专利名称：一种观察早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种观察早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法及应用。
背景技术：
近年来，作为哺乳动物模式生物的小鼠在开展的一系列胚胎工程研究如转基因小鼠、基因敲除鼠、克隆小鼠及小鼠胚胎干细胞工程等已成为常用的研究动物，这些技术又均是建立在小鼠早期胚胎发育的观察与操作基础上的，因此熟悉并掌握其胚胎发育时程及形态结构变化就尤为重要。有关小鼠早期胚发育时程研究常用的方法是运用体视显微镜观察，也有运用大体解剖和显微操作技术对超排小鼠受精后的早期胚胎发育时程进行观察(李子义等，1999)。近年来，运用微分干涉相差显微镜可对小鼠体外受精形成的早期胚各阶段进行系统观察(逢丽丽等，2008)。由于小鼠属于子宫内发育动物，胚胎体积较小且深埋于母体生殖道中不便于相关操作和观察，因此单纯的体视显微镜观察或结合显微操作技术并不能很好的反应胚胎在生殖道内的位置关系，而微分干涉相差显微镜因对显微镜操作技术较高要求很难在一般实验室普及和推广使用。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种观察早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法及应用，通过制作不同发育时期整胚组织切片并进行标本染色，可以保证生殖道内胚胎位置的相对固定，便于观察胚胎细胞及生殖道形态位置关系和胚胎发育的连续性。本发明是通过以下技术方案来实现一种观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法，包括以下步骤I)分别将含各时期哺乳动物胚的输卵管和子宫组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中进行固定；含各时期哺乳动物胚的输卵管包括含受精卵、2-细胞胚、4-细胞胚和8-细胞胚的输卵管；含各时期哺乳动物胚的子宫组织包括含桑葚胚、早期囊胚和晚期囊胚的子宫组织；2)将固定好的输卵管和子宫组织用水冲洗后，分别经上行梯度乙醇脱水，然后经浸蜡、包埋、连续切片得到切片，再裱片于多聚赖氨酸处理的载玻片上，45 50°C温箱烤片，备染；3)烤好的切片分别以二甲苯I和二甲苯II脱蜡；然后进行下行梯度乙醇复水，并用蒸馏水浸泡；
4)将复水后的切片用苏木素伊红染色后用中性树胶封片；或对切片进行免疫荧光组织化学染色后用抗荧光淬灭封片剂封片。所述的上行梯度乙醇脱水步骤为50%乙醇脱水30s、70%乙醇脱水30s、80%乙醇脱水lmin、90%乙醇脱水lmin、95%乙醇脱水lmin、无水乙醇I和无水乙醇II各脱水lmin。所述输卵管浸腊时间12 15min,子宫浸腊时间25 30min ;所述的腊为熔点54 56°C的Leica鳞片状切片石蜡。所述下行梯度乙醇复水的步骤为无水乙醇I和无水乙醇II各lmin、95%乙醇Imin>80% 乙醇 Imin>70% 乙醇 30S。所述步骤4)中对切片进行苏木素伊红染色后用中性树胶封片的步骤为苏木精染液lOmin，体积浓度1%的盐酸酒精分化20 40S，流动自来水蓝化15min，伊红醇溶液染 色I. 5min,自来水速洗I次，乙醇脱水；二甲苯I透明5min, 二甲苯II透明5min ;中性树胶封片。所述步骤4)中对切片进行免疫荧光组织化学染色后用抗荧光淬灭封片剂封片的步骤为切片用O. l%Triton X-100处理3min,洗漆5minX3 ;封闭液4h,洗漆5minX 3 ；一抗1:100，4°C过夜，PBS 5minX5 ;二抗 l:50，2h，PBS 5minX5 ；DAPI 染核 5min，PBS 5minX5 ；抗荧光淬灭封片剂封片。所述将苏木素伊红染色后用中性树胶封片所所制备的组织切片在光镜下观察、记录，然后用数码显微镜拍照，对各时期鼠胚形态及在生殖道内位置关系依据时间次序排列，形成涵盖受精卵、2-细胞胚、4-细胞胚、8-细胞胚、桑葚胚及囊胚在生殖道内时空分布的发育图谱。所述将进行免疫荧光组织化学染色后用抗荧光淬灭封片剂封片所得的组织切片，与不加一抗的空白对照组进行对照，DMIRB型荧光相差倒置显微镜照相，得到一抗针对的抗原在小鼠体内发育各时期胚胎中表达的图谱。具体的，针对小鼠早期胚胎体内发育时空分布的组织切片，在免疫荧光组织化学染色时，采用的一抗为羊抗鼠Crb3，二抗为FITC标记的兔抗羊IgG ;得到Crb3在小鼠体内发育各时期胚胎中表达的图谱。所述的观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法在制作小鼠早期胚胎发育图谱中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法，通过制作不同发育时期整胚组织切片并进行标本染色，可以保证生殖道内胚胎位置的相对固定，便于观察胚胎细胞及生殖道形态位置关系和胚胎发育的连续性，很好的解决了由于小鼠属于胎生即子宫内发育动物，很难直接观察胚胎在生殖道内发育的问题。而单纯的体视显微镜观察或结合显微操作技术进行观察并不能很好的反应胚胎发育的持续变化及其在生殖道内的位置关系，而微分干涉相差显微镜因对显微镜操作技术要求较高很难在一般实验室普及和推广使用，所以制作不同发育时期鼠整胚组织切片并进行标本染色，可以保证胚内各个器官位置的相对固定，便于观察胚胎细胞在生殖道内位置变化和胚胎发育的连续性。此外，组织切片具有结构清晰和便于保存的优点，制成连续切片后，利于免疫细胞化学染色的抗原定位，故而在连续相邻的鼠整胚组织切片上进行免疫组化、免疫荧光及原位杂交等试验可以显示某些蛋白和基因的组织分布和细胞定位，为在细胞、分子水平上揭示胚胎发育调控机制提供了切实可行的条件，为进一步在细胞和分子水平上揭示胚胎发育调控机制奠定基础。本发明经多次重复试验共计完成500只超排小鼠排卵、受精及附植前胚胎体内发育时程与生殖道位置的时空关系研究和对比，细化了超排小鼠附植前胚胎体内发育时程与生殖道位置的时空关系，结果稳定。在空间位置上，小鼠受精卵、2-细胞胚、4-细胞胚、8-细胞胚分布于输卵管中，其中受精卵分布在输卵管的壶腹部，8-细胞胚已到达输卵管的远端部位；致密化8-细胞胚、桑葚胚、囊胚、孵出胚泡及附植后胚胎均分布在子宫中，获得了各发育时期胚胎在生殖道内时空分布的详细发育图谱。本发明提供的观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法，以昆白系小鼠为实验动物，应用胚胎显微操作和组织切片制作技术对小鼠附植前胚胎在生殖道内时空分布进行详细观察，获得系统的小鼠早期胚胎发育图谱，为进一步开展小鼠胚胎工程相关研究、胚胎发育相关基因表达和调控研究奠定基础。·
图I为输卵管壶腹部内的受精卵；图2为输卵管中的2-细胞胚；图3为输卵管内的4-细胞胚；图4为输卵管峡部的8-细胞胚；图5为子宫内的桑葚胚；图6为子宫内的早期囊胚；图7为小鼠输卵管内受精卵中Crb3的表达情况；图8为子宫内囊胚中Crb3的表达情况。
具体实施例方式下面对本发明进行详细的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本发明提供的用于观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片，在解剖学初步定位基础上，采集超排雌性动物hCG注射后不同时段的雌性生殖道，连同受精卵或胚胎进行固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、贴片和烘片处理，最后经苏木精-伊红方法染色，制作出雌性生殖道及全胚胎连续切片，在生物显微镜下观察确定超排哺乳动物排卵、受精及附植前胚胎体内发育时程与生殖道位置的时空关系，得到各发育时期胚胎在生殖道内时空分布的发育图谱。具体的，包括以下步骤I)分别将含各时期哺乳动物胚的输卵管和子宫组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中进行固定12h ；含各时期哺乳动物胚的输卵管包括含受精卵、2-细胞胚、4-细胞胚和8-细胞胚的输卵管；含各时期哺乳动物胚的子宫组织包括含桑葚胚、早期囊胚和晚期囊胚的子宫组织；2)将固定好的输卵管和子宫组织用水冲洗IOh后，分别经上行梯度乙醇脱水，然后经浸蜡、包埋、连续切片(片厚4 μ m)得到切片，再裱片于多聚赖氨酸处理的载玻片上，45 50°C温箱烤片，备染；浸蜡材料依次通过二甲苯与石蜡等量混合液、石蜡I、石蜡II和石蜡III完成浸蜡过程，石蜡I、II、III均为54-56°C的Leica鳞片状切片石蜡溶化而成，浸蜡过程在60°C温箱内进行。包埋将包埋蜡(同石蜡III)倒入包埋盒，用烧热的镊子从石蜡III中取出组织块放入其中，切面朝下，摆好位置，包埋盒内的石蜡完全凝固即形成蜡块。用解剖刀和单面刀片将包埋块修整成与组织块相似的长方形或梯形，注意组织块的切面向下。最后将修好的蜡块以组织铲固着在台木上，就可以切片了。
切片将台木块置于切片机上夹紧，调整好切片刀与组织包埋块的位置和角度，均匀转动手柄，切出连续蜡带，保存于蜡带盒内，以便贴片。3)烤好的切片以二甲苯I和二甲苯II各脱蜡5min ;然后进行下行梯度乙醇复水，并用蒸馏水浸泡2min ；4)将复水后的切片用苏木素伊红染色后用中性树胶封片；或对切片进行免疫荧光组织化学染色后用抗荧光淬灭封片剂封片。为使本发明的技术方案便于理解，以下以小鼠为例，对哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备和应用作进一步的说明。用于观察小鼠早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法，包括以下步骤(I)、小鼠胚胎模型建立及标本取材选择昆白系健康小鼠(母鼠200只，体重25 30g ；公鼠200只，体重30 35g)。室温保持在22°C，在控光条件下按常规饲养，公鼠均单笼饲养。小鼠购买回来后至少适应环境一周用于实验。雌鼠于下午5点腹腔注射PMSGdOIU/只，宁波第二激素厂)，48h后腹腔注射hCG(10IU/只，宁波第二激素厂)，当晚与雄鼠(1:1)合笼交配，次日清晨查看阴道栓。见栓记为0d，分别于相应的发育时间点取涵盖受精卵、2-细胞胚、4-细胞胚和8-细胞胚的输卵管及含桑葚胚、早期囊胚及晚期囊胚的子宫。取出的输卵管和子宫用O. lmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗净血迹，在体式显微镜下将输卵管充分拉直，分别将输卵管两头用细线系在滤纸上，子宫平铺在滤纸上，而后将固定于滤纸上的组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定12h。(2)小鼠胚胎连续石蜡切片制备固定好的含鼠胚的生殖道组织以流动自来水充分冲洗IOh后，分别经上行梯度乙醇脱水，而后浸蜡、包埋、连续切片、片厚4 μ m，裱片于多聚赖氨酸处理的载玻片上，45°C温箱烤片，备染。(3)组织切片的苏木精-伊红染色烘好的切片经二甲苯脱蜡后，依次入下行梯度乙醇复水，蒸馏水浸泡；苏木精染液IOmin, 1%盐酸酒精分化20-40S，流动自来水蓝化15min，伊红醇溶液染色I. 5min,自来水速洗I次，乙醇脱水；二甲苯I透明5min，二甲苯II透明5min ;中性树胶封片。
(4)结果观察、照相及图谱绘制将制得的鼠胚组织连续切片在光镜下观察、记录，Zeiss数码显微镜拍照，对各时期鼠胚细胞及各器官形态位置变化进行整理，并依据时间次序排列、构成涵盖受精卵、2-细胞胚、4-细胞胚、8-细胞胚、桑葚胚及囊胚在生殖道内时空分布的发育图谱。实施例I :超排小鼠早期胚胎体内发育时程及空间位置观察(I)、实验动物及超排处理选择选择昆白系小鼠母鼠(6 8周龄，体重25 28g)，公鼠(8 12周龄，体重35 40g)。在严格控光条件下(I2h昼夜节律)常规饲养，公鼠均单笼饲养。母鼠于15:00腹腔注射IOIU PMSG,间隔48h腹腔注射IOIU hCG进行超排处理。注射hCG后，随即将母鼠放入公鼠笼内同笼过夜。次日晨检查雌鼠有无阴门栓形成，阴门栓检查阳性者为假定受配母鼠，挑出待用；
(2)、小鼠胚胎体内发育时程的确定以李子义等的文献报道(李子义，谭景和，孙兴参，等.中国兽医学报.1999，19(6) :597-600.)为基础参考，在小鼠阴门栓的形成、排卵、精子入卵、原核形成、卵裂及以后各发育阶段的大概时间范围内，颈椎脱臼法处死小鼠、采集胚胎并进行检查鉴定，确定早期胚胎发育时程及时空关系。经2次试验确定小鼠受精卵及附植前胚胎的发育时间如表I所示，表I为小鼠受精卵、卵裂期及囊胚期胚胎体内发育时程；表I超排小鼠早期胚胎体内发育时程也
(3)、小鼠早期胚胎发育阶段全胚胎切片制作及染色以确定的发育时程为依据，分别于Od的13:00 14:00断颈处死小鼠，打开腹腔，取含受精卵的输卵管；ld的10:00 11:00取含2-细胞胚的输卵管，Id的23:00 00:00取含4-细胞胚的输卵管；2d的9:00 10:00取含8-细胞胚的输卵管，2d的21:00 22:00取含桑葚胚的子宫；3d的9:00 10:00和15:00 16:00取含早期囊胚和扩张囊胚的子宫。将取出的输卵管和子宫以O. lmol/L磷酸盐缓冲液(PBS液)洗净，在体式显微镜下将输卵管小心拉直，并将其两端用细线固定在滤纸上，子宫可平铺于滤纸上，将固定在滤纸上的组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定12h。(4)小鼠胚胎连续石蜡切片制备及染色
权利要求
1.一种观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)分别将含各时期哺乳动物胚的输卵管和子宫组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中进行固定; 含各时期哺乳动物胚的输卵管包括含受精卵、2-细胞胚、4-细胞胚和8-细胞胚的输卵管； 含各时期哺乳动物胚的子宫组织包括含桑葚胚、早期囊胚和晚期囊胚的子宫组织； 2)将固定好的输卵管和子宫组织用水冲洗后，分别经上行梯度乙醇脱水，然后经浸蜡、包埋、连续切片得到切片，再裱片于多聚赖氨酸处理的载玻片上，45 50°C温箱烤片，备染； 3)烤好的切片分别以二甲苯I和二甲苯II脱蜡；然后进行下行梯度乙醇复水，并用蒸懼水浸泡； 4)将复水后的切片用苏木素伊红染色后用中性树胶封片； 或对切片进行免疫荧光组织化学染色后用抗荧光淬灭封片剂封片。
2.根据权利要求I所述的观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法，其特征在于，所述的上行梯度乙醇脱水步骤为50%乙醇脱水30s、70%乙醇脱水30s>80%乙醇脱水lmin、90%乙醇脱水lmin、95%乙醇脱水lmin、无水乙醇I和无水乙醇II各脱水lmin。
3.根据权利要求I所述的观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法，其特征在于，所述输卵管浸蜡时间12 15min，子宫浸蜡时间25 30min ;所述的蜡为熔点54 56°C的Leica鳞片状切片石蜡。
4.根据权利要求I所述的观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法，其特征在于，所述下行梯度乙醇复水的步骤为无水乙醇I和无水乙醇II各lmin、95% 乙醇 lmin,80% 乙醇 lmin,70% 乙醇 30S。
5.根据权利要求I所述的观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中对切片进行苏木素伊红染色后用中性树胶封片的步骤为苏木精染液lOmin，体积浓度1%的盐酸酒精分化20 40s，流动自来水蓝化15min，伊红醇溶液染色I. 5min,自来水速洗I次，乙醇脱水；二甲苯I透明5min, 二甲苯II透明5min ；中性树胶封片。
6.根据权利要求I所述的观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中对切片进行免疫荧光组织化学染色后用抗荧光淬灭封片剂封片的步骤为切片用O. l%Triton X-100处理3min，洗涤5minX3 ;封闭液4h，洗涤5minX3 ;一抗 1:100，4°C过夜，PBS 5minX5 ;二抗 1:50，2h，PBS 5minX5 ；DAPI 染核 5min，PBS 5minX5 ;抗荧光淬灭封片剂封片。
7.根据权利要求I所述的观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法，其特征在于，将苏木素伊红染色后用中性树胶封片所所制备的组织切片在光镜下观察、记录，然后用数码显微镜拍照，对各时期鼠胚形态及在生殖道内位置关系依据时间次序排列，形成涵盖受精卵、2-细胞胚、4-细胞胚、8-细胞胚、桑葚胚及囊胚在生殖道内时空分布的发育图谱。
8.根据权利要求I所述的观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法，其特征在于，将进行免疫荧光组织化学染色后用抗荧光淬灭封片剂封片所得的组织切片，与不加一抗的空白对照组进行对照，DMIRB型荧光相差倒置显微镜照相，得到一抗针对的抗原在小鼠体内发育各时期胚胎中表达的图谱。
9.根据权利要求I所述的观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法，其特征在于，针对小鼠早期胚胎体内发育时空分布的组织切片，在免疫荧光组织化学染色时，采用的一抗为羊抗鼠Crb3，二抗为FITC标记的兔抗羊IgG ;得到Crb3在小鼠体内发育各时期胚胎中表达的图谱。
10.权利要求I所述的观察哺乳动物早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法在制作小鼠早期胚胎发育图谱中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种观察早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法及应用。所述制备方法是通过对含各时期鼠胚的输卵管或子宫组织依次进行4%多聚甲醛固定、上行梯度乙醇脱水、浸腊、包埋、连续切片、烘烤、脱腊、下行梯度乙醇复水，最后对切片内组织进行苏木素伊红染色后用中性树胶封片或对切片进行免疫荧光组织化学染色后用抗荧光淬灭封片剂封片。本发明的组织切片可以用于制作小鼠早期胚胎发育图谱，也可用于Crb3在小鼠体内发育各时期胚胎中表达的检测。本发明具有可以保证胚内各个器官位置的相对固定，便于观察胚胎细胞在生殖道内位置变化和胚胎发育的连续性和结构清晰、便于保存的优点。
文档编号G01N1/28GK102944456SQ20121043971
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者卿素珠, 张为民, 徐永平, 杨媛媛, 袁苏雅, 徐金霞, 姬丽娜 申请人:西北农林科技大学