一种高均一度大分子量Levan型果聚糖的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高均一度大分子量Levan型果聚糖的制备方法，利用现代分子酶工程技术对果糖基蔗糖转移酶进行分子改造，获得果糖基蔗糖转移酶突变体H280R，成功在大肠杆菌中进行原核表达，通过对表达的蛋白纯化，将纯化的酶与底物蔗糖反应，经乙醇沉淀得到Levan型果聚糖样品。本发明采用的果糖基蔗糖转移酶突变体H280R制备Levan型果聚糖时，底物蔗糖的浓度可以达到40％，通过凝胶色谱法确定了其分子量的大小为2×106Da，属于大分子多糖，且Levan型果聚糖均一性好，分散度为2.06，优于目前生物法制备Levan型果聚糖。
【专利说明】
一种局均一度大分子量Levan型果聚糖的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，特别涉及一种高均一度大分子量Ievan型果聚糖的制备方法。
【背景技术】
[0002]Levan型果聚糖是两种主要类型的果聚糖之一，是天然存在的果糖均聚物，其主链由重复的β_(2，6)_糖苷键连接，支链由β-(2，I)-糖苷键连接。Levan型果聚糖在许多领域都有广泛的应用，在食品工业中，果聚糖可以作为果糖源，乳化剂，包封剂和风味改良剂，由于果聚糖具有难以消化的特性，而且具有低热量和致龋性，此外还可以作为益生元来刺激益生菌在肠道菌群的增殖，因此果聚糖被用作糖替代物;在医药行业，果聚糖可以作为一种免疫调节剂，血浆的替代品，延长药物效果并作为胆固醇在肠道中的吸附剂;果聚糖还具有保湿作用，可以应用到化妆品中；此外，由运动发酵单胞菌果糖基蔗糖转移酶生成的果聚糖还具有抗肿瘤，抗病毒活性。
[0003]Levan型果聚糖可以通过果糖基鹿糖转移酶(Levansucrase，EC2.4.1.10)从鹿糖通过转糖基反应产生。果糖基蔗糖转移酶属于糖苷水解酶(GH68)家族，该家族还包括β-呋喃果糖苷酶和菊糖蔗糖酶，这三种酶都是以蔗糖作为其优先选择的底物供体，其分子结构主要由N末端的信号肽，催化中心和C末端区三个部分构成。绝大部分的果糖基蔗糖转移酶都包括了三个保守区，由三个不同的氨基酸残基构成，它们分别是亲核基团，酸/碱催化基团和过渡态稳定基团，是该酶行使催化功能的最重要的区域。
[0004]目前可以产生果糖基蔗糖转移酶的微生物包括芽孢杆菌(Bacillus)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、多黏类芽抱杆菌(PaenibaciIIus polymyxa)、金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、粘性放线菌(Actinomyces viscosus)和假单胞菌(Pseudomonas)等。运动发酵单胞菌是革兰氏阴性细菌，主要是拿来作为生产乙醇的菌株，近年来研究其生产果糖基蔗糖转移酶也越来越多，野生型的运动发酵单胞菌可以产生大分子量的果聚糖，但是重组蛋白的和底物反应产生的果聚糖的分子量却相对较小，有的只能合成寡聚糖。果聚糖的化学合成以及从植物中提取均一度高的果聚糖都非常的困难，微生物发酵产果聚糖是目前工业上应用的最广泛的方法，但是其发酵产物的分子量往往变化较大，而且催化效率不高。因此，提供可以产均一度高的大分子果聚糖的果糖基蔗糖转移酶对于Levan型果聚糖工业化生产和应用具有十分重要的意义。
[0005]目前中国发明专利201310403373.9公开了一种枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶突变体T305A，是利用现代分子酶工程技术对来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的左聚糖蔗糖酶氨基酸序列进行分子改造，通过易错PCR和活力筛选，获得突变体T305A，将其基因插入PSE380构建重组载体，导入大肠杆菌宿主表达。该突变体酶与野生型酶相比，在以蔗糖为底物转糖苷形成左聚糖反应中的底物浓度耐受性显著提高，达到最高转化率时的底物浓度由野生型酶的10%提高到突变体酶的25%。在该发明中没有提到该专利能够制造均一、高分子量的Levan型果聚糖，而且果糖基蔗糖转移酶对底物耐受只能耐受25%浓度的底物。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高均一度大分子量Levan型果聚糖的制备方法，以克服现有方法底物耐受性不高，产生的果聚糖的分子量却相对较小，有的只能合成寡聚糖的问题，改善酶法制备Levan型果聚糖的效果。
[0007]为了解决上述技术问题，本发明通过以下方式来实现:
[0008]—种高均一度大分子量Levan型果聚糖的制备方法，包括以下步骤:
[0009](I)构建果糖基蔗糖转移酶突变体H280R
[0010]设计利用引物F: H280R为5 ’ -CTCTTTACGATCAGCCGTGATTCGACTTATG-3 ’，引物R:H280R为5 ’ -CATAAGTCGAATCACGGCTGATCGTAAAGAG-3 ’，并以质粒pET_32a_lev为模板，根据Dpn I法定点突变的反应原理，构建果糖基蔗糖转移酶突变体H280R，设定PCR程序；
[0011]PCR扩增反应体系为:1yL Primer STAR Max，IyL引物F:H280R，IyL引物R:H280R，2yL模板pET-32a-lev，反应总体积为20yL ；
[0012]PCR 扩增条件为:94°C 预变性 3min，94°C 变性 30s;54°C 褪火 30s;72°C 延伸 3min45s;共进行30个循环反应;然后于72°C继续延伸1min;
[0013]PCR产物验证、回收后，经BamHI和XhoI双酶切消化，克隆到PGEX-4T-1质粒，转入E.coli BL21(DE3)；
[0014](2)果糖基蔗糖转移酶突变体H280R的表达与纯化
[0015]将步骤(I)中构建好的含有的果糖基蔗糖转移酶突变体H280R的野生型和突变型重组菌株的菌液，分别转接到含有一定浓度氨苄青霉素的200ml液体LB培养基中，37°C培养3?4h，当0D_达到0.6?0.8时，加入终浓度为0.2?0.5mmol/L的诱导剂IPTG，在28°C的温度下诱导培育4h左右，并在12000rpm的转速下离心5min收集菌体，利用向沉淀中加入细胞裂解缓冲液，并在冰上超声破碎2min至菌液澄清，再将离心管放入转速为12000rpm、温度为4°C的离心机中，离心1min，取上清移至另一干净离心管；
[0016]重组菌株经诱导剂IPTG培养过夜后收集湿菌体，破碎收集含有果糖基蔗糖转移酶的粗酶液，然后将粗酶液加载到含目His标签的纯化柱中，通过含有20mmol/L的PB、500mmol/L 的 NaCl 和 20mmol/L 的咪唑缓冲液 I 和含有 20mmol/L 的 PB、500mmol/L 的 NaCl 和500mmol/L的咪唑缓冲液II，缓冲液I和缓冲液II的酸碱度pH为7.4，进行梯度洗脱，层析结束后对洗脱的收集液，进行SDS-PAGE验证；
[0017](3)酶法合成制备Levan型果聚糖
[0018]将步骤(2)中纯化的果糖基蔗糖转移酶与25?40%浓度的蔗糖反应，添加pH为6.0的柠檬酸缓冲液，保持反应的温度为40?50 0C，反应时间为48h，利用sevag法去除蛋白，加入三倍体积于果糖基蔗糖转移酶反应液的酒精，在4 °C低温条件下使多糖沉淀并收集沉淀，再利用浓度为60?80%的乙醇溶液洗涤两次后，将沉淀再用三级水溶解收集，经冻干机冷冻获得粉末状的Levan型果聚糖。
[0019]进一步的，所述步骤(2)中的氨苄青霉素的浓度为30?60yg/mL。
[0020]所述步骤(2)中冰上超声破碎的超声波需求功率为120W，且超声破碎为每隔2s时间超声破碎I S。
[0021]与现有技术相比，本发明具有的有益效果:
[0022]1、采用果糖基蔗糖转移酶突变体H280R制备Levan型果聚糖时，底物蔗糖的浓度可以达到40% ；
[0023]2、本发明克隆得到了果糖基蔗糖转移酶突变体H280R，并成功在BL21(DE3)大肠杆菌中进行原核表达，通过对表达的蛋白纯化，将纯化的酶与底物蔗糖反应经乙醇沉淀得到多糖样品，通过凝胶色谱法确定了其分子量的大小为2X 16Da,属于大分子多糖；
[0024]3.本发明制备的Levan型果聚糖均一性好，分散度为2.06，优于目前生物法制备Levan型果聚糖。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0026]—种高均一度大分子量Levan型果聚糖的制备方法，包括以下步骤:
[0027](I)构建果糖基蔗糖转移酶突变体H280R
[0028]设计利用引物F: H280R为5 ’ -CTCTTTACGATCAGCCGTGATTCGACTTATG-3 ’，引物R:H280R为5 ’ -CATAAGTCGAATCACGGCTGATCGTAAAGAG-3 ’，并以质粒pET_32a_lev为模板，根据Dpn I法定点突变的反应原理，构建果糖基蔗糖转移酶突变体H280R，设定PCR程序；
[0029]PCR扩增反应体系为:1yL Primer STAR Max，IyL引物F: H280R，IyL引物R:H280R，2yL 模板 pET-32a-lev，反应总体积为 20yL ；
[0030]PCR 扩增条件为:94°C 预变性 3min，94°C 变性 30s;54°C 褪火 30s;72°C 延伸 3min45s;共进行30个循环反应;然后于72°C继续延伸1min;
[0031 ] PCR产物验证、回收后，经BamHI和XhoI双酶切消化，克隆到PGEX-4T-1质粒，转入E.coli BL21(DE3)；
[0032](2)果糖基蔗糖转移酶突变体H280R的表达与纯化
[0033]将步骤(I)中构建好的含有的果糖基蔗糖转移酶突变体H280R的野生型和突变型重组菌株的菌液，分别转接到含有浓度为30?60yg/mL的氨苄青霉素的200ml液体LB培养基中，37°C培养3?4h，当0D_达到0.6?0.8时，加入终浓度为0.2?0.5mmol/L的诱导剂IPTG，在28 °C的温度下诱导培育4h左右，并在12000rpm的转速下离心5min收集菌体，利用向沉淀中加入细胞裂解缓冲液，并在冰上超声破碎2min至菌液澄清，所述冰上超声破碎的超声波需求功率为120W，且超声破碎为每隔2s时间超声破碎ls，再将离心管放入转速为12000rpm、温度为4°C的离心机中，离心1min，取上清移至另一干净离心管；
[0034]重组菌株经诱导剂IPTG培养过夜后收集湿菌体，破碎收集含有果糖基蔗糖转移酶的粗酶液，然后将粗酶液加载到含目Hi s标签的纯化柱中，通过含有20mmol/L的PB、500mmol/L 的 NaCl 和 20mmol/L 的咪唑缓冲液 I 和含有 20mmol/L 的 PB、500mmol/L 的 NaCl 和500mmol/L的咪唑缓冲液II，缓冲液I和缓冲液II的酸碱度pH为7.4，进行梯度洗脱，层析结束后对洗脱的收集液，进行SDS-PAGE验证；
[0035](3)酶法合成制备Levan型果聚糖
[0036]将步骤(2)中纯化的果糖基蔗糖转移酶与25?40%浓度的蔗糖反应，添加pH为6.0的柠檬酸缓冲液，保持反应的温度为40?50 0C，反应时间为48h，利用sevag法去除蛋白，加入三倍体积于果糖基蔗糖转移酶反应液的酒精，在4 °C低温条件下使多糖沉淀并收集沉淀，再利用浓度为60?80%的乙醇溶液洗涤两次后，将沉淀再用三级水溶解收集，经冻干机冷冻获得粉末状的Levan型果聚糖。
[0037]对合成制备的Levan型果聚糖进行分析与鉴定
[0038]分别取I%的蔗糖、I %的Levan型果聚糖以及I %的葡萄糖为标准品，利用二苯胺为显色剂，展开剂为正丁醇:冰乙酸:水为2?3:1?2:1?2，放置在温度为80°C的烘箱中1min，观察显色情况。
[0039]选取纯化后冻干的Levan型果聚糖粉末，配制成浓度为5mg/ml的溶液，经过0.45um滤膜过滤去除杂质，采用凝胶色谱法测定其相对分子质量，色谱条件为色谱柱Ultrahydrogel?Linear 300mmX 7.8mmX 2，流动相为0.lmol/L的NaN03溶液，流速为0.QmT,/min，色谱柱温度为45°C，测定Levan型果聚糖的分子量为2X 106Da。
[0040]精确称取20mg纯化的Levan型果聚糖粉末置于棕色安瓿瓶中，加入lmol/L H2SO4后真空封管，在90°C温度下持续反应4h，待果聚糖完全水解后冷却，用Ba⑶3中和，离心，重复多次，直到H2SO4溶液完全除尽;取其上清液经过孔径为0.45um的滤膜过滤后，用高效液相色谱法进行分析，并以果糖，葡萄糖作为标准品，其中色谱条件:色谱柱为CarboPac PA20 (3mmX 150mm,6μηι)，流速为0.5mL/min；采用梯度洗脱的方法，混合流动相为250mmol/L的NaOH溶液、lmol/L的NaAc溶液及超纯水，其中梯度洗脱过程为:在O?21min内，NaOH溶液1.8%、NaAc溶液0% ;在21?30min内，NaOH溶液1.8%、NaAc溶液从5%上升到20% ;在30?50min内，NaOH溶液80%、NaAc溶液O %。
[0041]以上所述仅是本发明的实施方式，再次声明，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进，这些改进也列入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1.一种高均一度大分子量Levan型果聚糖的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)构建果糖基蔗糖转移酶突变体H280R 设计利用引物F: H280R为5 ’ -CTCTTTACGATCAGCCGTGATTCGACTTATG-3 ’，引物R: H280R为5 ’-CATAAGTCGAATCACGGCTGATCGTAAAGAG-3 ’，并以质粒pET_32a_lev为模板，根据Dpn I法定点突变的反应原理，构建果糖基蔗糖转移酶突变体H280R，设定PCR程序； PCR扩增反应体系为:1yL Primer STAR Max，IyL引物F:H280R，IyL引物R:H280R，2yL模板pET-32a-lev，反应总体积为20yL ； PCR扩增条件为:94°C预变性3min，94°C变性30s ； 54 °C褪火30s ； 72°C延伸3min45s;共进行30个循环反应;然后于72°C继续延伸1min; PCR产物验证、回收后，经BamH I和Xho I双酶切消化，克隆到PGEX-4T-1质粒，转入E.coli BL21(DE3)； (2)果糖基蔗糖转移酶突变体H280R的表达与纯化 将步骤(I)中构建好的含有的果糖基蔗糖转移酶突变体H280R的野生型和突变型重组菌株的菌液，分别转接到含有一定浓度氨苄青霉素的200ml液体LB培养基中，37°C培养3?4h，当0D_达到0.6?0.8时，加入终浓度为0.2?0.5mmol/L的诱导剂IPTG，在28°C的温度下诱导培育4h左右，并在12000rpm的转速下离心5min收集菌体，利用向沉淀中加入细胞裂解缓冲液，并在冰上超声破碎2min至菌液澄清，再将离心管放入转速为12000rpm、温度为4°C的离心机中，离心1min，取上清移至另一干净离心管； 重组菌株经诱导剂IPTG培养过夜后收集湿菌体，破碎收集含有果糖基蔗糖转移酶的粗酶液，然后将粗酶液加载到含目His标签的纯化柱中，通过含有20mmol/L的TO、500mmol/L的NaCl 和 20mmol/L 的咪唑缓冲液 I 和含有 20mmol/L 的 PB、500mmol/L 的 NaCl 和 500mmol/L 的咪唑缓冲液11，缓冲液I和缓冲液11的酸碱度PH为7.4，进行梯度洗脱，层析结束后对洗脱的收集液，进行SDS-PAGE验证； (3)酶法合成制备Levan型果聚糖 将步骤(2)中纯化的果糖基蔗糖转移酶与25?40%浓度的蔗糖反应，添加pH为6.0的柠檬酸缓冲液，保持反应的温度为40?50°C，反应时间为48h，利用sevag法去除蛋白，加入三倍体积于果糖基蔗糖转移酶反应液的酒精，在4°C低温条件下使多糖沉淀并收集沉淀，再利用浓度为60?80%的乙醇溶液洗涤两次后，将沉淀再用三级水溶解收集，经冻干机冷冻获得粉末状的Levan型果聚糖。2.根据权利要求1所述的一种高均一度大分子量Levan型果聚糖的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的氨苄青霉素的浓度为30?60yg/mL。3.根据权利要求1所述的一种高均一度大分子量Levan型果聚糖的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中冰上超声破碎的超声波需求功率为120W，且超声破碎为每隔2s时间超声破碎I S。
【文档编号】C12N15/70GK105907815SQ201610357450
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】徐辉, 曹毅, 乔代蓉, 曹瑜, 尚慧毅
【申请人】四川大学