专利名称：长春花第三组晚期胚胎丰富蛋白的基因序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因领域，具体涉及长春花抗旱基因晚期胚胎丰富蛋白的基因序列。
背景技术：
晚期胚胎丰富蛋白LEA(late embryogenesis abundant Protein，LEA)广泛存在于高等植物中，具有较强的抗旱能力。不同类型的LEA在高等植物种子胚胎发生的不同阶段种胚中表达或在干旱胁迫条件下表达。它们可以被ABA(abscisic acid)诱导。同时，LEA蛋白在植物耐寒、耐盐性方面也发挥着重要作用。
LEA蛋白共同的结构特征是偏性氨基酸组成形成高度亲水性的多肽。大多数LEA蛋白缺乏半胱氨酸和酪氨酸残基，但富含赖氨酸和甘氨酸。根据它们氨基酸序列的同源性及一些特殊的基元序列，LEA蛋白可分为6组。
第3组LEA蛋白通常含有多拷贝的11个氨基酸组成的基元序列(TAQAAKEKAGE)。该组LEA蛋白大小差异很大，所含基元序列的拷贝数少的只有5个，如棉花LEA D7蛋白，多的则有几十个，如油菜LEA 76蛋白(13个)，大豆cDNApGmPM8和pGmPM10编码蛋白含有超过30个相连的基元序列。该组蛋白可依其基元序列的羧基端有无特定的氨基酸延伸区段可分为两种类型，一类是11个氨基酸组成的重复基元序列被与之相似的序列所分离，称第3组LEA蛋白(I)，如大麦的HVA1与小麦的PMA2005，胡萝卜的DC3和棉花的D7；另一类是在羧基末端被特定氨基酸延伸区段的出现而分隔，称第3组LEA蛋白(II)，如小麦的PMA1949，胡萝卜DC8和大豆的pGmPM2等。
在干旱脱水过程中细胞液的离子浓度会迅速升高。高强度的离子浓度会造成细胞的不可逆伤害。第3组LEA蛋白中的11个氨基酸残基组成的基元序列可形成兼性α2螺旋结构，提供一个具疏水条区的亲水表面，螺旋的疏水面可形成同型二聚体，处在亲水表面的带电基团可螯合细胞脱水过程中浓缩的离子，如Na+和PO3-4。此外，组成该蛋白的大多数氨基酸残基为碱性、亲水性氨基酸，无半胱氨酸和色氨酸，这些高电荷的氨基酸残基可以重新定向细胞内的水分子，束缚盐离子，从而避免干旱胁迫时细胞内高浓度离子的累积所引起的损伤，同时也可防止组织过度脱水。
目前，在多种植物中都有关于第3组LEA蛋白或基因的研究报道。这些基因的表达或蛋白累积与植物的渗透胁迫抗性正相关。萌芽3天的大麦幼苗经011mmol/LABA或干旱处理后，幼苗的所有器官中均有高水平的HVA1 mRNA和蛋白质出现，它可被干旱等环境胁迫和ABA诱导表达。Xu等将HVA1 cDNA全序列导入水稻，获得了抗旱、抗盐的转基因水稻，从而直接证实了第3组LEA基因可能具有干旱保护功能。
经检索，未发现任何公开或报道过长春花LEA蛋白的基因序列及氨基酸序列。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种来自于长春花的第三组LEA蛋白的核苷酸序列，其特征在于，它包括编码据有LEA(晚期胚胎发生丰富蛋白)第3组的LEA蛋白的功能区序列，它包含6个由11个氨基酸残基构成的基元序列。所述的核苷酸序列与胡萝卜LEA DC3有69％的同源性，与鸡豆LEA蛋白同源性达51％。
本发明的第二目的在于提供一种快速获得胁迫相关基因全长序列的方法。
本发明的cDNA分子是通过如下的方法获得的首先通过测定植物叶片水势来寻找植物中度胁迫的处理条件。使植物干旱胁迫下表达蛋白的丰度富集。
其次，采用最适处理材料进行总RNA的提取及mRNA的纯化，用mRNA进行全长cDNA表达文库的构建。构建后cDNA处于真核表达载体质粒pCMV上，可直接进行克隆cDNA的表达文库的筛选。
最后，采用3730测序仪，对随机挑选的克隆进行测序。EST标签在与NCBI数据库进行比对后，对相关克隆测通全长，得到完整的LEA基因的完全编码序列。
本发明的重要应用价值在于该基因在抗旱过程中具有以下优点LEA蛋白作为脱水保护剂，一方面与胞内的其他蛋白发生作用，使他们的结构保持稳定，另一方面为亲水的α螺旋结构，给细胞内的束缚水提供一个结合衬质，使细胞在脱水中免受迫害；并存在着周期性的荷电离子空间结合位点，在脱水时荷电离子结合于这些位点，从而缓冲了因脱水使离子强度提高造成的细胞伤害；另外，它是植物渗透调节机制的一部分是糖醇、脯氨酸、甜菜碱等渗透调节物质合成和运输的调节蛋白，因而LEA蛋白具有较强的抗旱能力，区别与其他基因单一调节的抗旱机制。
图1是不同植物来源LEA蛋白的同源性比对2是长春花与胡萝卜LEA蛋白的同源性比对图及基元序列
具体实施例方式实施例1 长春花抗旱基因晚期胚胎丰富蛋白全长基因的克隆步骤1，植物材料处理长春花幼苗播种在珍珠岩中，在光照培养箱中培养，每天浇水，取1个月苗龄的长春花植株在光培箱中自然脱水，没隔一小时测叶片水势及渗透势，以达-1.0MPa为标准取材。取叶片液氮速冻，立即放入-70度的超低温冰箱中。
步骤2，总RNA的提取及mRNA的纯化1.利用Trizol(Gibco)一步法提取总RNA，根据试剂盒说明书步骤进行。对总RNA定量并进行变性电泳质量分析。
2.mRNA的纯化利用Oligotex mRNA Purification Kit(Qiagen)从总RNA中纯化mRNA并进行定量。
步骤3，λZAPExpresscDNA文库的构建(Stratagene)1.cDNA第一链的合成(1)冰上建立如下体系5.0μL 10×buffer 3.0μLdNTP Mix，2.0μL Link-Primer 12.5μL DEPC-H2O，1.0μLRNAsin，混匀，加入mRNA 5μg，加入1.5μL反转录酶。
(2)轻轻混匀，42℃温育1hr。
2.cDNA第二链的合成(1)在第一链反应体系中顺序加入20μL 10×buffer，6.0μL dNTP Mix，116μLDEPC-H2O，2.0μL RNAseH(1.5U/μL)，11.0μL DNA polymerase I(9.0U/μL)(2)置16℃水浴保温2.5hr。
3.cDNA末端补平(1)冰上加如下试剂23μL dNTP Mix，2.0μL pfu DNA pol(2.5U/μL)。
(2)72℃温育30min。
(3)用200μL酚/氯仿抽提一次，室温高速离心2min，转上清于另一新管中。
(4)用等体积氯仿抽提一次，转上清于另一新管中。
(5)加20μL 3mol/LNaAc，400μL 100％乙醇，混匀，-20℃过夜。
(6)4℃ 16000g离心60min，收集cDNA沉淀。
(7)加500μL 70％乙醇轻轻洗。
(8)全速离心2min，室温下抽真空使沉淀干燥。
(9)沉淀重悬于9.0μL EcoR I adapters中。4℃保温至完全溶解。
4.EcoR I衔接子的连接(1)顺序加入1.0μL 10×buffer(Ligase Buffer)。
1.0μL 10mmol/L rATP1.0μL T4DNA ligase(4U/μL)4℃连接2天.
(2)70℃水浴30min，以灭活Ligase.
5.EcoR I连接子末端的磷酸化.
(1)室温离心2s并放置5min，加入1.0μL 10×Ligase Buffer2.0μL 10mmol/L rATP5.0μL sterile H2O2.0μL T4 Kinase(5U/μL)37℃保温30min。
(2)70℃加热30min灭活Kinase6.Xho I消化加入下列成分28.0μL Xho I buffer3.0μL Xho I(40U/μL)37℃保温1.5hr。
7.载体连接7.1使用Wizard SV Gel and PCR CLEAn System kit(Promega)回收cDNA片段，对回收的cDNA进行EB定量。
7.2 cDNA与ZAP Express Vector连接在1.5ml离心管中加入
2.0μL重悬cDNA0.5μL 10×ligase buffer0.5μL 10mM rATP1.0μL ZAP Express Vector0.5μL ddH2OT4 DNA ligase(4U/μL)0.5μL，4℃连接2天。
8.λ重组DNA的体外包装(1)加入目的DNA 100ng至包装蛋白中，混匀，离心汇于管底。
(2)22℃温育2hr后，加入500μL SM Buffer，在加20μL氯仿，轻轻混匀。
9.λ噬菌体的转染9.1噬菌体文库滴度的测定(1)划线培养XL1-blue MRF’，37℃过夜，培养基为LB(含12.5μg/ml Tet).
(2)接种至LB broth，30℃，200rpm过夜摇(OD＜1)，1000×g离心收集菌体，加10mmol/L MgSO4重悬菌体至OD600＝0.5。
(3)在上述包装体系中各取1.0μL做一系列稀释，即1→10-2→10-4，各取1.0μL稀释液于宿主菌中，吸附15min后，加3mL顶层琼脂，迅速铺在提前育温至37℃的底层琼脂，待凝固后37℃过夜倒置培养.
(3)待噬菌斑长出后，计算滴度。经检测，初级文库的库容达到1×106pfu/ml。
9.3噬菌体文库的扩增(1)宿主菌制备同前。
(2)铺好板后37℃过夜倒置培养。噬菌斑不超过1～2mm。
(3)用4mL SM Buffer涂盖菌板，4℃贮存过夜。
(4)吸出SM Buffer于无菌管中，在加1mL SM Buffer洗菌板一次，吸到管中加氯仿至终浓度5％，混匀置室温培养15min，500g离心10min，移走细胞碎片。
(5)转上清于另一管中，加氯仿至终浓度0.3％，4℃存放。
(6)测滴度。经扩增，文库的滴度达1×108pfu/ml10噬菌体文库的体内剪切(1)划线培养XL1-blue MRF’和XLOLR菌于LB培养基(含12.5μg/ml Tet).挑单菌落接种至50mL LB broth，30℃，200rpm过夜培养。
(2)1000×g离心收集XL1-blue MRF’和XLOLR cells，用10mM MgSO4重悬至OD600＝1。
(3)在离心管中加入100倍于初级库的噬菌体量。按10∶1(cells-to-lambdaphage)加入宿主菌XL1-blue在按(10∶1 helper phage-to-cells ratio)加入辅助噬菌体。
(4)37℃吸附15min，加20ml NZY broth with supplements，37℃摇培3hr，65℃热激20min，1000×g离心10min，转上清于另一管中。
(5)测滴度取上清1.0μL分别加到200μL XLOLR菌中，37℃吸附15min，再加200μL NZY broth 37℃摇培45min。
(6)从中取出100μL铺LB(50μg/ml，kana)37℃过夜培养，得到菌落。
11应用PCR反应体系检测平均插入片段的长度取载体引物，挑单克隆进行PCR验证插入片断，PCR反应条件为95.0℃预变性5min，然后94.0℃变性30s，50.0℃模板退火30s，72.0℃延伸2min，共30个循环，最后，72.0℃最终延伸7min，反应结束后，取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。经检验，平均插入片断长为1.2kb。
步骤4，采用3730测序仪进行测序(ABI)采用T7引物进行单向测序，每个反应可达800-1200bp。得到的EST序列进入NCBI进行比对后，对干旱胁迫相关基因质粒测通，得到全长基因序列。
实施例2 长春花LEA的序列信息与同源性分析以下部分为克隆的长春花LEA蛋白的核苷酸序列ggcacgaggc aaaatcaaag tcgaatcgat cgagtttaat attcttcagc aagtaagttt 60ggattagtta attaattact catagttaaa ttaacagtag agagagaaag taagcgcagt120gcaaaaatgg catcccacga gcagagctat aaagctggtg aagccaaggg tcaagctcag180gaaaaaactg gccaaatgat gggcgacgta aaggagaaga ctcaacaagc caaagacaag240gcttccgaaa cagcccagtc ggcacaaggc cgtgcgcagg agaagaaaga tcaaaccggc300agttacgtct cggacaaagc cggcgctgca aaggacaagc tttcagagac tactcaatct360gcaaaagaga gagcttctgg agcagctgaa gctacaaagc aaaaggcatc ggaaatggca420caatcgggca aagagacagc agaggcaggg aaagagaaga caggtgggtt tctgcagaag480acaggtgaac aagttaaagg catggctcaa ggtgctgctg atgctgtgaa acataccttt540ggtatggctg aaagtgagga aggtttcgaa aataagggcg gagcggcaga agccacgggg600aggaagcgta taacttgagt tattttgggg agaaatggtg ttcgatttcc ttggtttctt660tgttgatttc tgggttaatt tcggtatttc ttgatgttta tgcacctgaa tgatgatacc720tcatctgttt cctttgaggt attgctgtac gttgtatgaa taaatactga gttctcttgg780taataatatt gtagaatttc tattcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa829全编码序列为从127位的atg到618位的tga。第806位具有polyA附加信号。其编码的氨基酸序列为MASHEQSYKAGEAKGQAQEKTGQMMGDVKEKTQQAKDKASETAQSAQGRAQEKKDQTGSYVSDKAGAAKDKLSETTQSAKERASGAAEATKQKASEMAQSGKETAEAGKEKTGGFLQKTGEQVKGMAQGAADAVKHTFGMAESEEGFENKGGAAEATGRKRIT
LEA没有假定的保守域，由11个氨基酸残基构成的基元序列是第3组LEA蛋白的结构特征。该基元序列是亲水亲脂兼的，呈α-螺旋结构，是形成第3组LEA蛋白高级结构的基础，是其具有抗旱功能的基础。同源性比对分析结果标明，与胡萝卜(Daucus carota)全长基因Lea Dc3同源性高达69％，与鸡豆(Cicer arietinum)LEA蛋白同源性达51％。
本发明从长春花中分离该基因，即从新的物种中分离该基因，因而具有创新性；长春花属耐干旱、耐盐碱植物，因而预知该基因有更强的抗旱、耐盐碱功能，有更新的实用价值。
权利要求
1.一种编码长春花抗旱基因晚期胚胎丰富蛋白(Late Embryogenesis Abundant Protein，LEA)的核苷酸序列，其特征在于它具有如下的核苷酸序列及相应的氨基酸序列ggcacgaggc aaaatcaaag tcgaatcgat cgagtttaat attcttcagc aagtaagttt60ggattagtta attaattact catagttaaa ttaacagtag agagagaaag taagcgcagt120gcaaaaatgg catcccacga gcagagctat aaagctggtg aagccaaggg tcaagctcag180gaaaaaactg gccaaatgat gggcgacgta aaggagaaga ctcaacaagc caaagacaag240gcttccgaaa cagcccagtc ggcacaaggc cgtgcgcagg agaagaaaga tcaaaccggc300agttacgtct cggacaaagc cggcgctgca aaggacaagc tttcagagac tactcaatct360gcaaaagaga gagcttctgg agcagctgaa gctacaaagc aaaaggcatc ggaaatggca420caatcgggca aagagacagc agaggcaggg aaagagaaga caggtgggtt tctgcagaag480acaggtgaac aagttaaagg catggctcaa ggtgctgctg atgctgtgaa acataccttt540ggtatggctg aaagtgagga aggtttcgaa aataagggcg gagcggcaga agccacgggg600aggaagcgta taacttgagt tattttgggg agaaatggtg ttcgatttcc ttggtttctt660tgttgatttc tgggttaatt tcggtatttc ttgatgttta tgcacctgaa tgatgatacc720tcatctgttt cctttgaggt attgctgtac gttgtatgaa taaatactga gttctcttgg780taataatatt gtagaatttc tattcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa829MASHEQSYKAGEAKGQAQEKTGQMMGDVKEKTQQAKDKASETAQSAQGRAQEKKDQTGSYVSDKAGAAKDKLSETTQSAKERASGAAEATKQKASEMAQSGKETAEAGKEKTGGFLQKTGEQVKGMAQGAADAVKHTFGMAESEEGFENKGGAAEATGRKRIT
2.一种如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于127bp处具有起始密码子ATG，618bp处具有终止密码子TGA，在806bp处具有polyA附加信号。该序列无内含子，具有492bp完整的开放读码框，编码163个氨基酸。
3.一种如权利要求1所述的长春花晚期胚胎丰富蛋白的核苷酸序列的克隆方法，其特征在于首先使用适度的干旱处理条件，使植物抗旱基因表达富集；然后通过构建全长的cDNA文库，及测序，在最短的时间内得到抗旱相关的全长胁迫基因。获得的抗旱基因直接构建在真核表达载体pCMV质粒上，可通过真核生物表达来直接进行筛选。基因可以使用t3、t7通用引物进行测序。
全文摘要
一种长春花第三组晚期胚胎丰富蛋白及其编码产物的氨基酸序列。它涉及一种新的基因序列。其特征在于该基因全长829bp，在127bp处具有起始密码子ATG，618bp处具有终止密码子TGA，在806bp处具有polyA附加信号。该序列无内含子，具有492bp完整的开放读码框，编码163个氨基酸。所述的核苷酸序列与胡萝卜LEADC3的同源性达69％的，与鸡豆晚期胚胎丰富蛋白同源性达51％。它包含6个由11个氨基酸残基构成的基元序列。本发明还提供了一种快速得到全长胁迫基因的方法。首先使用适度的干旱处理条件，使植物抗旱基因表达富集；然后通过构建全长的cDNA文库及测序，在最短的时间内得到抗干旱胁迫相关的全长基因。获得的抗旱基因直接构建在真核表达载体pCMV质粒上，可使用t3、t7通用引物进行测序。同时，可通过真核生物表达来直接进行筛选。本发明从植物cDNA中分离出了第三组晚期胚胎丰富蛋白的全长基因，该基因具有较强的抗旱功能，同时，对植物耐寒、耐盐性方面也起到重要的作用。该基因的克隆扩大了植物抗旱研究的基因资源，为运用基因工程技术提高植物抗干旱胁迫及品质改良提供了更加丰富的优良候选基因。
文档编号C12N15/29GK1687417SQ200510009938
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月27日 优先权日2005年4月27日
发明者祖元刚, 聂明珠, 于景华, 唐中华, 王慧梅, 郭晓瑞, 房思梁 申请人:东北林业大学, 祖元刚