCGACCGCACCTTGCCGGACCTGATCCCG 1449ArgPheMetAlaLeuGlnLeuSerHisArgAlaValMetAlaAspArgThrLeuProAspLeuIlePro1450 GCCGCCCTGATCGACCCCGATCCCGAGGTCCAGGCGGCGGCGCGCCTGCTGGCGGCGTGGGATCGTGAG 1518AlaAlaLeuIleAspProAspProGluValGlnAlaAlaAlaArgLeuLeuAlaAlaTrpAspArgGlu1519 TTCACCAGCGACAGCCGCGCCGCCCTGCTGTTCGAGGAATGGGCGCGTCTGTTCGCCGGCCAGAATTTC 1587PheThrSerAspSerArgAlaAlaLeuLeuPheGluGluTrpAlaArgLeuPheAlaGlyGlnAsnPhe1588 GCCGGCCAGGCGGGTTTCGCCACGCCCTGGTCGCTGGATAAGCCGGTCAGCACCCCCACGGCGTCCGCT 1656AlaGlyGlnAlaGlyPheAlaThrProTrpSerLeuAspLysProValSerThrProTyrGlyValArg1657 GACCCCAAGGCCGCCGTCGATCAACTGCGGACCGCCATCGCCAACACCAAGCGCAAATACGGCGCGATC 1725AspProLysAlaAlaValAspGlnLeuArgThrAlaIleAlaAsnThrLysArgLysTyrGlyAlaIle1726 GACCGCCCGTTCGGCGACGCCTCGCGCATGATCCTGAACGATGTGATTGTTCCGGGCGCCGCCGGCTAC 1794AspArgProPheGlyAspAlaSerArgMetIleLeuAsnAspValIleValProGlyAlaAlaGlyTyr1795 GGCAACCTGGGTTCCTTCCGGGTCTTCACCTGGTCCGATCCTGACGAAAACGGGGTTCGCACGCCCGTC 1863GlyAsnLeuGlySerPheArgValPheThrTrpSerAspProAspGluAsnGlyValArgThrProVal1864 CACGGCGAGACGTGGGTGGCGATGATCGAGTTCTCCACCCCGGTGCGGGCCTATGGCCTGATGAGCTAC 1932HisGlyGluThrTrpValAlaMetIleGluPheSerThrProValArgAlaTyrGlyLeuMetSerTyr1933 GGCAATTCTCGCCAGCCGGGCACGACGCACTACAGCGATCAGATCGAACGCGTGTCGCGGGCCGACTTC 2001GlyAsnSerArgGlnProGlyThrThrHisTyrSerAspGlnIleGluArgValSerArgAlaAspPhe2002 CGCGAGCTGTTGCTGCGGCGAGAGCAGGTCGAGGCCGCCGTCCAGGAACGCACGCCCTTCAACTTCAAG 2070ArgGluLeuLeuLeuArgArgGluGlnValGluAlaAlaValGlnGluArgThrProPheAsnpheLys2071 CCATGAAAGGCCTGACCATGACACGACGGATTGGGTATTCGGCGGGCGCGGCGTCTCTGGCGCTGATGG 2139ProTCGCCGCCTCTGGAGCGGCGGCGGGCGAGCCGGCCTTCACTTCGGTTCAGGTCGAGGGCTTTTCGGTACCGGGCGCGCTGTCGAAGGCCTGGGCCGACTTCGACAACGACGGCGACCTGGACCTGGCCGTCTCCTGGAAGAGCGGCGAAGTTCGCCTCTATCTCAACGACGGCGGCGCTTTCGTCAACATCGGCCCGGAGATGGGCTGCCTACCTCGGGCATCGAGATTCGCGGGTTGAGCTGGGGCGACTTCGACGGCGATGGGTTCGTCGAC
2．权利要求1所述重组GL-7ACA酰化酶基因的表达元件，其特征在于该表达元件的核苷酸序列如下ATCCGTGGTTCGTACGCGCCGCCTACAAGTGGTGATCTAGGGGAACGTTCCGGGGGCGTCGCTTCAACGGCGTCTCCGGATCTGGGTGAGAGGGGAAATCC
3．权利要求1所述重组GL-7ACA酰化酶基因的信号肽，其特征在于该信号肽的核苷酸序列以及相应的氨基酸序列如下ATGCTGAGAGTTCTGCACCGGGCGACGTCCGCCCTGGTTATGGCGACTGCGATCGGCCTTGCGCCCGGCMetLeuArgValLeuHisArgAlaThrSerAlaLeuValMetAlaThrAlaIleGlyLeuAlaProGlyGTCGCCCTTGCGValAlaLeuAla
4．含有权利要求1，2和3所述的重组GL-7ACA酰化酶基因以及其表达元件、信号肽的重组表达质粒，其特征在于该表达质粒是由限制性内切酶ApaLI酶切质粒pTrcCAlS所得3.8kb的带trp/lac杂合启动子、以及重组GL-7ACA酰化酶基因、表达元件、信号肽的相应核苷酸序列、与来自载体pSU2719的带氯霉素抗性基因和p15A复制子1.8kb片段连接而成的带氯霉素抗性的重组分泌表达质粒pSuperCAlS。
5．含有权利4所述的重组分泌表达质粒pSuperCAlS的基因工程菌株，其特征在于该菌株是将重组分泌表达表达质粒pSuperCAlS转化到大肠杆菌TGl中得到的保藏号为CGMCCNo.0474的基因工程菌株TGl/pSuperCAlS。
全文摘要
本发明提供了一种从假单胞菌中克隆并经基因工程改造得到的长为2.5kb的重组GL－7ACA酰化酶基因及其表达元件和信号肽的序列。构建了该基因的高分泌表达重组质粒pSuperCA1S,该质粒转化至大肠杆菌菌株TG1中,得到的基因工程菌株TG1/pSuperCA1S在普通的LB培养基中,无需添加诱导剂即能高效分泌表达GL－7ACA酰化酶,比活力可达到每克菌体120个单位。
文档编号C12N15/55GK1283697SQ0012510
公开日2001年2月14日 申请日期2000年9月8日 优先权日2000年9月8日
发明者王恩多, 李勇, 郑勇刚, 陈剑峰, 姜卫红, 赵国屏, 杨蕴刘 申请人:中国科学院上海生物化学研究所