专利名称：新型果聚糖蔗糖酶基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型果聚糖蔗糖酶基因，以及该基因所构建的工程菌株。本发明还涉及所述工程菌在发酵生产低聚果糖方面的用途。
背景技术：
果聚糖是一种果糖聚合物，聚合度较低的果聚糖是低聚果糖，具有多种应用价值。如在食品工业中可用作甜味剂和增稠剂，在制药工业中可用作血浆供体和抗肿瘤试剂；低聚果糖在化妆品和纺织品方面也有潜在的应用价值。
现有技术对果聚糖的生产是通过选择恰当的发酵果聚糖的微生物，优化发酵条件或者用基因工程方法改造发酵微生物等。所述微生物包括Streptococcus salivarius，Erwinia herbicola，Aerobacter levanicum，Bacillus spp.和Zymomonas mobilis等，可用于发酵蔗糖，得到果聚糖。
运动发酵单胞菌是一种可发酵的兼性厌氧的革兰氏阴性细菌，其具有三种蔗糖水解酶胞内蔗糖水解酶sacA(sucrase)和胞外蔗糖水解酶sacC(sucrase)及胞外果聚糖蔗糖酶sacB(levansucrase)。sacA和sacC水解蔗糖生成葡萄糖和果糖，sacB具有蔗糖水解活性和果聚糖合成活性，其水解蔗糖生成葡萄糖和果聚糖。sacB的蔗糖水解活性是运动发酵单胞菌总的蔗糖水解活性的1/3。目前常利用该菌经E-D途径对碳水化合物葡萄糖、果糖、蔗糖进行代谢，产生乙醇。
尽管在理论上可利用运动发酵单胞菌进行果聚糖的生产，但效果不好。如用野生型的运动发酵单胞菌XW101在以蔗糖为发酵底物时，产生的果聚糖是副产物，浓度很低(4.8g/l)。同时运功发酵单胞菌果聚糖蔗糖酶合成的果聚糖聚合度太高，而非真正有应用价值的低聚果糖。
发明内容
本发明的目的是制备一种新型的高产低聚果糖的工程菌，使其可用于较大量生产低聚果糖。
本发明的技术方案是制备一种新型果聚糖蔗糖酶基因，用于构建工程菌株，并用此工程菌发酵生产低聚果糖。
本发明人从运动发酵单胞菌中克隆果聚糖蔗糖酶基因sacB，对其进行定点突变后得到新型果聚糖蔗糖酶基因，将所述基因连接到表达载体中，然后导入到相应的宿主菌中，得到高产低聚果糖的基因工程菌。
上述新型果聚糖蔗糖酶基因的序列如SEQ ID NO1所示，其大小为1272bp，该基因所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示；sacB基因的序列如SEQ ID NO3所示。
实验证实，上述基因工程菌可显著提高低聚果糖(从4.8g/l到20g/l)的发酵速度及产率。
本发明进行了如下实验A运动发酵单胞菌XW101总DNA的提取本发明使用CTAB法提取运动发酵单胞菌XW101的总DNA；B果聚糖蔗糖酶基因sacB的克隆通过比较相关基因核苷酸序列，设计出果聚糖蔗糖酶基因sacB的两个特异性引物，分别是sacB-F(BamHI)5’-GGATCCGGAATGTTGAACAAAGCAG-3’和sacB-R(SalI)5’-GTCGACGGAATAGGAAGGGTGTC-3’，经PCR扩增得到1.3Kb左右的产物。将这一PCR产物与pGEM-T载体相连，转化大肠杆菌JM109，经兰白斑筛选，酶切，琼脂糖凝胶电泳进行验证；C果聚糖蔗糖酶基因sacB的定点突变设计另外两条中间引物Primer25’-AATGGCGACTGATCGTAAAGAGATAGG-3’，Primer35’-AGTCGCCATTCGACTTATGCCG-3’。分别用sacB-F(BamHI)/Primer2、sacB-R(SalI)/Primer3、sacB-F(BamHI)/sacB-R(SalI)三对引物对果聚糖蔗糖酶基因进行定点突变从而将果聚糖蔗糖酶的296位His变为Arg。将PCR扩增得到的1.3Kb产物与pGEM-T载体相连，转化大肠杆菌JM109，经兰白斑筛选，酶切，琼脂糖凝胶电泳后进行测序验证；D带有目的基因的质粒的转化及其对低聚果糖产率的影响用BamHI和SalI将连在pGEM-T载体上的果聚糖蔗糖酶定点突变基因sacB’切下来，与经BamHI和SalI完全酶切的表达载体pET28a重组，得到重组质粒pEB1’，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21，用含有卡那霉素(10μg/ml)的LB培养基筛选重组子。经测序验证果聚糖蔗糖酶定点突变基因sacB’的编码框大小为1.272Kb。
实验室中在同等条件下进行批量发酵，转化菌低聚果糖的产量为20g/l，较野生型运动发酵单胞菌XW101有明显提高，表明转化菌中重组质粒携带的果聚糖蔗糖酶定点突变基因得到了有效表达。
具体实施例方式以下实施例中所举的质粒、菌株来源如下BL21/JM109购于中科院生物所pET28a购于北京天为时代公司pGEM-T vector日本宝生物公司市售产品实施例1果聚糖蔗糖酶基因sacB的定点突变1、CTAB法提取细菌总DNA1)取单菌落接种于5ml相应的培养基中，在合适的温度下培养。根据细菌的生长率不同培养时间可由几小时到几天不等。
2)取1.0ml菌液于1.5ml离心管中，13,000rpm离心2min，弃上清。
3)沉淀重悬于1.0ml 0.85％NaCl中。
4)室温13,000rpm离心2min，弃上清。
5)沉淀重悬于550μl 1×TE中。
6)加17μl溶菌酶(35mg/ml)，37℃温育30min。
7)加3μl蛋白酶K(20mg/ml)，37℃温育30min。
8)加30μl 10％SDS，37℃温育30min。
9)加100μl 5M NaCl充分混匀。
10)加80μl CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴10min。
11)加等体积(0.7～0.8ml)氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻振荡混匀。
12)室温，13,000rpm离心10min。
13)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)轻轻振荡混匀。
14)重复第12)步。
15)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)轻轻振荡混匀。
16)重复第12)步。
17)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入0.6体积异丙醇，混匀后室温静置60min。
18)20℃13,000rpm离心20min。
19)弃上清，加500μl 70％乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)。
20)4℃15,000rpm离心20min。
21)重复洗盐两次。
22)倒置离心管，干燥DNA沉淀10～15min。
23)DNA沉淀溶于20μl无菌水中，-20℃保存备用。
2、果聚糖蔗糖酶基因的克隆PCR反应体系10×PCR buffer 2μl2.5mMdNTP 2μl50μM sacB-F 0.5μl50μM sacB-R 0.5μl模板DNA2μl(200-300ng)5U/μl Ex Taq酶0.5μl加无菌水至20μlPCR反应条件1、94℃预变性 5min2、94℃30s55℃ 1min72℃ 1min(25个循环)3、72℃10min4℃保存将PCR产物连接到pGEM-T载体上连接体系与连接反应2×buffer 5μlpGEM-T 0.5μlPCR产物3.5μlT4连接酶(3U/μl) 1μl4℃过夜连接。
转化大肠杆菌JM109，经兰白斑筛选，酶切，琼脂糖凝胶电泳后进行测序验证电击转化及兰白斑筛选感受态细胞的制备所有步骤均在冰浴条件下操作
1)挑取LB固体培养基上的新鲜单菌落，接种于20ml LB液体培养基中，37℃220rpm振荡培养2小时，菌液OD值达到0.5-0.6，冰上冷却培养物至0℃。
2)将菌液转入灭菌离心管，4℃4000g收集菌体，去上清，在吸水纸上倒置空干。
3)加入20ml的预冷10％甘油，置于冰上，不时轻轻颠倒离心管，将菌体泡溶。
4)4℃4000g收集菌体，去上清，在吸水纸上倒置空干。
5)加入10ml的预冷10％甘油，轻摇离心管，将菌体泡溶。
6)重复步骤4)7)加入10ml的预冷10％甘油，轻摇离心管，将菌液泡溶。
8)重复步骤4)9)加入200ul的预冷10％甘油，溶解菌体，分装成40ul/1.5ml离心管。
连接产物转化感受态细胞1)将电转化仪(BIO-RAD Gene PulserII System)调到2.5kV，脉冲控制器调到400Ω。
2)将2ul连接产物(水溶)加入到盛有40ul新鲜制备的或融化的冻存的感受态细胞小管中，混匀。
3)将转化混合物转移到预冷的电转化池中，吸干池的外表面，然后放入样品槽中。
4)进行脉冲电转化，然后取出电转化池，马上加入1ml LB培养液，于37℃中讯速振荡培养45min。
5)取200ul涂布于含有氨苄青霉素(50μg/ml)、IPTG(4μg/ml)、x-gal(32μg/ml)的LB平板(4μl IPTG+40μl x-gal混合后涂于平板上)上。
BamHI和SalI酶切重组载体限制性内切酶的酶切反应体系与酶切反应10×T buffer3μl10×BSA 2μlDNA样品 3μl限制性内切酶BamHI 0.5μl限制性内切酶SalI0.5μl加无菌水至20μl37℃酶切两小时，琼脂糖凝胶电泳正确后测序验证。
3、三步PCR反应对果聚糖蔗糖酶基因sacB进行定点突变PCR反应体系反应序号12PCR产物 AB CD
PCR扩增的sacB 0.5μl 0.5μl5’引物sacB-F 0.5μl Primer3 0.5μl3’引物Primer2 0.5μl sacB-R 0.5μl10×PCR buffer 2μl 2μl2.5mMdNTP 2μl 2μl5U/μl Ex Taq酶0.5μl 0.5μl加无菌水至20μlPCR反应条件1、94℃预变性 5min2、94℃30s50℃ 2min72℃ 1min(25个循环)3、72℃10min4℃保存PCR反应体系反应序号 3PCR产物 AD(sacB’)模板1AB 0.5μl模板2CD 0.5μl5’引物sacB-F 0.5μl3’引物sacB-R 0.5μl10×PCR buffer 2μl2.5mMdNTP 2μl5U/μl Ex Taq酶0.5μl加无菌水至20μlPCR反应条件1、94℃预变性 5min2、94℃30s50℃ 2min72℃ 1min(25个循环)
3、72℃ 10min4℃保存将最终得到的PCR产物与pGEM-T载体连接后转化大肠杆菌JM109，经兰白斑筛选，酶切，琼脂糖凝胶电泳后进行测序验证。连接转化及验证法同上。
4、用BamHI和SalI酶切重组质粒得到果聚糖蔗糖酶定点突变基因sacB’与相同酶切的表达载体pET28a连接，得到重组质粒pEB1’。酶切连接方法同上。
5、重组质粒pEB1’转化大肠杆菌BL21，用含有卡那霉素(10μg/ml)的LB培养基筛选重组子。转化法同上。
实施例2酶活及产物的产量测定1.培养条件1.1培养基成分蔗糖10％、酵母浸膏0.5％、蛋白胨1％、氯化钠1％、pH7.01.2培养条件37摄氏度振荡培养2酶来源及酶活性的测定2.1酶来源将按上述条件培养的细胞经3000g，4摄氏度，离心15分钟，培养液作为胞外酶，用50mM醋酸缓冲液(pH5.0)将细胞洗三次并重悬浮，超声波振荡破碎细胞，10000g，4摄氏度，离心10分钟，上清液作为胞内酶。
2.2酶活性的定义在实验条件下一分钟内水解蔗糖得到1μmol的还原糖所需的酶量定义为一个蔗糖水解酶单位。
在实验条件下一分钟内水解蔗糖得到1μg果聚糖所需的酶量定义为一个果聚糖合成酶单位。
2.3酶活性的测定反应混合物2ml酶液+2ml 5％蔗糖(溶于50mM pH5.0醋酸缓冲液中)蔗糖水解酶活性通过酶水解蔗糖释放的还原糖来测定，反应混合物30摄氏度温育30分钟，。
果聚糖合成酶活性是通过将反应混合物30摄氏度温育120分钟，540nm测生成的果聚糖的光吸收值来测定。
2.3.1蔗糖酶水解活性的测定
2.3.1.1葡萄糖标准溶液的配制准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖(预先105摄氏度干燥)，少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml容量瓶中，定容到刻度，摇匀。浓度为1mg/ml。
取九支25×250mm试管，分别按表加入试剂
将各管溶液混合均匀，沸水浴中加热5分钟，取出后立即冷却至室温，再向每管中加入10ml蒸馏水，摇匀，于540nm测A值。以葡萄糖μmol数为横轴，A值为纵轴，做标准曲线。
2.3.1.2还原糖的测定取两支试管分别加入用pH5，50mM醋酸缓冲液适当稀释过的酶液2ml，一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，使酶失活(做对照)，另一支做测定管；把两支试管和5％的蔗糖溶液都放在30摄氏度水浴中预热恒温；上述两试管中分别加入2ml 5％的蔗糖液，并准确计算时间，30分钟后于测定管中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，终止反应。从反应混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml 3，5二硝基水扬酸试剂和1.5ml水，摇匀。于沸水浴中准确反应5min，立即用冷水冷却，加去离子水稀释至10ml，摇匀，于540nm处测光密度。在723分光光度计上，可指示出光密度值所对应的葡萄糖含量，按下面公式计算酶活力蔗糖酶活力单位＝葡萄糖μmol数×9×30×酶的稀释倍数2.3.2果聚糖及果聚糖合成酶活力单位测定准确称取20mg分析纯的无水果聚糖(预先105摄氏度干燥)，少量蒸馏水溶解后，定量转移到5ml容量瓶中，定容到刻度，摇匀，浓度为4mg/ml。
取九支25×250mm试管，分别按表加入试剂
向每管中加入蒸馏水，定容至5ml摇匀，于540nm测A值。以果聚糖μg数为横轴，A值为纵轴，做标准曲线。
取两支试管分别加入用pH5，50mM醋酸缓冲液适当稀释过的酶液2ml，一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，使酶失活(做对照)，另一支做测定管；把两支试管和5％的蔗糖溶液都放在30摄氏度水浴中预热恒温；上述两试管中分别加入2ml 5％的蔗糖液，并准确计算时间，120分钟后于测定管中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，终止反应。从反应混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加去离子水稀释至10ml，摇匀，于540nm处测光密度。在723分光光度计上，可指示出光密度值所对应的果聚糖含量，按下面公式计算酶活力果聚糖合成酶活力单位＝果聚糖μg数×9×120×酶的稀释倍数3.果聚糖产量测定将发酵液经3000g，4摄氏度，离心15分钟去菌体，上清液(或将上清液用酒精沉淀，干燥，用水溶解后)于540nm处测光密度，根据标准曲线计算果聚糖产量。
4.结果分析在诱导物IPTG或乳糖存在下，酶大量分泌到胞外合成果聚糖，并在五到八小时达到最大值，最大可达20g/L，远大于野生菌运动发酵单胞菌XW101果聚糖产量(4.8g/L)。
附录SEQ ID NO1新型果聚糖蔗糖酶基因核苷酸序列atgttgaaca aagcaggcat tgcagagccg agcttgtgga ctcgtgcgga tgctatgaaa 60gtgcataccg atgatcccac ggcaaccatg cctaccattg attatgactt tcctgtcatg120accgataaat attgggtttg ggacacttgg cccttacgcg atattaacgg tcaggttgtc180ggcttccaag gttggtcggt gatctttgct ttggtcgctg atcgcaccaa atatggttgg240cataatcgca atgatggcgc cagaattggt tatttctatt cacgtggtgg aagcaactgg300atttttggtg gtcatcttct gaaagatggt gccaatccgc gttcttggga atggtctggt360tgcacgatta tggcaccggg tacggccaat tctgtcgaag tattctttac gtctgtcaat420gatacgccgt cagaatccgt tcctgcccag tgcaagggct acatctatgc cgatgataaa480tcggtatggt ttgacggttt tgataaagtg accgatctgt ttcaggcaga tggcctttat540tatgctgatt atgcagaaaa taatttctgg gatttccgcg atccgcatgt cttcattaac600cccgaagatg gcaaaacata tgccttgttt gaaggtaatg ttgccatgga gcgcggtacg660gtcgctgttg gcgaagagga aattggccct gttccaccaa aaaccgaaac gcctgatggc720gctcgctatt gtgctgctgc cattggtatt gcacaggccc ttaatgaagc ccgcaccgaa780tggaaattgt taccgccttt ggtaaccgcc tttggtgtca atgaccagac ggagcggcct840
catgtcgttt tccagaatgg cttgacctat ctctttacga tcagtcgcca ttcgacttat 900gccgatggtt tgtcgggtcc tgatggggtt tatggctttg tttctgaaaa cggcattttt 960ggcccttatg aaccgctgaa tggttccggt ttggttctcg gtaacccttc ttcacagcct1020tatcagactt attcccatta tgtgatgaca aatgggctgg tgacctcctt cattgatacc1080attccgagtt ctgacccgaa tgtctatcgt tatggtggca ccttggcacc gaccatcaaa1140ttggaattgg ttggccatcg cagcttcgtt accgaagtga agggttatgg ctatattccg1200ccacagatcg agtggttggc agaagatgaa tcttctaatt ctgcggcagc cctgtcttta1260ttgaataaat aa1272SEQ ID NO2新型果聚糖蔗糖酶基因所编码的氨基酸序列Met Leu Asn Lys Ala Gly Ile Ala Glu Pro Ser Leu Trp Thr Arg Ala1 5 10 15Asp Ala Met Lys Val His Thr Asp Asp Pro Thr Ala Thr Met Pro Thr20 25 30Ile Asp Tyr Asp Phe Pro Val Met Thr Asp Lys Tyr Trp Val Trp Asp35 40 45
Thr Trp Pro Leu Arg Asp Ile Asn Gly Gln Val Val Gly Phe Gln Gly50 55 60Trp Ser Val Ile Phe Ala Leu Val Ala Asp Arg Thr Lys Tyr Gly Trp65 70 75 80His Asn Arg Asn Asp Gly Ala Arg Ile Gly Tyr Phe Tyr Ser Arg Gly85 90 95Gly Ser Asn Trp Ile Phe Gly Gly His Leu Leu Lys Asp Gly Ala Asn100 105 110Pro Arg Ser Trp Glu Trp Ser Gly Cys Thr Ile Met Ala Pro Gly Thr115 120 125Ala Asn Ser Val Glu Val Phe Phe Thr Ser Val Asn Asp Thr Pro Ser130 135 140Glu Ser Val Pro Ala Gln Cys Lys Gly Tyr Ile Tyr Ala Asp Asp Lys145 150 155 160Ser Val Trp Phe Asp Gly Phe Asp Lys Val Thr Asp Leu Phe Gln Ala165 170 175
Asp Gly Leu Tyr Tyr Ala Asp Tyr Ala Glu Asn Asn Phe Trp Asp Phe180 185 190Arg Asp Pro His Val Phe Ile Asn Pro Glu Asp Gly Lys Thr Tyr Ala195 200 205Leu Phe Glu Gly Asn Val Ala Met Glu Arg Gly Thr Val Ala Val Gly210 215 220Glu Glu Glu Ile Gly Pro Val Pro Pro Lys Thr Glu Thr Pro Asp Gly225 230 235 240Ala Arg Tyr Cys Ala Ala Ala Ile Gly Ile Ala Gln Ala Leu Asn Glu245 250 255Ala Arg Thr Glu Trp Lys Leu Leu Pro Pro Leu Val Thr Ala Phe Gly260 265 270Val Asn Asp Gln Thr Glu Arg Pro His Val Val Phe Gln Asn Gly Leu275 280 285Thr Tyr Leu Phe Thr Ile Ser Arg His Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Leu290 295 300
Ser Gly Pro Asp Gly Val Tyr Gly Phe Val Ser Glu Asn Gly Ile Phe305 310 315 320Gly Pro Tyr Glu Pro Leu Asn Gly Ser Gly Leu Val Leu Gly Asn Pro325 330 335Ser Ser Gln Pro Tyr Gln Thr Tyr Ser His Tyr Val Met Thr Asn Gly340 345 350Leu Val Thr Ser Phe Ile Asp Thr Ile Pro Ser Ser Asp Pro Asn Val355 360 365Tyr Arg Tyr Gly Gly Thr Leu Ala Pro Thr Ile Lys Leu Glu Leu Val370 375 380Gly His Arg Ser Phe Val Thr Glu Val Lys Gly Tyr Gly Tyr Ile Pro385 390 395 400Pro Gln Ile Glu Trp Leu Ala Glu Asp Glu Ser Ser Asn Ser Ala Ala405 410 415Ala Leu Ser Leu Leu Asn Lys420
SEQ ID NO3sacB基因序列atgttgaaca aagcaggcat tgcagagccg agcttgtgga ctcgtgcgga tgctatgaaa 60gtgcataccg atgatcccac ggcaaccatg cctaccattg attatgactt tcctgtcatg120accgataaat attgggtttg ggacacttgg cccttacgcg atattaacgg tcaggttgtc180agcttccaag gttggtcggt gatctttgct ttggtcgctg atcgcaccaa atatggttgg240cataatcgca atgatggcgc cagaattggt tatttctatt cacgtggtgg aagcaactgg300atttttggtg gtcatcttct gaaagatggt gccaatccgc gttcttggga atggtctggt360tgcacgatta tggcaccggg tacggccaat tctgtcgaag tattctttac gtctgtcaat420gatacgccgt cagaatccgt tcctgcccag tgcaagggct acatctatgc cgatgataaa480tcggtatggt ttgacggttt tgataaagtg accgatctgt ttcaggcaga tggcctttat540tatgctgatt atgcagaaaa taatttctgg gatttccgcg atccgcatgt cttcattaac600cccgaagatg gcaaaacata tgccttgttt gaaggtaatg ttgccatgga gcgcggtacg660gtcgctgttg gcgaagagga aattggccct gttccaccaa aaaccgaaac gcctgatggc720gctcgctatt gtgctgctgc cattggtatt gcacaggccc ttaatgaagc ccgcaccgaa780tggaaattgt taccgccttt ggtaaccgcc tttggtgtca atgaccagac ggagcggcct840catgtcgttt tccagaatgg cttgacctat ctctttacga tcagtcatca ttcgacttat900
gccgatggtt tgtcgggtcc tgatggggtt tatggctttg tttctgaaaa cggcattttt 960ggcccttatg aaccgctgaa tggttccggt ttggttctcg gtaacccttc ttcacagcct1020tatcagactt attcccatta tgtgatgaca aatgggctgg tgacctcctt cattgatacc1080attccgagtt ctgacccgaa tgtctatcgt tatggtggca ccttggcacc gaccatcaaa1140ttggaattgg ttggccatcg cagcttcgtt accgaagtga agggttatgg ctatattccg1200ccacagatcg agtggttggc agaagatgaa tcttctaatt ctgcggcagc cctgtcttta1260ttgaataa 1268
权利要求
1.SEQ ID NO1所示的DNA序列。
2.权利要求1所示基因编码的蛋白，其序列如SEQ ID NO2所示。
3.含有权利要求1所示基因的重组质粒。
4.权利要求3所述的重组质粒，是含有权利要求1所示基因在大肠杆菌表达的质粒。
5.权利要求1所述基因的用途，是构建高产低聚果糖的基因工程菌。
6.一种高产低聚果糖的基因工程菌，特征是含有权利要求3所述的重组质粒。
7.权利要求6所述高产低聚果糖的基因工程菌的制备方法，是将权利要求3所述的重组质粒转化至受体菌。
全文摘要
本发明涉及新型果聚糖蔗糖酶基因及其用途。本发明制备了一种新型果聚糖蔗糖酶基因并构建了基因工程菌，此工程菌可用于发酵生产低聚果糖。实验证实，上述基因工程菌可显著提高低聚果糖的发酵速度及产率。
文档编号C12N9/00GK1772903SQ20051008662
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月17日 优先权日2005年10月17日
发明者林敏 , 李淑英, 张维, 徐玉泉, 陈明 申请人:中国农业科学院生物技术研究所