专利名称：一种牡丹胚状体诱导方法
技术领域：
本发明涉及组织培养技术，具体地说是涉及一种牡丹胚状体诱导方法。
背景技术：
从20世纪50年代Steward和Reinert首次发现可以从胡萝卜的体细胞离体培养物诱导产生体细胞胚(胚状体)并形成再生植株以来，人们在大量植物的组织培养、单细胞悬浮培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚胎的发生或花粉胚胎的发生。据不完全统计，40多个科150种以上的植物都已能够通过体细胞胚胎发生途径从植物组织培养物诱导胚状体发生(朱至清编著.植物细胞工程.2003，北京化学工业出版社)，其中包括被子植物几乎所有重要的科和一些裸子植物。越来越多的研究表明，在植物离体培养中，通过体细胞胚胎发生途径形成再生植株已是及其普遍的现象，并认为该发生途径是植物体细胞在离体条件下的一个基本发育途径(崔凯荣，戴若兰主编.植物体细胞胚发生的分子生物学.2000，北京科学出版社)，即植物体细胞可能具有潜在的、象有性生殖过程产生合子胚一样的全能性，这种全能性可以在适宜的培养条件下被诱导出来。在植物组织培养中，诱导体细胞胚胎发生和诱导器官分化相比具有显著的特点①胚状体在形态上具有两极性，其发育过程与合子胚的相似，就象一颗种子。胚状体一旦形成后，大多数可以生长为小植株，成苗率高，为此人们将发育一定时期的胚状体制作成人工种子，以达到快速繁殖优良种质的目的。②胚状体与母体植株间存在生理隔离现象。它一开始便是一个植物体的雏形，在适宜条件下很容易长成一个独立的植株。③胚状体的遗传性相对稳定，不太容易发生变异，因此，由它形成的植株能够保持优良种质的遗传性。④胚状体具有重演受精卵形态发生的特性，是细胞全能性表达最完全的一种方式。为此深入研究体细胞胚胎发生与发育的机制对于揭示细胞分化、发育、形态发生与合子胚发育等重大理论问题的机制以及真核细胞中基因表达和调节控制等具有十分重要的意义，也为植物品种改良、转基因受体和突变体筛选等提供了良好的无性繁殖实验体系。芍药属植物的胚胎发生是被子植物中独一无二的，因为它的合子在最初的核分裂过程中不形成细胞壁，而形成一个游离核原胚，因此，有关它们胚胎的发生与发育问题始终是学者们研究的热点。
牡丹是起源于我国的传统名花，不仅在国内花卉市场中占有重要地位，同时也是我国重要的出口花卉，在国际市场享誉很高。但它的繁殖与育种都比较困难，目前主要的繁殖方法都为无性繁殖，生产采用分株和嫁接，一般一株商品种苗的生产至少需要3年时间，而且生产门路窄、质量差、产品规格不一致，不能满足国内外市场需求；而有性繁殖——播种繁殖，由于繁殖系数大，生产上多用于选育优良新品种与培育砧木，或培育药用牡丹栽培，但牡丹种子上下胚轴都有休眠现象，自然状态下仅种子萌发就要1～2年，且萌发率较低、变化大，很难获得整齐一致的幼苗(Zilis MR et al.1976)。GA3处理虽能打破部分牡丹种子上下胚轴的休眠，使萌发时间稍有缩短(景新明等，1995)，但处理苗多数有些畸形发育，各品种还需寻找较适宜的使用浓度。我国虽然已有近千个牡丹品种，但绝大多数都是采用传统的播种方式进行多年的实生苗选育而来，远缘杂交育种在我国才刚刚起步。而牡丹远缘杂交育种在国外已有一百多年的历史，特别是欧美、日本等国在众多园艺爱好者与育种家们的努力下也已选育出上千个品质优良园艺新品种，可以说我国的牡丹育种水平已远远落后了。但无论是我国的播种实生选育，还是国外的远缘杂交育种，二者的育种周期都很长，一个良好新品种的产生至少需要10年以上。因此，对牡丹而言，其繁殖与育种的周期都较长，急需要快速、可靠的方法来改善，特别是在我国育种水平落后的情况下，要赶超他人就必须采取新技术以辅助育种。在水稻、小麦、玉米、棉花、大豆、油菜等作物中该技术的成功利用也预示了牡丹胚状体诱导及成苗技术的应用潜力，诱导率及成苗率越高、越普遍应用的市场潜力越大。
胚状体发生虽然在多种植物中均已观察到，但在观赏植物中仅见有少数诱导成功的报道，如一品红、水晶掌、长寿花、朱顶红、丽格海棠、萱草、非洲紫罗兰、风信子、水仙、唐菖蒲、苏铁、芍药、金花茶、月季(李美茹等，2003)等，在木本花卉上诱导成功的更少。芍药属植物具有多核或多细胞花粉(胚)的现象说明其具有较明显的胚状体发生潜力，在芍药中已报道从花药、花粉及合子胚培养中获得胚状体(Zenkteler M et al.1975)，但胚状体苗都不足以健壮至出瓶驯化(Brukhin V.B et al.1994)；而在黄牡丹与牡丹中获得的少量花粉胚，仅由30多个细胞组成，且始终包被花药外壁，没完成器官分化，至今没有从牡丹中获得完整胚状体及胚状体苗的报道。
发明内容
(一)、要解决的技术问题本发明的目的是提供一种从牡丹离体培养的幼胚中诱导出胚状体，并顺利培养成苗的可靠方法。
(二)、技术方案本发明为一种牡丹胚状体诱导方法，包括将外植体清洁处理、消毒后接种到启动培养基培养30-40天，移至胚状体分化培养基中培养15-70天，幼胚胚轴上产生出胚状体，胚状体器官分化完成后迅速将其分割、接种到胚状体接种培养基培养30-40天，再移至胚状体继代培养基，将生根胚状体苗4℃冷藏60-90天，再回培养室正常培养，待胚状体苗的根叶具发育良好、生长健壮时炼苗、上盆移栽。
本发明所述的牡丹胚状体诱导方法，还包括分割下来的第一代胚状体或次生胚状体接种后迅速放入4℃冰箱冷藏90天，再回培养室正常培养。
本发明所述的牡丹胚状体诱导方法，还包括在胚状体继代培养基反复继代2-3次至生根后，将生根幼苗4℃冷藏60-90天，再回培养室正常培养。
本发明所述的牡丹胚状体诱导方法，还包括将胚状体继代培养基上生根、抽芽成苗的胚状体苗在4℃冷藏至炼苗。
本发明所述的牡丹胚状体诱导方法，所述的外植体是幼胚或成熟胚。
本发明所述的牡丹胚状体诱导方法，所述的启动培养基为1/2MS+BAP 0-0.5mg/L+IAA 0-1.0mg/L+2，4-D 0-1.0mg/L+GA30-1.0mg/L+Vc 0-100mg/L+CH 0-500mg/L。
本发明所述的牡丹胚状体诱导方法，所述的胚状体分化培养基为1/2MS+BAP 0-1.0mg/L+IAA 0-1.0mg/L+GA30-0.5mg/L+Vc 0-100mg/L。
本发明所述的牡丹胚状体诱导方法，胚状体接种培养基为1/2MS+BAP 0-1.0mg/L+IAA 0-0.5mg/L+GA30-1.0mg/L+Vc 0-100mg/L。
本发明所述的牡丹胚状体诱导方法，胚状体继代培养基为1/2MS+BAP 0-1.0mg/L+IAA 0-1.0mg/L+IBA0-2.0mg/L+Vc0-100mg/L。
本发明所述的方法，所述的1/2MS培养基为MS培养基大量元素减半、Ca2+加倍。
本发明所述的方法，培养条件为培养温度25±1℃，光照16-20h/d，光强1600～2000Lx。
本发明中，培养条件培养温度25±1℃，光照16-20h/d，光强1600～2000Lx。
外植体获得从健壮植株上采得牡丹心皮拿回实验室，流水冲洗24h，经彻底刷洗清洁后剥出胚珠，拿到超净台上消毒。胚珠先用70％乙醇处理3min，灭菌蒸馏水洗3次后，再用0.2％NaClo处理15-20min，灭菌蒸馏水洗3次后，剥去种皮、破开胚乳、用解剖针挑出种胚接种。
培养基与培养条件1/2MS(Ca2+加倍)，0.5-0.6％琼脂，附加不同浓度的蔗糖及生长调节剂(PGR，见表1，表2)，PH5.8。培养条件培养温度25±1℃，光照16-20h/d，光强1600-2000Lx。
(三)、有益效果本发明是提供一个有效的牡丹幼胚离体培养诱导胚状体并将之顺利培养成苗的方法。本研究中牡丹幼胚离体培养胚状体的诱导率为10.83％，成苗率为5.1％，在特定的培养基上胚状体诱导率达到了20.0％，这在目前多数花卉胚状体的诱导中是比较少见的，如月季的胚状体诱导历经了近20年，但其诱导率也仅3％～33％左右。胚状体途径不仅是牡丹微繁潜在的非常有效的方法，而且对深入研究牡丹细胞分化、发育、形态发生与合子胚发育等重大理论问题具有十分重要的意义，也为牡丹种质的长期保存、品种改良、转基因受体和突变体筛选等提供了良好的实验体系。
本发明方法适用于多种牡丹的离体幼胚、成熟胚。可以为研究牡丹的胚胎发生提供替代系统，并为研究揭示牡丹细胞分化、发育、形态发生、个体发育等重大理论问题的机制开拓一个新的领域。该技术的推广应用还能大大提高牡丹的增殖系数，为牡丹种质的长期保存、品种改良、遗传转化、基因工程育种和突变体筛选等提供了良好有效的无性繁殖实验体系，极有可能改进传统的育种方式，缩短育种周期，在牡丹育种领域发挥巨大变革作用。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
培养基见表1和表2。
表1 培养基中生长调节剂组合
表2 胚状体接种及继代培养基组合
*表1与表2中配方相同的培养基仅列1次。
实施例1 外植体的获得从健壮植株上采得牡丹心皮拿回实验室，流水冲洗24h，彻底刷洗清洁后剥出胚珠，拿到超净台上消毒。胚珠先用70％乙醇处理3min，灭菌蒸馏水洗3次后，再用0.2％NaClO处理15min，灭菌蒸馏水洗3次后，剥去种皮、破开胚乳，用解剖针挑出种胚接种。
实施例2(1)离体胚在启动培养基Q-1上培养30天后，生根幼苗继代(I)至J-2上，培养35天，待胚状体完成器官分化，具有明显的2片小子叶时分割；(2)将分割的胚状体接种至E-2上，培养30天后，再次继代(I)至E-2上；
(3)35天后，将胚状体苗继代(II)至E’-1上；(4)将E’-1幼苗拿入冰箱4℃冷藏60天；(5)拿回培养室培养；(6)1个月后，少数胚状体苗抽芽、生根成苗。
(7)挑出根叶良好的胚状体苗开始炼苗。培养条件培养温度25±1℃，光照16h/d，光强1600Lx。
实施例3(1)离体胚在启动培养基Q-2上培养40天后，生根幼苗继代(I)至J-1上，培养35天，待胚状体完成器官分化，具有明显的2片小子叶时分割；(2)将分割的胚状体接种至E-2上，培养35天后，再次继代(I)至E-2上；(3)35天后，将胚状体苗继代(II)至E’-1上；(4)将E’-1幼苗拿入冰箱4℃冷藏90天；(5)拿回培养室培养；(6)1个月后，少数胚状体苗抽芽、生根成苗。
(7)挑出根叶良好的胚状体苗开始炼苗。
培养条件培养温度25±1℃，光照20h/d，光强2000Lx。
实施例4(1)离体胚在启动培养基Q-3上培养35天后，生根幼苗继代(I)至J-1上，培养15天，待胚状体完成器官分化，具有明显的2片小子叶时分割；(2)将分割的胚状体接种至E-4上，培养40天后，再次继代(I)至E-4上；(3)30天后，将胚状体苗继代(II)至E’-4上；(4)35天后，将已生根、抽芽成苗的胚状体苗继代(III)至E’-2上；
(5)将E’-2幼苗放入4℃冰箱冷藏至炼苗；培养条件培养温度25±1℃，光照16h/d，光强2000Lx。
实施例5(1)离体胚在启动培养基Q-3上培养30天后，生根幼苗继代(I)至J-1上，培养35天，待胚状体完成器官分化，具有明显的2片小子叶时分割；(2)将分割的胚状体接种至E-4上，培养35天后，继代(I)至E-5上；(3)35天后，将胚状体苗继代(II)至Q-3上；(4)35天后，将胚状体苗继代(III)至E’-3上；(5)将生根苗放入4℃冰箱冷藏60天，至芽抽出后拿回培养室培养；(6)挑出根叶良好的胚状体苗炼苗。
培养条件培养温度25±1℃，光照20h/d，光强1600Lx。
实施例6(1)离体胚在启动培养基Q-6上培养40天后，幼苗分二份分别继代(I)至J-3和J-4上，继代周期35天，待胚状体完成器官分化，具有明显的2片小子叶时分割；(2)将分割的胚状体分别接种至E-3与E’-2上；(3)35天后，将胚状体苗继代(I)至E’-2上；以35天为周期在E’-2继代3次，至幼苗生根；(4)将生根幼苗放入4℃冰箱冷藏90天，至抽芽后拿回培养室；(5)35天后将生根、抽芽的胚状体苗拿出培养室炼苗。培养条件培养温度25±1℃，光照20h/d，光强2000Lx。
实施例7(1)离体胚在启动培养基Q-4与Q-5上培养30天后，继代(I)至J-3上，培养35天后，再次继代(II)至J-3上，培养70天，待胚状体完成器官分化后分割；
(2)分割胚状体接种至E-6上；(3)35天后，将胚状体苗继代(I)至E’-5上；(4)35天后，将胚状体苗继代(II)至E’-2上，反复继代1次，至幼苗生根；(5)将生根幼苗继代至E-4上，反复继代1次至抽芽；(6)35天后将生根、抽芽苗拿出培养室炼苗。
培养条件培养温度25±1℃，光照20h/d，光强2000Lx。
实施例8(1)离体胚幼苗在启动培养基Q-7上培养35天后，继代(I)至J-1上，继代时间70天，胚状体完成器官分化，具有2片小子叶时分割；(2)将分割的胚状体接种至E-1上，拿入冰箱4℃冷藏90天后拿回培养室；(3)培养35天后，再继代(I)至E’-2上；(4)35天后将生根、抽芽苗拿出培养室炼苗。
(5)没抽芽的胚状体苗再继代(I)至E’-2上，至生长抽芽后炼苗。
培养条件培养温度25±1℃，光照20h/d，光强2000Lx。
表3 胚状体分化比率
胚状体分割培养后的统计见表4。
表4 胚状体培养成苗的综合统计
权利要求
1.一种牡丹胚状体诱导方法，其特征包括将外植体清洁处理、消毒后接种到启动培养基培养30-40天，移至胚状体分化培养基中培养15-70天，幼胚胚轴上产生出胚状体，胚状体器官分化完成后迅速将其分割、接种到胚状体接种培养基培养30-40天，再移至胚状体继代培养基，将生根胚状体苗4℃冷藏60-90天，再回培养室正常培养，待胚状体苗的根叶具发育良好、生长健壮时炼苗、上盆移栽。
2.如权利要求1所述的牡丹胚状体诱导方法，其特征在于还包括分割下来的第一代胚状体或次生胚状体接种后迅速放入4℃冰箱冷藏90天，再回培养室正常培养。
3.如权利要求1所述的牡丹胚状体诱导方法，其特征在于还包括胚状体在继代培养基反复继代2-3次至生根后，将生根幼苗4℃冷藏60-90天，再回培养室正常培养。
4.如权利要求1所述的牡丹胚状体诱导方法，其特征在于还包括将将继代培养基上已生根、抽芽成苗胚状体苗在4℃冷藏至炼苗。
5.如权利要求1所述的牡丹胚状体诱导方法，其特征在于所述的外植体是幼胚或成熟胚。
6.如权利要求1所述的牡丹胚状体诱导方法，其特征在于所述的启动培养基为1/2MS+BAP 0-0.5mg/L+IAA 0-1.0mg/L+2，4-D0-1.0mg/L+GA30-1.0mg/L+Vc 0-100mg/L+CH 0-500mg/L。
7.如权利要求1所述的牡丹胚状体诱导方法，其特征在于所述的胚状体分化培养基为1/2MS+BAP 0-1.0mg/L+IAA 0-1.0mg/L+GA30-0.5mg/L+Vc 0-100mg/L。
8.如权利要求1所述的牡丹胚状体诱导方法，其特征在于胚状体接种培养基为1/2MS+BAP 0-1.0mg/L+IAA 0-0.5mg/L+GA30-1.0mg/L+Vc 0-100mg/L。
9.如权利要求1所述的牡丹胚状体诱导方法，其特征在于胚状体继代培养基为1/2MS+BAP 0-1.0mg/L+IAA 0-1.0mg/L+IBA0-2.0mg/L+Vc 0-100mg/L。
10.如权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于所述的1/2MS培养基为MS培养基大量元素减半、Ca2+加倍。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于培养条件培养温度25±1℃，光照16～20h/d，光强1600～2000Lx。
全文摘要
本发明涉及一种牡丹胚状体诱导方法将外植体清洁处理、消毒后接种到启动培养基培养30－40天，移至胚状体分化培养基中培养15－70天，幼胚胚轴上产生出胚状体。胚状体器官分化完成后迅速将其分割、接种到胚状体接种培养基培养30－40天，再移至胚状体继代培养基，将生根胚状体苗4℃冷藏60－90天，再在培养室正常培养，待根和叶发育良好、胚状体苗健壮时炼苗、上盆并移栽。本发明提供了一种成功诱导牡丹体细胞胚发生并培育成苗的可靠方法，不仅为牡丹育种提供了一条新途径，而且为研究牡丹的胚胎发生提供替代系统，为研究揭示牡丹细胞分化、形态发生以及个体发育等重大理论问题的机制开拓一个新的领域。
文档编号C12N5/04GK1778169SQ20051008659
公开日2006年5月31日 申请日期2005年10月12日 优先权日2005年10月12日
发明者成仿云, 何贵梅 申请人:北京林业大学