专利名称：长春花谷胱甘肽转移酶的基因序列的制作方法
所属领域本发明属于生物基因领域，具体涉及长春花干旱胁迫相关基因谷胱甘肽转移酶的基因序列。
背景技术：
由于生态平衡失调，地球上有三分之一以上的土地面积属于干旱和半干旱的地区，因此迫切需要开发利用干旱地。研究植物的抗旱机理，应用分子生物学的方法克隆抗旱基因，运用基因工程的技术培育耐旱物种是利用干旱地的一条经济而有效的途径。
在盐、干旱等逆境条件下，植物体内活性氧清除或抗氧化能力的下降是引起活性氧大量积累、含量上升的主要原因。活性氧的积累能启动膜脂中不饱和脂肪酸的过氧化，最终导致膜脂和膜蛋白的损伤，破坏膜结构和功能稳定性，引起植物的伤害。有关逆境下活性氧积累、伤害及其清除的研究在许多植物中已有报道，这些活性氧类除了损伤蛋白质、膜脂及其它细胞组分以外，有些活性氧类还可以充当信号分子。为防止活性氧类的损伤，植物采用了谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase，GST)、超氧化物歧化酶(SOD)等重要的酶类来对体内的氧化作用进行防御，由这些酶负责催化清除植物体内的自由基。植物体内GST水平的提高不仅与植物对环境胁迫的忍耐有关，而且GST合成的增强可能是植物对环境胁迫的内在响应之一。
谷胱甘肽转移酶GSTs是一个大的基因家族，在这个基因家族中，有的对除草、脱水、热激、重金属和病原体侵染等多种逆境起作用，还有的在生长发育过程中起重要作用。紫外辐射也可强烈诱导GST表达，这些GST与细胞抗逆境基因tpm24有较高的同源性。
GSTs可催化谷胱甘肽(glutathione，GSH)与羟基自由基、膜脂的过氧化产物和DNA氧化降解产物结合，从而减少这些物质对细胞的毒害作用。植物含丰富的GSH。转基因植物中GST大量表达，增强了GSH与氧自由基、羟基自由基的结合能力，从而减少了紫外辐射产生的有毒产物的伤害作用。
谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸所组成的一种特殊的氨基酸衍生物，其活性位点为半胱氨酸的巯基。巯基的存在，使其成为细胞内强有力的还原剂。同时，在谷氨酸与半胱氨酸之间存在一个不多见的γ-肽键，能够保护GSH不被许多肽酶水解，使其具有显著的稳定性。谷胱甘肽的特殊的化学结构，使其在植物体内具有极其重要的生理作用。它是植物控制细胞重金属的重要的螯合物前体，并且是植物中重要的抗氧化剂和还原缓冲剂。此外它也具有保护基因、控制细胞分裂的氧化还原的作用。作为一种抗氧化剂，GSH可以被氧化为GSSG，GSSG又可在胞质、线粒体和叶绿体中的谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)的作用下还原为GSH，因此在植物细胞中谷胱甘肽主要以还原形式存在。
谷胱甘肽及其衍生物与一系列生理活动相关，例如还原硫的贮存和长距离运输，信号传导清除过氧化氢以及其它活性氧化合物，去除异生素(如除草剂)的毒性，激活并缀合苯丙酮和激素以及作为底物合成植物螯合肽等。当前对植物谷胱甘肽的研究主要集中在两个方面，一是GSH的生物合成是如何被调控的，另一是胞内GSH水平和氧化还原状态是如何与环境胁迫相适应的。
转GST/GPX烟草的结果表明过量表达GST/GPX，无论是在胁迫条件下还是在对照条件下都可以使转基因烟草的生长提高。这种表型特征是和在胁迫条件下植物保持高水平的代谢活动和低水平的脂类过氧化作用联系在一起的。这些结论表明由GST/GPX提供的过氧化物清除能力的提高在防止植物遭受由于胁迫诱导产生的氧化损伤的过程中可能是一个关键因子。
经检索，未发现任何公开或报道过长春花GST蛋白的基因序列及氨基酸序列。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种来自于长春花的第三组LEA蛋白的核苷酸序列，其特征在于，它包括编码据有GST的功能区序列。所述的核苷酸序列与与辣椒全长基因GST1同源性高达67.7％，以及大戟属植物全长基因GST同源性高达57.7％。
本发明的第二目的在于提供一种快速获得胁迫相关基因全长序列的方法。
本发明的cDNA分子是通过如下的方法获得的首先通过测定植物叶片水势来寻找植物中度胁迫的处理条件。使植物干旱胁迫下表达蛋白的丰度富集。
其次，采用最适处理材料进行总RNA的提取及mRNA的纯化，用mRNA进行全长cDNA表达文库的构建。构建后cDNA处于真核表达载体质粒pCMV上，可直接进行克隆cDNA的表达文库的筛选。
最后，采用3730测序仪，对随机挑选的克隆进行测序。EST标签在与NCBI数据库进行比对后，对相关克隆测通全长，得到完整的GST基因的完全编码序列。
本发明的重要应用价值在于谷胱甘肽(GSH)在植物抵抗氧化胁迫中的主要作用是通过ASC-GST循环而使脱氢抗坏血酸再还原实现的。在这一途径中，作为H2O2还原的再循环中间物而存在；而GSH的高效再循环由谷胱甘肽还原酶(GST)来完成。在氧化胁迫条件下，H2O2等ROS被GSH还原，同时GSH被氧化为GSSG；而在正常生理条件下，GSSG在NADPH存在时可被GST还原为GSH，因而形成一种氧化还原循环。为防止活性氧类的损伤，植物采用了谷胱甘肽转移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)等重要的酶类来对体内的氧化作用进行防御，由这些酶负责催化清除植物体内的自由基。植物体内GST水平的提高不仅与植物对环境胁迫的忍耐有关，而且GST合成的增强可能是植物对环境胁迫的内在响应之一。
附图1不同植物来源GST蛋白的同源性比对图具体实施方法实施例1 长春花干旱胁迫相关基因谷胱甘肽转移酶全长基因的克隆步骤1，植物材料处理长春花幼苗播种在珍珠岩中，在光照培养箱中培养，每天浇水，取1个月苗龄的长春花植株在光培箱中自然脱水，没隔一小时测叶片水势及渗透势，以达-1.0MPa为标准取材。取叶片液氮速冻，立即放入-70度的超低温冰箱中。
步骤2，总RNA的提取及mRNA的纯化1.利用Trizol(Gibco)一步法提取总RNA，根据试剂盒说明书步骤进行。对总RNA定量并进行变性电泳质量分析。
2.mRNA的纯化利用Oligotex mRNA Purification Kit(Qiagen)从总RNA中纯化mRNA并进行定量。
步骤3，λZAPExpresscDNA文库的构建(Stratagene)1.cDNA第一链的合成(1)冰上建立如下体系5.0μL 10×buffer 3.0μLdNTP Mix，2.0μL Link-Primer 12.5μL DEPC-H2O，1.0μLRNAsin，混匀，加入mRNA 5μg，加入1.5μL反转录酶。
(2)轻轻混匀，42℃温育1hr。
2.cDNA第二链的合成(1)在第一链反应体系中顺序加入20μL 10×buffer，6.0μL dNTP Mix，116μLDEPC-H2O，2.0μL RNAseH(1.5U/μL)，11.0μL DNA polymerase I(9.0U/μL)(2)置16℃水浴保温2.5hr。
3.cDNA末端补平(1)冰上加如下试剂23μL dNTP Mix，2.0μL pfu DNA pol(2.5U/μL)。
(2)72℃温育30min。
(3)用200μL酚/氯仿抽提一次，室温高速离心2min，转上清于另一新管中。
(4)用等体积氯仿抽提一次，转上清于另一新管中。
(5)加20μL 3mol/L NaAc，400μL 100％乙醇，混匀，-20℃过夜。
(6)4℃ 16000g离心60min，收集cDNA沉淀。
(7)加500μL 70％乙醇轻轻洗。
(8)全速离心2min，室温下抽真空使沉淀干燥。
(9)沉淀重悬于9.0μL EcoR I adapters中。4℃保温至完全溶解。
4.EcoR I衔接子的连接(1)顺序加入1.0μL 10×buffer(Ligase Buffer)。
1.0μL 10mmol/L rATP1.0μL T4DNA ligase(4U/μL)4℃连接2天。
(2)70℃水浴30min，以灭活Ligase。
5.EcoR I连接子末端的磷酸化。
(1)室温离心2s并放置5min，加入1.0μL 10×Ligase Buffer2.0μL 10mmol/L rATP5.0μL sterile H2O2.0μL T4 Kinase(5U/μL)37℃保温30min。
(2)70℃加热30min灭活Kinase
6.Xho I消化加入下列成分28.0μL Xho I buffer3.0μL Xho I(40U/μL)37℃保温1.5hr。
7.载体连接7.1使用Wizard SV Gel and PCR CLEAn System kit(Promega)回收cDNA片段，对回收的cDNA进行EB定量。
7.2 cDNA与ZAP Express Vector连接在1.5ml离心管中加入2.0μL重悬cDNA0.5μL 10×ligase buffer0.5μL 10mM rATP1.0μL ZAP Express Vector0.5μL ddH2OT4 DNA ligase(4U/μL)0.5μL，4℃连接2天。
8.λ重组DNA的体外包装(1)加入目的DNA 100ng至包装蛋白中，混匀，离心汇于管底。
(2)22℃温育2hr后，加入500μL SM Buffer，在加20μL氯仿，轻轻混匀。
9.λ噬菌体的转染9.1噬菌体文库滴度的测定(1)划线培养XL1-blue MRF’，37℃过夜，培养基为LB(含12.5μg/ml Tet)。
(2)接种至LB broth，30℃，200rpm过夜摇(OD＜1)，1000×g离心收集菌体，加10mmol/L MgSO4重悬菌体至OD600＝0.5。
(3)在上述包装体系中各取1.0μL做一系列稀释，即1→10-2→10-4，各取1.0μL稀释液于宿主菌中，吸附15min后，加3mL顶层琼脂，迅速铺在提前育温至37℃的底层琼脂，待凝固后37℃过夜倒置培养。
(3)待噬菌斑长出后，计算滴度。经检测，初级文库的库容达到1×106pfu/ml。
9.3噬菌体文库的扩增(1)宿主菌制备同前。
(2)铺好板后37℃过夜倒置培养。噬菌斑不超过1~2mm。
(3)用4mL SM Buffer涂盖菌板，4℃贮存过夜。
(4)吸出SM Buffer于无菌管中，在加1mL SM Buffer洗菌板一次，吸到管中加氯仿至终浓度5％，混匀置室温培养15min，500g离心10min，移走细胞碎片。
(5)转上清于另一管中，加氯仿至终浓度0.3％，4℃存放。
(6)测滴度。经扩增，文库的滴度达1×108pfu/ml
10噬菌体文库的体内剪切(1)划线培养XL1-blue MRF’和XLOLR菌于LB培养基(含12.5μg/ml Tet)。挑单菌落接种至50mL LB broth，30℃，200rpm过夜培养。
(2)1000×g离心收集XL1-blue MRF’和XLOLR cells，用10mM MgSO4重悬至OD600＝1。
(3)在离心管中加入100倍于初级库的噬菌体量。按10∶1(cells-to-lambdaphage)加入宿主菌XL1-blue在按(10∶1 helper phage-to-cells ratio)加入辅助噬菌体。
(4)37℃吸附15min，加20ml NZY broth with supplements，37℃摇培3hr，65℃热激20min，1000×g离心10min，转上清于另一管中。
(5)测滴度取上清1.0μL分别加到200μL XLOLR菌中，37℃吸附15min，再加200μL NZY broth 37℃摇培45min。
(6)从中取出100μL铺LB(50μg/ml，kana)37℃过夜培养，得到菌落。
11应用PCR反应体系检测平均插入片段的长度取载体引物，挑单克隆进行PCR验证插入片断，PCR反应条件为95.0℃预变性5min，然后94.0℃变性30s，50.0℃模板退火30s，72.0℃延伸2min，共30个循环，最后，72.0℃最终延伸7min，反应结束后，取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。经检验，平均插入片断长为1.2kb。
步骤4，采用3730测序仪进行测序(ABI)采用T7引物进行单向测序，每个反应可达800-1200bp。得到的EST序列进入NCBI进行比对后，对干旱胁迫相关基因质粒测通，得到全长基因序列。
实施例2 长春花GST的序列信息与同源性分析以下部分为克隆的长春花GST的核苷酸序列ggcacgagga ttaattcttc cataatcaat cagagaaaag gaaagaaaga aaagaatggg 60gggagaagca attaaggtcc acggaagtgt tctttcccca gcggtattgc gagtttttgc120ttgtctctat gagaaagatc tgtcatcagc tgaatatgtc cctgttaata tggccactgg180agaccacaaa aaggaacctt tccttaccct aaatccattt ggtcaagtcc ctggttttga240agatggagat ctcaagctct tcgagtcaag ggcaattaac caatacatag tacaagcata300cggagacaaa ggcaatcaat tgaatttcca cgacgaccca aagaagaacg ccctcgttta360cgtatggatg gaagtagaag ctcagaggtt cgatcctgct gcatccaaat tgctattcga420actttgcata aaaccaatat taggtatgac aacaaacgat gcagttgtac aagagtacga480ggccaaatta ggagagattc ttgatgtgta cgaggctcgt ttgaagcaat ccaactattt540agctgccgat acttttacac ttgctgatct taaccatatt cctgctatta attacttgat600gggttctaaa gctaaagcag tttttgaagc aaggcctcat gtgaatgctt ggtgtgctga660tatcttggca aggcctgctt ggtctaaggt tcttgagttg cagaagaagc agtcttgata720tcattactgt ctgtccgtct tcctaattct aatggccgcc gctgccctgt gctctattta780tttgtttctg gttttttcct cctctgtact ctactattac tatgttttgg agttgataat840gttcattatc gctctcatcc tagtacttca ttaccggaat aaactccaat aaacgttgtt900atcgttatta aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 929其特征在于56bp处具有起始密码子ATG，718bp处具有终止密码子TGA，在910bp处具有polyA附加信号。该序列无内含子，具有663bp完整的开放读码框，编码220个氨基酸。其编码的氨基酸序列为MGGEAIKVHGSVLSPAVLRVFACLYEKDLSSAEYVPVNMATGDHKKEPFLTLNPFGQVPGFEDGDLKLFESRAINQYIVQAYGDKGNQLNFHDDPKKNALVYVWMEVEAQRFDPAASKLLFELCIKPILGMTTNDAVVQEYEAKLGEILDVYEARLKQSNYLAADTFTLADLNHIPAINYLMGSKAKAVFEARPHVNAWCADILARPAWSKVLELQKKQS同源性比对分析结果标明，与辣椒(Gapsicum chinense)全长基因GST1同源性高达67.7％，以及大戟属植物(Euphorbia esula)全长基因GST同源性高达57.7％。
本发明从长春花中分离出GST基因，即从新的物种中分离该基因，因而具有创新性；长春花属耐干旱、耐盐碱植物，因而预知该基因有更强的抗旱、耐盐碱功能，有更新的实用价值。
权利要求
1.一种编码长春花谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase，GST)的核苷酸序列，其特征在于它具有如下的核苷酸序列及相应的氨基酸序列ggcacgagga ttaattcttc cataatcaat cagagaaaag gaaagaaaga aaagaatggg 60gggagaagca attaaggtcc acggaagtgt tctttcccca gcggtattgc gagtttttgc120ttgtctctat gagaaagatc tgtcatcagc tgaatatgtc cctgttaata tggccactgg180agaccacaaa aaggaacctt tccttaccct aaatccattt ggtcaagtcc ctggttttga240agatggagat ctcaagctct tcgagtcaag ggcaattaac caatacatag tacaagcata300cggagacaaa ggcaatcaat tgaatttcca cgacgaccca aagaagaacg ccctcgttta360cgtatggatg gaagtagaag ctcagaggtt cgatcctgct gcatccaaat tgctattcga420actttgcata aaaccaatat taggtatgac aacaaacgat gcagttgtac aagagtacga480ggccaaatta ggagagattc ttgatgtgta cgaggctcgt ttgaagcaat ccaactattt540agctgccgat acttttacac ttgctgatct taaccatatt cctgctatta attacttgat600gggttctaaa gctaaagcag tttttgaagc aaggcctcat gtgaatgctt ggtgtgctga660tatcttggca aggcctgctt ggtctaaggt tcttgagttg cagaagaagc agtcttgata720tcattactgt ctgtccgtct tcctaattct aatggccgcc gctgccctgt gctctattta780tttgtttctg gttttttcct cctctgtact ctactattac tatgttttgg agttgataat840gttcattatc gctctcatcc tagtacttca ttaccggaat aaactccaat aaacgttgtt900atcgttatta aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 929MGGEAIKVHGSVLSPAVLRVFACLYEKDLSSAEYVPVNMATGDHKKEPFLTLNPFGQVPGFEDGDLKLFESRAINQYIVQAYGDKGNQLNFHDDPKKNALVYVWMEVEAQRFDPAASKLLFELCIKPILGMTTNDAVVQEYEAKLGEILDVYEARLKQSNYLAADTFTLADLNHIPAINYLMGSKAKAVFEARPHVNAWCADILARPAWSKVLELQKKQS
2.一种如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于56bp处具有起始密码子ATG，718bp处具有终止密码子TGA，在910bp处具有polyA附加信号。该序列无内含子，具有663bp完整的开放读码框，编码220个氨基酸。
3.一种如权利要求1所述的长春花谷胱甘肽转移酶的核苷酸序列的克隆方法，其特征在于首先使用适度的干旱处理条件，使植物抗旱基因表达富集；然后通过构建全长的cDNA文库，及测序，在最短的时间内得到抗旱相关的全长胁迫基因。获得的抗旱基因直接构建在真核表达载体pCMV质粒上，可通过真核生物表达来直接进行筛选。基因可以使用t3、t7通用引物进行测序。
全文摘要
一种长春花谷胱甘肽转移酶(Glutathione S－transferase)的基因序列及其编码产物的氨基酸序列。它涉及一种新的基因序列。其特征在于该基因全长929bp，在56bp处具有起始密码子ATG，718bp处具有终止密码子TGA，在910bp处具有polyA附加信号。该序列无内含子，具有663bp完整的开放读码框，编码220个氨基酸。所述的核苷酸序列与辣椒(Capsicum chinense)全长基因GST1同源性高达67.7％，以及大戟属植物(Euphorbia esula)全长基因GST同源性高达57.7％。本发明还提供了一种快速得到全长胁迫基因的方法。首先使用适度的干旱处理条件，使植物抗旱基因表达富集；然后通过构建全长的cDNA文库及测序，在最短的时间内得到抗干旱胁迫相关的全长基因。获得的抗旱基因直接构建在真核表达载体pCMV质粒上，可使用t3、t7通用引物进行测序。同时，可通过真核生物表达来直接进行筛选。本发明从植物cDNA中分离出了谷胱甘肽转移酶的全长基因，该基因具有较强的抗氧化功能，在植物逆境胁迫过程中表达增加，起到去除氧自由基的作用。该基因的克隆扩大了植物抗旱研究的基因资源，为运用基因工程技术提高植物抗干旱胁迫及品质改良提供了更加丰富的优良候选基因。
文档编号C12N15/54GK1687422SQ20051000993
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月27日 优先权日2005年4月27日
发明者祖元刚, 聂明珠, 于景华, 唐中华, 王慧梅, 郭晓瑞, 房思梁, 姜洋 申请人:东北林业大学, 祖元刚