专利名称：草甘膦乙酰转移酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种草甘膦乙酰转移酶基因，本发明还涉及含有草甘膦乙酰转移酶基因的质粒，以及该基因在制备转基因工程菌和培育转基因植物方面的用途。
背景技术：
草甘膦(glyphosate)是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，是全世界使用量最大的除草剂品种之一(任不凡、曹淞僧.1998.草甘膦及研究进展.农药.37(7)1-8)。
但是，草甘膦是一种非选择性除草剂，对农作物同样有着杀死作用。因此，目前往往仅在果园、胶园、非耕地中应用，或应用于免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后处理，以及出苗后定向处理。这就大大限制了草甘膦作为除草剂的使用范围和使用时间。
为在农作物生长中使用草甘膦，须培育出具有草甘膦抗性或降解性质农作物，在节省农业生产费用的同时，又能极大地提高农业生产效率。
草甘膦抑制植物莽草酸代谢过程中磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)活性，进而阻断芳香族氨基酸的生物合成而使植物死亡(S.R.Padgette et al.，inHerbicide-Resistent CropsAgricultural，Environmental，Economic，Regulatory，andTechnical Aspects，S.O.Duke，Ed.(CRC Press，Boca Raton，FL，1996)，pp.53-84)，当前全球商业化种植的所有草甘膦抗性转基因作物均为针对EPSPS所设计，是目前商业化转基因抗草甘膦作物的唯一作用机制。如美国孟山都(Monsanto)公司的Roudup Ready转基因抗草甘膦品种。
由于草甘膦可被植物体吸收，并且可能在影响植物生长发育和产量的一些分生组织中积累(W.A.Pline，J.W.Wilcut，S.O.Duke，K.L.Edmisten，R.Wells，J.Agric.Food Chem.50，506(2002))，因此使用草甘膦存在着潜在着对人的不利因素。
草甘膦能够通过N-乙酰化被有效的解毒，从而失去除草剂活性，且乙酰化的草甘膦不是EPSPS的有效作用底物。因而利用N-乙酰化的手段可能使转基因作物具有更强的草甘膦抗性，使得草甘膦在植物整个生长周期都可应用，不受生长发育阶段的限制。
发明内容
本发明的目的是筛选出一种新的草甘膦乙酰转移酶基因，并将该基因导入受体生物，使所得到的遗传工程重组生物获得耐受草甘膦的能力。
本发明的技术方案是1.通过免培养技术构建草甘膦污染土壤微生物总DNA的基因文库，用功能筛选的方法克隆得到草甘膦乙酰转移酶基因，该基因的序列如SEQ ID NO1所示，其大小为441bp；2.将上述SEQ ID NO1所示的基因片段连接到具有高效表达活性的pET28a(+)质粒载体中，构建具有完整草甘膦乙酰转移酶基因的重组质粒pETGAT；3.将含草甘膦乙酰转移酶基因的重组质粒pETGAT导入不具草甘膦抗性的受体大肠杆菌BL21，获得能够耐受草甘膦的遗传工程菌株；4.将上述SEQ ID NO1所示的基因片段连接到植物表达载体pBI121中，构建具有完整草甘膦乙酰转移酶基因的重组质粒pBIGAT；5.将含草甘膦乙酰转移酶基因的重组质粒pBIGAT导入不具草甘膦抗性的烟草品种NC89中，获得能够耐受草甘膦的遗传工程烟草植株。
实验结果表明，含有本发明所得的乙酰转移酶基因的重组大肠杆菌及转基因烟草获得了较强的草甘膦耐受能力。
本发明利用草甘膦污染土壤微生物总DNA建立元基因文库，通过功能筛选直接得到了具有草苷膦耐受能力的草甘膦乙酰转移酶基因，该酶的开发和应用将为支持草甘膦在植物上的应用提供一个可选择性的全新途径。
具体实施例方式以下实施例中所举的质粒、菌株等只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。实际上，用本发明发现的基因和方法，本领域技术人员可以得到其它多种具有草甘膦耐受能力的遗传工程菌株。
实施例中所举的质粒、菌株来源如下pET28a(+)质粒载体为Novagen公司市售产品；植物表达载体pBI121为Clontech公司市售产品；大肠杆菌JM109、受体菌E.coli BL21为北京天为时代公司市售产品。
实施例1 草甘膦污染土壤总DNA基因文库的构建1.土壤微生物总DNA的提取(方法参照微生物学报，2003年4月，vol.43，No.2)1)称取1克土壤样品，加入3ml DNA提取液混匀，再加入20ul蛋白酶K(10mg/ml)，37℃温浴30分钟，中间混匀数次。
2)加入0.3ml 20％SDS，65℃水浴2h，每隔15-20分钟颠倒混匀一次。
3)-70℃冷冻，然后65℃溶化，反复3次。
4)室温6000xg离心10分钟，收集上清于一新10ml离心管5)沉淀再加入1ml DNA提取液和0.1ml 20％SDS，旋涡10s，65℃水浴10分钟，室温6000xg离心10分钟，合并上清液。
6)重复步骤4，合并上清液。
7)加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1 v/v)混匀8)12000xg离心10分钟，上清转移至一新10ml离心管，加入0.6v/v异丙醇室温沉淀1h。
9)16000xg离心20分钟，去上清。
10)加入70％预冷乙醇洗涤，沉淀用100ul无菌去离子水重悬。
11)凝胶回收法纯化DNA利用QXII DNA纯化回收试剂盒(QIAEXII DNA Gel Extraction Kit)进行纯化回收方法，按试剂盒说明进行(附DNA提取液100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L Na3PO4，1.5mol/L NaCl，1％CTAB，pH8.0)用适量的Sau3AI稀200X对50~100μg总DNA在37℃水浴中进行部分酶切，酶切片段于0.4％的琼脂糖胶上电泳，用溴化乙锭染色后，于紫外线下切下含1~3kb片段的琼脂糖胶，放入1.5ml的离心管中，加入3~4倍体积的Binding Buffer 55~65℃水浴7min直到胶彻底溶解，置于DNA/琼脂糖溶解液到回收柱室温下10,000rpm离心1min，加入用无水乙醇稀释的Wash Buffer 750μl，室温下10,000rpm离心1min，加30~50μl超纯水到离心柱中，10,000rpm离心1min，回收DNA。PUC19质粒用限制性内切酶BamHI切沉淀回收。将回收的1-3kb酶切片段(0.3-0.9μg)、T4连接酶(3U)、载体pUC19(1.0μg)，4℃连接过夜，反应体积为10μl，将连接产物电击转化大肠杆菌Jm109，获得土壤总DNA基因文库。
2.电击转化E.coli感受态细胞制作1)挑取E.coli JM109单菌落在LB培养基中，225rpm，37℃过夜培养。
2)取2％v/v菌液重新接种于一新100ml LB培养基中，300rpm，37℃摇菌至OD6000.5-0.7(4-5×107cells/ml)。
3)冰上冷却20min，以下操作尽可能在接近0℃下进行，并且所有容器均需冰上冷却。
4)菌液转入两只50ml离心管中，4℃，4000xg，离心15min，弃上清。
5)加入50ml 10％甘油重悬菌体。
6)4℃，4000xg，离心15min，弃上清。
7)加入25ml 10％甘油重悬菌体。
8)4℃，4000xg，离心15min，弃上清。
9)加入10ml 10％甘油重悬菌体。
10)4℃，4000xg，离心15min，弃上清。
11)加入100-200μl 10％甘油(预冷)重悬菌体(细胞终浓度1-3×1010cells/ml)，40μl/管分装，液氮速冻后保存于-70℃冰箱中。
3.电击转化法建立基因文库1)取两管E.coli JM109感受态细胞(40μl)于冰上溶化。
2)分别加入1-2μl连接产物或空载体质粒，轻轻混匀，置于冰上约1min。
3)设置电击程序(pre-set protocol-E.coli)。
4)将混合液转入预冷的0.2cm电击杯中，盖上盖，放入电击池中。
5)电击(Pulse)。
6)取出电击杯，立即加入1ml LB培养基，轻轻混匀。
7)将菌液转移到预冷的1.5ml离心管中，225rpm，37℃培养1h。
8)记录电击参数，时间常数必须接近5 milliseconds。
9)培养菌液涂布氨苄青霉素平板，37℃培养。
实施例2 功能筛选草甘膦乙酰转移酶基因的方法1.将转化的细菌涂布于加入X-gal，IPTG和Amp的LB固体培养基上，16小时后得到白色的重组子菌落约10,000个，再将它们转入加入20mM草甘膦和Amp(60μg/ml)的M9固体培养基上，72小时后观察能够生长的菌落为含有草甘膦乙酰转移酶基因的克隆。阳性克隆提质粒，酶切验证，测序。
2.用碱裂解法提取质粒DNA1)将挑选的阳性克隆菌落接种到5ml液体LB培养基中，37℃200rpm振摇过夜2)取1.5ml培养液于Eppendorf离心管中，12,000rpm离心2min。
3)完全倒掉上清，用100μl溶液I(50mmol/L蔗糖，10mmol/L EDTA pH8.0，25mmol/LTris-HCl pH8.0)悬浮沉淀菌体，冰上放置5min。
4)加入现配的200μl溶液II(1％SDS，0.2mol/L NaOH)，上下颠倒数次混匀，冰上放置5min。
5)加入150μl溶液III(5mol/L KAc+11.5ml冰醋酸，补加水至100ml)，上下颠倒数次，冰上放置5min。
6)加入500μl酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，上下颠倒数次混匀。
7)12,000rpm离心10min，吸取上清，加入2倍体积预冷的无水乙醇，-70℃放置20min。
8)12,000rpm离心15min，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀。
9)冷冻抽干后，加入50μl TE溶解质粒DNA。
10)取2μl质粒DNA，用BamHI酶切检测目的片段。
实施例3 草甘膦乙酰转移酶基因的序列从基因文库中筛选到1株阳性重组子，酶切结果表明插入了一个约1Kb的片断，测序分析发现含有一个441bp的ORF序列，与已知功能活性的草甘膦乙酰转移酶基因(Genebank登录号AY597417)的核苷酸序列同源性为74.60％.
DNA核苷酸测序由上海生工生物公司完成，核苷酸和氨基酸分析软件主要为DNAman和美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blast程序。
实施例4 草甘膦乙酰转移酶基因高效表达载体质粒的构建据441bp的ORF序列设计引物，PCR扩增得到GAT基因片断，然后连接到细菌表达载体pET28a(+)上，构建含草甘膦乙酰转移酶基因的重组质粒pEGAT.
实施例5 工程菌株的构建及草甘膦耐受能力的测定将含草甘膦乙酰转移酶基因的重组质粒pEGAT经化学转化法转入不具草甘膦抗性的大肠杆菌BL21中，具体做法如下1.感受态细胞的制备及质粒的转化1)感受态细胞的制备(氯化钙转化法)a)从活化的大肠杆菌(Ecoli)BL21平板上挑取单菌落接种到含5ml的LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养2.5至3小时使菌液的OD600值达到0.4至0.6，冰上冷却培养物至0℃b)将培养物倒入无菌的1.5ml的离心管中c)4℃，4000rpm离心10mind)弃上清，收集菌体e)用预冷的0.5ml的0.1mol/l的CaCl2重悬菌体，离心，弃上清f)用预冷的0.5ml的0.1mol/l的CaCl2重悬菌体，冰浴15min，离心，弃上清g)加入200ul的预冷的0.1mol/l的CaCl2重悬菌体，冰浴放置2)质粒转化感受态细胞
a)取0.5ul质粒加于一管感受态细胞中，轻轻旋转以混匀内容物，冰上放置30minb)将离心管置于42℃水浴中热激90秒，不要晃动离心管c)讯速将离心管置于冰上，冷却2mind)加入800ul的LB液体培养基，37℃，200rpm摇床培养45mine)取50ul的培养液涂布于含卡那霉素(50μg/ml)的LB固体平板上，37℃培养12至16小时，检查转化菌落f)挑选单菌落，接种到含5ml的LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养提取质粒酶切验证为正确的转化子，然后测序证明含有草甘膦乙酰转移酶基因。
2.耐受草甘膦能力的测定以BL21菌株、含pET28a(+)空载体的BL21菌株为含pEGAT重组菌株的对照，分别挑取单菌落接种在20ml的LB培养液中，37℃ 200rpm过夜摇培；以2％的接种量分别取2ml菌液4℃，4000rpm离心洗去培养基，然后用M9液体培养基重悬，分别接种到100ml含200mM草甘膦M9液体培养基中，使其初始OD600值均为0.05，37℃ 200rpm摇培72小时测定结果表明，含pEGAT的重组菌株生长明显OD600达到0.42，而两个对照菌株均未有明显变化。
实施例6 草甘膦乙酰转移酶基因植物表达载体质粒的构建据441bp的ORF序列设计引物，PCR扩增得到GAT基因片断，然后连接到植物表达载体pBI121上，构建含草甘膦乙酰转移酶基因的重组质粒pBIGAT实施例7 转基因烟草的构建及草甘膦耐受能力的测定1.根癌农杆菌LBA4404感受态的制备1)从平板上挑取单菌落，接种到5ml YEB液体培养基(含链霉素Strep 125mg/L)，28℃、250rpm振荡培养过夜。
2)取2ml菌液，加入50ml YEB液体培养基(含Strep125mg/L)中，28℃、250rpm振荡培养至OD600约0.6左右。
3)将菌液转至50ml无菌离心管中，冰浴30min，5000rpm离心5min。
4)弃上清，沉淀用2ml 20mM CaCl2重浮，每份100μl分装到1.5ml离心管中，液氮中保存备用。
2.重组质粒DNA转入农杆菌1)将约1μg的pBIGAT质粒DNA分别加入到100μl LBA4404感受态细胞中，混匀，冰浴5min。
2)将离心管置液氮中冷冻8min，迅速转至37℃水浴中温浴5min。
3)加入1ml YEB液体培养基，在28℃摇床上250rpm复苏4～5h。
4)取适量菌液涂布到含Str(链霉素)250～300mg/L、Rep(利复平)250～300mg/L和Kan(卡那霉素)100mg/L的YEB固体培养基上，置28℃培养24～48h。
3.叶盘法转化烟草品种NC891)农杆菌的活化从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5ml YEB液体培养基中(Kan 100mg/L，Str 100mg/L，Rif 300mg/L)，振荡培养过夜；取1ml菌液接种到50ml YEB液体培养基(Kan 100mg/L，Strep 100mg/L，Rif 300mg/L)中，剧烈振荡培养至OD600为0.4~0.5(约3~4h)；5000rpm离心5min，菌体用MS0培养基(不含激素)重悬，使OD600为0.1~0.2。
2)烟草的遗传转化a)共培养将侵染过的叶块摆放在铺有2层滤纸的烟草芽分化培养基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L)上，25℃暗培养4天。
b)抗性芽的筛选将经过共培养的烟草外植体转移到抗性芽筛选培养基(MS+IAA0.5mg/L+6-BA 2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)上，2～3周后即可生芽。
c)生根待抗性芽长到1cm左右时，将其转移到生根培养基(MS+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)上，1～2周后即有不定根形成。
4.耐受草甘膦能力的测定以相同苗龄非转基因烟草NC89为对照，喷施5‰草苷膦异丙氨盐(glyphosateisopropylamine salt)水剂，结果非转基因对照表现草甘膦受害反应一天后开始萎蔫而3天候开始干枯死亡；阳性转基因植株喷施后一直表现正常生长，并未受到草甘膦伤害，表明转基因植株具有了草甘膦耐受能力。
研究结果表明，含有乙酰转移酶基因的重组大肠杆菌及转基因烟草获得了较强的草甘膦耐受能力。
附录SEQ ID N01草甘膦乙酰转移酶基因核苷酸序列atgattgacg tgaacccaat taacgctgag gatacttacg agcttagaca tagaattctt 60agaccaaacc aaccaatcga ggcttgcatg ttcgagtctg atcttcttag aggagctttc120catcttggag gttactacgg aggtaagctt atttctattg cttctttcca tcaagctgag180cattctgagc ttcaaggaca aaagcaatac caacttaggg gaatggctac tcttgaggga240tacagagagc aaaaggctgg ttcttctctt atcaagcatg ccgaggagat cctcaggaag300aggggcgccg accttctttg gtgcaacgct aggacttccg cctctggata ctacaagaag360cttggcttct ctgagcaggg agaggtgttc gacactccac ctgtgggacc ccatatcctt420atgtacaaga ggatcgcata a 44权利要求
1.SEQ ID NO1所示的DNA序列。
2.含有权利要求1所示基因的重组质粒。
3.权利要求2所述的重组质粒，是含有权利要求1所示基因在大肠杆菌表达的质粒。
4.权利要求2所述的重组质粒，是含有权利要求1所示基因在烟草中表达的质粒。
5.权利要求2或3所述的重组质粒的用途，是制备耐受草甘膦基因工程菌或制备耐受草甘膦转基因植物。
6.一种耐受草甘膦的基因工程菌，特征是含有权利要求2所述的重组质粒。
7.一种耐受草甘膦基因工程菌的制备方法，是将权利要求2所述的重组质粒转化至受体菌。
8.一种耐受草甘膦转基因植物的培育方法，是将权利要求2所述的重组质粒转化至受体植物。
9.权利要求9所述的耐受草甘膦转基因植物的培育方法，所述受体植物为烟草。
全文摘要
本发明涉及草甘膦乙酰转移酶(glyphosate N－acetyltransferase(GAT))基因及其应用。本发明筛选出了一种新的草甘膦乙酰转移酶基因，并分别将该基因导入受体菌E.coli BL21和模式植物烟草中，使所得到的遗传工程菌株及转基因烟草获得了对除草剂草甘膦的耐受能力。
文档编号C12N15/82GK1772908SQ20051008662
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月17日 优先权日2005年10月17日
发明者林敏 , 顿宝庆, 陆伟, 金丹 申请人:中国农业科学院生物技术研究所