专利名称：一种牡丹胚离体培养方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养方法，具体地说涉及一种牡丹胚离体培养方法。
背景技术：
牡丹是原产于我国的传统名花，目前为唯一的候选“国花”之望，不仅在国内花卉市场中占有重要地位，同时也是我国重要的出口花卉。但它的繁殖与育种都比较困难(Buchheim JAT et al，1992)，其中育种仍然以传统的杂交方式进行，但牡丹种子胚轴都有休眠现象，自然状态下仅种子萌发就要1～2年，且萌发率较低、变化大，很难获得整齐一致的幼苗(Zilis MR et al，1976；Barton LV et al，1957)。GA3处理虽能打破部分牡丹种子上下胚轴的休眠，使萌发时间稍有缩短(景新明等，1995)，但处理苗多数有些畸形发育(BartonLV et al，1957)，各品种还需寻找较适宜的使用浓度。牡丹从杂交获得种子，到种子萌发形成幼苗，最后开花选育出品种，至少需要10年以上的时间(成仿云等，2005)。因此，缩短育种周期已成为牡丹育种迫切需要解决的重要课题之一，离体胚培养技术提供了一条非常有价值的途径。同时，我国的牡丹品种几乎都是品种群内或品种群间的杂交选育出的，而牡丹远缘杂交育种在国外已有一百多年的历史，已发展成为今后牡丹品种改良的主要方向，我国要迎头赶上，就必须设法攻克远缘杂交败育的难题，在这个问题上，胚离体培养技术显示出巨大的应用前景。
目前，幼胚培养技术已在植物远缘杂交、克服顽拗种子休眠及发育生物学和遗传学等研究方面得以广泛应用(Raghavan V.et al2003)，该技术对提高植物种子的萌发率、缩短萌发时间和及时进行杂种胚拯救、加速育种进程与快速扩繁都有重要意义。在各类作物、果树、蔬菜及多种花卉育种中该技术的成功利用也预示了牡丹远缘杂交种胚拯救的可能性，特别是未成熟的幼胚培养，培养时期越早对杂交败育中的杂种胚拯救越有利。在牡丹中对合子胚、上胚轴及成熟种子等的离体培养已有一些报道(Demoise CF et al，1969，谢静萱，1987，Wang Het al，2001)，但成苗率仍然都较低，技术路线尚不十分成熟。幼胚离体培养至今没有报道，更缺少这一技术在育种中应用的研究。
发明内容
(一)、要解决的技术问题本发明的目的在于提供一种牡丹幼胚离体培养方法。
(二)、技术方案本发明为一种牡丹胚离体培养方法，包括以下步骤选择外植体，清洁处理、消毒后接种到启动培养基培养30-40天，移至继代I培养基中培养35-45天，再继代至继代III培养基上，连续2-3次的继代培养，温室炼苗。
本发明所述的牡丹胚离体培养方法，包括将继代II放入15±1℃左右黑暗条件下进行生根诱导15天，移至继代I培养基培养30-40天后，继代至继代III培养基。
本发明所述的牡丹胚离体培养方法，包括将继代III培养基上的生根幼苗放入冰箱4℃冷藏30-90天后，室温炼苗。
本发明所述的牡丹胚离体培养方法中，外植体为幼胚或成熟胚。。
本发明所述的牡丹胚离体培养方法中，启动培养基为1/2MS+BAP 0-0.2mg/L+IAA 0-2.0mg/L+IBA 0-1.0mg/L+GA30-1.0mg/L+Vc 0或100mg/L。
本发明所述的牡丹胚离体培养方法中，继代I培养基为1/2MS+BAP 0-0.05mg/L+IAA 0-0.1mg/L+IBA 0-0.4mg/L。
本发明所述的牡丹胚离体培养方法中，继代III培养基为1/2MS+BAP 0-0.2mg/L+IAA 0-0.2mg/L+IBA 0-0.2mg/L+Ac 0.05％。
本发明所述的牡丹胚离体培养方法中，1/2MS培养基为大量元素减半、Ca2+加倍。
本发明所述的牡丹胚离体培养方法中，培养条件培养温度25±1℃，光照16～20h/d，光强1600～2000Lx。
外植体的获得从健壮植株上采集心皮拿回实验室，流水冲洗24h，洗涤灵(白猫牌)彻底刷洗清洁后剥出胚珠，拿到超净台上消毒。胚珠先用70％乙醇处理3min，灭菌蒸馏水洗3次后，再用0.2％NaClo处理15-20min，灭菌蒸馏水洗3次后，剥去种皮、破开胚乳、用解剖针挑出种胚接种。
培养条件培养温度25±1℃，光照16-20h/d，光强1600-2000Lx。
(三)、有益效果本发明是提供一种有效的牡丹幼胚离体培养方法。它打破了牡丹种胚胚轴的休眠，使之很快萌发，在3个月内迅速培养成苗，不仅成苗率高，而且幼苗的发育速度远远高于实生苗，极有可能在田间栽培中提前开花。这就解决了常规播种选育过程中，牡丹种子萌发时间长、萌发率低、变化大，很难获得整齐一致幼苗，以及幼苗生长缓慢等一系列问题。因此，本发明应用于牡丹杂交育种中，能够大大缩短育种周期，同时在远缘杂交中可用于杂种胚拯救、克服杂交败育，从而能够提高育种效率，加速育种进程，降低育种中人力物力的投入，同时也为研究牡丹发育生物学与进行遗传学操作、控制等创造了条件。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
培养基见表1。
表1 培养基中生长调节剂组合
实施例1 外植体获得从健壮植株上采得紫斑牡丹心皮拿回实验室，流水冲洗24h，洗涤灵(白猫牌)彻底刷洗清洁后，剥出胚珠，拿到超净台上消毒。胚珠先用70％乙醇处理3min，灭菌蒸馏水洗3次后，再用0.2％NaClo处理20min，灭菌蒸馏水洗3次后，剥去种皮、破开胚乳、用解剖针挑出种胚接种。
实施例2(1)外植体启动培养基Q-1上培养30天，然后完全继代(I)至J-2上，培养42天，将J-2上真叶抽出、根长大于1.5cm的幼苗继代(II)至J”-1上；将J-2上根短于1.5cm的幼苗继代(II)至J”-2上；(2)将J”-1上幼苗4℃冷藏60天，温室炼苗；将J”-2上的生根幼苗放入4℃冰箱冷藏90天，温室炼苗；未生根幼苗弃掉。培养条件培养温度25±1℃，光照20h/d，光强1600Lx。
实施例3(1)外植体在启动培养基Q-2、3、4上培养40天后，均分成4份分别继代(I)至J-1、3、4、5上；(2)将J-3、4、5上的幼苗立即放入黑暗条件下约15±1℃进行根诱导15天；(3)然后再将幼苗又全部继代(II)至J-1上；30天后，再全部继代(III)至J”-1；(4)J”-1上生长30天后，挑出根与叶生长良好的幼苗炼苗。培养条件培养温度25±1℃，光照20h/d，光强2000Lx。
实施例4(1)外植体在启动培养基Q-5上培养40天后，均分成6份，J-1、3、4、5上分别继代(I)了1/2、1/6、1/6、1/6；(2)将J-3、4、5上的幼苗立即放入黑暗条件下15±1℃进行根诱导15天；(3)然后再将幼苗又全部继代(II)至J-1上，40天后再全部继代(III)至J”-1；(4)J”-1上幼苗生长35天后，挑出根与叶生长良好的幼苗在炼苗。培养条件培养温度25±1℃，光照16h/d，光强1600Lx。
实施例5(1)外植体在启动培养基Q-6上培养30天后，完全继代(I)至J-1上，45天后再全部继代(II)至J”-1上；(2)在J”-1上生长35天后，将生根幼苗在4℃冷藏30天后炼苗；将未生根幼苗又继代(III)至J”-1上，培养35天挑出生根苗炼苗。培养条件培养温度25±1℃，光照16h/d，光强2000Lx。
表2 紫斑牡丹幼胚培养成苗统计
表3继代(II)培养后30天幼苗各项生长指标分析(Duncan法)
权利要求
1.一种牡丹胚离体培养方法，其特征在于包括以下步骤选择外植体，清洁处理、消毒后接种到启动培养基培养30-40天，移至继代I培养基中培养35-45天，再继代至继代III培养基上，连续2-3次的继代培养，温室炼苗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于还包括将继代II放入15±1℃黑暗条件下进行生根诱导15天，移至继代I培养基培养30-40天后，继代至继代III培养基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于还包括将继代III培养基上的生根幼苗放入冰箱4℃冷藏30-90天后，室温炼苗。
4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述的外植体为幼胚或成熟胚。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的启动培养基为1/2MS+BAP 0-0.2mg/L+IAA 0-2.0mg/L+IBA 0-1.0mg/L+GA30-1.0mg/L+Vc 0或100mg/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的继代I培养基为1/2MS+BAP 0-0.05mg/L+IAA 0-0.1mg/L+IBA 0-0.4mg/L。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的继代III培养基为1/2MS+BAP 0-0.2mg/L+IAA 0-0.5mg/L+IBA 0-0.5mg/L+GA30-0.5mg/L+Ac 0.05％。
8.如权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于所述的1/2MS培养基为MS培养基大量元素减半、Ca2+加倍。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于培养条件培养温度25±1℃，光照16-20h/d，光强1600-2000Lx。
全文摘要
本发明涉及一种牡丹胚离体培养的方法外植体消毒后接种到启动培养基培养30－40天，移至继代I培养基中培养35－45天，再继代至继代III培养基上，连续2－3次的继代培养，温室炼苗。本发明提供了一种有效的牡丹幼胚离体培养方法，克服了牡丹播种繁育中种子萌发慢、萌发率低、变化大，很难获得整齐一致的幼苗以及幼苗生长缓慢等问题。
文档编号C12N5/04GK1778168SQ20051008659
公开日2006年5月31日 申请日期2005年10月12日 优先权日2005年10月12日
发明者成仿云, 何贵梅 申请人:北京林业大学