专利名称：一种尺寸和性质可控的微型酶反应器及其制备方法
技术领域：
本发明属于固定化酶技术，特别是提供了一种尺寸和性质可控的微型酶反应器及其制备方法。
背景技术：
固定化酶技术作为一门交叉学科技术，在生命科学、生物医学、食品科学、化学化工及环境科学领域得到了广泛应用。固定化酶技术是基于游离酶不稳定、易于流失、不易与底物分离、难以重复利用、单次使用成本高昂等缺点而发展起来的一门技术，它通过将酶固载到载体上来克服游离酶以上缺点，并不断寻求更完善的固定化方法、更优良的固定化载体。目前酶固定方法可分为吸附法，共价偶联法，交联法，和包埋法四大类。吸附法虽具有条件温和、操作简便及吸附剂可反复使用等优点，但其吸附力弱，易解吸脱落。共价偶联法表现出良好的稳定性但共价偶联反应容易使酶变性而失活；交联法更易使酶失活；包埋法可获得较高的酶活力回收，其缺点是不适用于高分子量底物的传质和用于柱反应系统，且常有扩散限制等问题。上述各种固定化酶的方法所表现出的不足之处限制了其广泛应用，所以，研制开发简便、实用的固定化方法，设计、合成和应用性能优异的新型酶固定化材料是目前固定化酶研究的重点之一。
近年来，纳米尺寸多孔材料科学作为纳米材料学科领域中的一个新兴的、前沿的学科分支，已经成为国际上跨化学、物理、材料等多学科的研究热点前沿领域之一。其分为金属多孔材料(即常说的泡沫金属)和非金属多孔材料(如介孔材料、泡沫塑料和多孔玻璃等)，新型的多孔材料显著特点是具有规则排列、大小可调的孔道结构及高的比表面积和大的吸附容量，在大分子催化、吸附与分离、纳米组装及生物化学等众多领域具有广泛的应用前景。现今，研究人员依靠纳米多孔材料的以上特点，实现对酶分子的固定化，提高酶固载量、酶稳定性、酶活性。
发明内容
本发明在于提供一种尺寸和性质可控的微型酶反应器的制备方法，实现了对具有纳米尺寸孔道的多孔材料的酶固载量进行调变、性能优化，为酶/载体分子水平设计与控制的开发应用、工业化生产提供可能。提出调变纳米多孔材料表面官能团种类与数量的方法，固载酶后，构筑一种尺寸和性质可控的微型酶反应器。
本发明的微型酶反应器组成为以具有纳米尺寸孔道的多孔材料作为载体，将酶固载于纳米孔内；结构为具有一维或三维直通孔结构，酶分子通过物理或化学作用固载孔内；性能特性为微型酶反应器尺寸、表面官能团种类与数量、固载酶量可调控。
一种制备微型酶反应器的方法，其特征在于具体制备步骤为
a、采用水热合成法，即将纳米结构材料骨架元素源、模板剂、去离子水、盐酸按照物质的量/物质的量/物质的量/质量比为1∶2.1～3∶6～10∶6～10(mol/mol/mol/kg)混合搅拌24h，控制搅拌速度使混合均匀且不产生气泡，将溶液转移至水热合成反应釜中，在100℃～130℃烘箱中放置48h。然后抽滤，用去离子水洗涤。的或在水热合成法基础上加入硅烷偶联剂RnSiX4-n的原位合成法或水热合成法制备后用硅烷偶联剂RnSiX4-n再接枝的后接枝法制备纳米结构载体材料，调变载体材料孔表面官能团种类；利用溶剂萃取法或焙烧法在400～600℃下焙烧4～24h来脱除模板剂，或制备过程中将骨架元素源、硅烷偶联剂RnSiX4-n按照物质的量/物质的量比为100∶1～5(mol/mol)加入来调变纳米结构载体材料孔表面官能团数量；b、将酶、Tris-HCI缓冲液、去离子水按照质量/体积/体积比为1∶5～7∶3～4(g/l/l)混合均匀；再将纳米结构载体材料按酶∶载体＝1∶1～2的质量比加入锥形瓶，摇匀后封住锥形瓶的瓶口，置于0～55℃的摇床中，保持摇床震荡速率50～250转/分钟震荡6～20小时，得到微型酶反应器。
所述的原位合成法或后接枝法制备纳米结构载体材料，通过加入的硅烷偶联剂RnSiX4-n，调变载体材料孔表面官能团R种类，其中R代表活性官能团，包括烷基、氨基、亚胺基、巯基、乙烯基、环氧基、酰胺基、胺烷基，X代表能够水解的烷氧基和氯离子。
一种尺寸和性质可控的微型酶反应器其特征在于RnSiX4-n选二异丙基二甲氧基硅烷偶联剂固定化酶活性最大、γ-(甲基丙稀酰氧基)丙基三甲氧基硅烷偶联剂固定化酶量最大。
所述的脱除表面含羟基、氨基等易发生官能团间脱水的纳米结构载体材料的模板剂时，采用溶剂萃取法、焙烧法在400～600℃下4～24h脱除模板剂，调变纳米结构载体材料孔表面的此类官能团数量，获得表面此类官能团数量同步递减的载体材料，酶固定量将依次降低。
步骤a纳米结构材料骨架元素源选用正硅酸乙酯，模板剂选用开链长碳表面活性剂、聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物等。
步骤a溶剂萃取法中溶剂顺序采用乙醇、四氢呋喃、四氯化碳。
步骤b中酶是指三维尺寸均小于纳米结构材料孔径的酶。
步骤b中Tris-HCI缓冲液缓冲范围pH＝7～8。
对该微型酶反应器样品的结构特征分析表明该微型酶反应器仍具有很好的长程有序一维或三维孔道结构，并实现了酶分子在纳米多孔材料孔内的固定化。
水热合成法制备纳米介孔材料，溶剂萃取法、焙烧法400～600℃下焙烧时间依次增加来脱除模板剂时，获得表面活性羟基量及羟基总量可同步递减的多孔材料，固定化酶量依次降低(如表1所示)，实现了酶固载量调控，可控性优于原位合成法和后接枝法制备得到微型酶反应器。
原位合成法或后接枝法制备表面改性的纳米多孔材料，得到微型酶反应器优于水热合成法制备微型酶反应器，酶活提高，酶活表达率、稳定性提高，实现性能优化。其原因之一是反应器表面羟基被烷基等官能团取代，使得亲油性增强，利于底物扩散，易于增加与酶分子结合力度，使得酶活及酶活表达率提高，稳定性同时增强。
原位合成法与后接枝法制备表面改性的纳米多孔材料后得到的微型酶反应器相比较，前者性能参数更好，这与前者表面改性接枝率更高有关。
微型酶反应器表面改性效果显著，如实施例8中MA改性后的微型酶反应器的固载酶量最高，对比各微型酶反应器的酶活和酶活表达率，样品6(实施例6)的酶活和酶活表达率最高，部分原因在于酶在样品6内的构象有利于酶活的发挥，另外是由于SBA-15内表面的不同硅烷偶联剂的碳链发生悬臂效应，在某种程度上保护了酶的三维构象，使得酶活升高，其中PD改性(实施例6)的微型酶反应器的碳链长度最佳。
本发明的优点在于通过调变纳米多孔材料表面官能团种类和数量，实现酶固载量的调变和固定化酶性能优化。为酶/载体分子水平设计与控制的开发应用、工业化生产提供可能。
具体实施例方式实施例1A.采用水热合成法制备纳米多孔材料SBA-15(孔径为6.6nm)，以聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物(P123)为模板剂，以正硅酸乙脂(TEOS)为硅源，合成过程为在45℃下，将2gP123溶解于10ml HCl与60ml去离子水的混合溶液中，搅拌3h，而后加入4.27gTEOS和，搅拌24h，将溶液转移至水热合成反应釜中，在100℃烘箱中放置48h。然后抽滤，用去离子水洗涤。用索氏提取器先以乙醇为溶剂回流萃取8小时，再以四氢呋喃为溶剂回流萃取8小时，然后用四氯化碳回流萃取8小时，(或者先用大量乙醇搅拌回流3d两次，后用索氏提取器回流萃取3d)最后用冰丙酮洗3次，干燥后得样品1的载体。
B.称取0.25g猪胰脂肪酶充分溶于pH＝7.4的1.25ml缓冲液和49ml去离子水中，混合后加入0.5g样品1载体，密封后放于30℃的摇床中固定化12h，摇床震荡速率保持130round/min。离心分离后得到SBA-15固定化酶样品1。
酶活测定采用2.5013g三乙酸甘油酯溶于pH＝7.4的缓冲液中充分摇匀，定容于25ml的容量瓶中得到三乙酸甘油酯乳化液。移取20ml三乙酸甘油酯乳化液放于30℃恒温水浴中，5min后加入5ml缓冲液和一定量的样品1反应30min后加入80ml无水乙醇，使酶失活，以酚酞为指示剂，用0.05mol/L的NaOH溶液滴定测定酶活。
结果见表1。
实施例2A.采用水热合成法制备纳米多孔材料SBA-15(孔径为6.6nm)，400℃在马氟炉焙烧内焙烧6h，冷却得样品2载体。
后续步骤与实施例1相同，仅将本样品(样品2)替代样品1，结果见表1。
实施例3A.采用水热合成法制备纳米多孔材料SBA-15(孔径为6.6nm)，400℃在马氟炉焙烧内焙烧12h，冷却得样品3载体。
后续步骤与实施例1相同，仅将本样品(样品3)替代样品1，结果见表1。
实施例4A.采用水热合成法制备纳米多孔材料SBA-15(孔径为6.6nm)，400℃在马氟炉焙烧内焙烧18h，冷却得样品4载体。
后续步骤与实施例1相同，仅将本样品(样品4)替代样品1，结果见表1。
实施例5A采用水热合成法制备SBA-15纳米多孔材料(孔径为8.0nm)，依实施例1步骤A中萃取方法施行。后续步骤与实施例1相同，仅将本样品(样品5)替代样品1，结果见表2。
实施例6A.采用后接枝法按照骨架元素源、硅烷偶联剂RnSiX4-n按照物质的量/物质的量比为100∶1～5(mol/mol)加入适量硅烷偶联剂二异丙基二甲氧基硅烷(PD)制备纳米多孔材料SBA-15，依实施例1步骤A中萃取方法施行。
后续步骤与实施例1相同，仅将本样品(样品6)替代样品1，结果见表2。
实施例7将实施例6中硅烷偶联剂替换成癸基三甲氧基硅烷(DE)，后续步骤与实施例5相同，仅将本样品(样品7)替代样品6，结果见表2。
实施例8将实施例6中硅烷偶联剂替换成γ-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷(MA)，后续步骤与实施例6相同，仅将本样品(样品8)替代样品6，结果见表2。
表1SBA-15微型酶反应器性能*自由酶的比活力为49.2IU/g酶
表2表面改性后的SBA-15微型酶反应器性能
权利要求
1.一种尺寸和性质可控的微型酶反应器，其特征及性能特性在于组成为以具有纳米尺寸孔道的多孔材料作为载体，将酶固载于纳米孔内；结构为具有一维或三维直通孔结构，酶分子通过物理或化学作用固载孔内。
2.一种制备权利要求1所述的微型酶反应器的方法，其特征在于具体制备步骤为a、将纳米结构材料骨架元素源、模板剂、去离子水、盐酸按照物质的量/物质的量/物质的量/质量比为1∶2.1～3∶6～10∶6～10加入，单位为mol/mol/mol/kg，采用水热合成法或在水热合成法基础上加入硅烷偶联剂RnSiX4-n的原位合成法或水热合成法制备后用硅烷偶联剂RnSiX4-n再接枝的后接枝法制备纳米结构载体材料，调变载体材料孔表面官能团种类；利用溶剂萃取法或焙烧法在400～600℃下焙烧4～24h来脱除模板剂，或制备过程中将骨架元素源、硅烷偶联剂RnSiX4-n按照物质的量/物质的量比为100∶1～5mol/mol加入来调变纳米结构载体材料孔表面官能团数量；b、将酶、Tris-HCI缓冲液、去离子水按照质量/体积/体积比为1∶5～7∶3～4g/l/l混合均匀；再将纳米结构载体材料按酶∶载体＝1∶1～2的质量比加入锥形瓶，摇匀后封住锥形瓶的瓶口，置于0～55℃的摇床中，保持摇床震荡速率50～250转/分钟震荡6～20小时，得到微型酶反应器。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述的原位合成法或后接枝法制备纳米结构载体材料，通过加入的硅烷偶联剂RnSiX4-n，调变载体材料孔表面官能团R种类，其中R代表活性官能团，包括烷基、氨基、亚胺基、巯基、乙烯基、环氧基、酰胺基、胺烷基，X代表能够水解的烷氧基和氯离子。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于RnSiX4-n选二异丙基二甲氧基硅烷偶联剂固定化酶活性最大、γ-(甲基丙稀酰氧基)丙基三甲氧基硅烷偶联剂固定化酶量最大。
5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述的脱除表面含羟基、氨基等易发生官能团间脱水的纳米结构载体材料的模板剂时，采用溶剂萃取法、焙烧法在400～600℃下4～24h脱除模板剂，调变纳米结构载体材料孔表面的此类官能团数量，获得表面此类官能团数量同步递减的载体材料，酶固定量将依次降低。
6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于步骤a纳米结构材料骨架元素源选用正硅酸乙酯，模板剂选用开链长碳表面活性剂、聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物等。
7.按照权利要求2所述的方法，其特征在于步骤a溶剂萃取法中溶剂顺序采用乙醇、四氢呋喃、四氯化碳。
8.按照权利要求2所述的方法，其特征在于步骤b中酶是指三维尺寸均小于纳米结构材料孔径的酶。
9.按照权利要求2所述的方法，其特征在于步骤b中Tris-HCI缓冲液缓冲范围pH＝7～8。
全文摘要
本发明提供了一种尺寸和性质可控的微型酶反应器及其制备方法，属于固定化酶技术。微型酶反应器的组成为以具有纳米尺寸孔道的多孔材料作为载体，将酶固载于纳米孔内；结构为具有一维或三维直通孔结构，酶分子通过物理或化学作用固载孔内；性能特性为微型酶反应器尺寸、表面官能团种类与数量、固载酶量可调控。采用调变纳米多孔材料表面官能团种类与数量的方法，固载酶后，构筑一种尺寸和性质可控的微型酶反应器。其优点在于通过调变纳米多孔材料表面官能团种类和数量，实现酶固载量的调变和固定化酶性能优化。为酶/载体分子水平设计与控制的开发应用、工业化生产提供可能。
文档编号C12N11/02GK1772889SQ20051008656
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月8日 优先权日2005年10月8日
发明者何静, 刘治军, 徐燕, 段雪 申请人:北京化工大学