使用有毒工业污染物苯酚制备聚羟基脂肪酸酯的方法

使用有毒工业污染物苯酚制备聚羟基脂肪酸酯的方法
【专利摘要】本发明属于环保及资源综合利用技术领域，具体为使用有毒工业污染物苯酚制备聚羟基脂肪酸酯的方法。本发明使用城市污水处理厂的剩余活性污泥作为接种物，对该活性污泥经过驯化，使其完全适应高苯酚浓度，可以将此浓度的苯酚在短时间内完全降解完毕；将此浓缩污泥与氮、磷、钙、镁、铁等营养液混合，形成反应混合液；加入苯酚，即开始细胞生长和PHA积累。本发明探索了各种操作条件，测定它们对于污泥生长和胞内PHA积累的影响，以确定较为优化的参数范围，这些操作条件包括：生长介质中的碳氮比、苯酚降解时介质中的pH值和溶解氧水平、生长介质中的钙、镁、铁浓度、盐度、温度、F/M比、及苯酚投加方式。
【专利说明】
使用有毒工业污染物苯酚制备聚羟基脂肪酸酯的方法
技术领域
[0001] 本发明属于环保及资源综合利用技术领域，具体涉及利用工业废水中有毒有机污 染物制备聚羟基脂肪酸酯的方法。
【背景技术】
[0002] 聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，简称PHA)是一种由微生物在体内合 成的高分子细胞内聚物。其基本结构为含有羟基的脂肪酸单体，两个相邻单体的羟基之间 形成酯键，进一步组成线性高分子。PHA在性质上类似于塑料，并具有多种单体结构和多样 的材料特性。因为它的生产过程为天然的生物反应，此类材料也具有良好的生物兼容性和 可降解性。由于其在包装工程、组织工程、缓释材料以及医疗材料等方面有广阔的应用前 景，近年来吸引了很大的研究和应用兴趣。
[0003] 一般来说，细胞内合成PHA的前提是微生物处于波动性和不平衡的生长环境中。最 常见的情况包括生长介质中碳源过多、氮/磷/硫等元素过少，或者食物/微生物比(food to microbe ratio,简称F/M比)过高，由此造成的细胞增殖速度受到限制，不能及时将过多的 碳源用于生长。此时微生物可以将这些碳源转化为PHA储存在细胞内部，留待之后条件改善 时用于进一步生长。此外，溶解氧水平过低造成的底物无法快速氧化，和好氧/厌氧条件交 替也可以促进PHA的累积。另一种被认为有利于PHA合成的操作条件为批序式培养工艺，即 分批、间歇性地投加碳源，使微生物经历反复的饱食/饥饿期(feast/famine)。此时有一些 微生物选择将过多的、或者不能立刻用于生长的碳源转化为PHA，作为适应不稳定和剧烈变 化生长环境的手段，平衡其增值速度，为其在微生物种群中增加竞争优势。
[0004] PHA可以由各种不同的有机物质作为底物进行合成。到目前为止，绝大多数的研究 和商业化应用使用纯净无毒的简单有机物，如醋酸盐、葡萄糖等作为碳源，纯种菌作为工具 进行PHA生产。其研究重点第一在于菌种筛选、纯化、基因改造(基因工程菌），第二在于操作 工艺和设备的研制和优化，以提高生物质中的PHA比例和的整体PHA生产效率。但是使用纯 种菌和纯净物质作为材料有其局限。此类碳源本身的成本较高，而在生产过程中保持菌群 的纯度也对于操作工艺提出了更高的要求。因此近年来为了降低成本，一些研究者提出了 使用混合城市/工农业废污水作为碳源，在纯种或混合菌群中合成PHA。目前已经得到研究 的废污水包括城市生活污水、活性污泥发酵液、食品和制糖工业废水、印染和造纸废水、和 农业生物质废弃物等。但这些底物有一个共同点，即基本无毒无害，使用对于微生物来说有 毒害作用的有机物质作为底物的研究非常缺乏。Maskow等人[1]在2000年利用苯酚为原料、 连续培养作为操作手段，在两种纯种菌中成功地合成了 PHA。而Reddy等人最近[2]试验了多 种酚类物质，发现它们都可作为纯种菌合成PHA的底物。本专利的发明人团队进一步研究了 批序式操作条件下、苯酚作为唯一碳源时混合菌群中的PHA积累情况，发现其可达到50%以 上的细胞干重[3]，和一些纯种菌+无毒底物的情况相接近。这是第一次有研究报道混合菌 群利用有毒底物进行PHA合成，而其结果显示了很好的应用前景。因此本发明进一步深化研 究，将苯酚作为有毒工业污染物的代表、完全驯化的混合菌群活性污泥为工具，分批/批序 式培养作为操作工艺，深入细致地研究和优化PHA的合成条件，形成较为成套的技术方案。
[0005] 参考文献：
[1] Maskow, T. Babel ff. Calorimetrically recognized maximum yield of poly-3-hydroxybutyrate (PHB) continuously synthesized from toxic substrates. Journal of Biotechnology2QQQ ,77, 247-253.
[2] Venkateswar Reddy, M.; Mawatari, Y.; Yajima，Y.; Seki，C.; Hoshino T.; Chang, Y.-C. Poly-3-hydroxybutyrate (PHB) production from alkylphenols, mono and poly-aromatic hydrocarbons using Bacillus sp. CYR1: A new strategy for wealth from waste. Bioresource Technology 2015,7^, 711-717.
[3] ffosman, A.; Lu，Y.H.; Sun, S.P.; Liu, X.; Wan, C.L.; Zhang, Y.; Lee, D.-L.J.; Tay. J.H. Effect of operational strategies on activated sludge's acclimation to phenol, subsequent aerobic granulation, and accumulation of polyhydoxyalkanoates. Journal of Hazardous Materials, 2016, 7, 221-228. 〇

【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种利用工业废水中有毒有机污染物制备聚羟基脂肪酸 酯的方法。
[0007] 本发明提供的制备聚羟基脂肪酸酯的方法，具体步骤为： (1) 使用城市污水处理厂的剩余活性污泥作为接种物。对该活性污泥经过一定的驯化 过程[3]，使此污泥完全适应高苯酚浓度（如500mg/以上L)，可以将此浓度的苯酚在短时间 内（如30-60min)完全降解完毕； (2) 将上述得到的完全适应高苯酚浓度的混合菌种污泥，放在反应器内培养，每两到三 天添加一次苯酚、氮、磷、钙、镁、铁等营养物质，进行维持和培养； (3) 每次进行PHA生产时，将混合菌种污泥取出一部分进行高速离心分离，沉淀，得到浓 缩污泥； (4) 将此浓缩污泥与氮、磷、钙、镁、铁等营养液混合，并加入一定量的碱性缓冲溶液（以 NaHC03形式），形成一个批次的反应混合液； 其中，这些营养物质的浓度可以分别进行调节，形成一定的浓度梯度(如0、2.5、5 mg/L 的镁元素等）；调整初始取出的原始浓缩污泥，使此反应混合液具有一定的初始污泥浓度， 如0.5、1.0、2.08/1等。对此反应混合液进行曝气充氧和搅拌混合，通过调节曝气的强度可 以改变体系中的溶解氧浓度； (5) 然后加入一定量的苯酚，使其具有一定的初始浓度(如250、500、1000、2000 mg/L)。 由于苯酚是本体系中唯一的有机碳源，由苯酚的浓度也可计算出初始的碳元素浓度(碳浓 度=76.6%苯酚浓度）。将此浓度与加入的氮元素浓度相比则可得到初始的碳氮重量比(C/N， w/w)。初始苯酚浓度和污泥浓度之间的比值则为此批次的F/M比（如0.1、0.4、0.8等）。苯酚 加入之后污泥即开始细胞生长和PHA积累（在此过程中可以监测和比较两者的速率，确定各 因素的作用）。直至本次加入的苯酚完全降解完毕，作为一个苯酚处理和PHA积累的批次； (6) 在上一个批次的苯酚降解结束之后，再次加入一定量的苯酚和氮、磷、磷、钙、镁、铁 等营养元素，开始下一个批次，以继续提高PHA的总量和在胞内的比例。向同一批污泥中反 复投加苯酸的这种方式，即为批序式处理(sequencing batch mode)。
[0008] 本发明中，氮元素可以NH4CI形式，磷元素可以K2HP〇4形式，钙元素可以CaCl 2形式， 镁元素可以MgS〇4形式，铁元素可以FeS〇4形式加入。
[0009] 本发明中，在反应过程中也可加入NaCl以改变体系的盐度。
[0010]本发明中，在不同的环境温度下操作，可测试温度对于PHA积累的影响。
[0011] 在这个过程中控制、改变各种操作条件，测定它们对于污泥生长和胞内PHA积累的 影响，以确定较为优化的参数范围。这些操作条件包括:生长介质中的碳氮比、苯酚降解时 介质中的pH值和溶解氧水平、生长介质中的钙、镁、铁浓度、盐度、温度、F/M比、及苯酚投加 方式。其中，碳氮比的范围为5-40 (w/w);磷、钙、镁、铁浓度的范围内分别为0.3-4.3 mg/L、 0- 7.2 1^/1、0-4.8 11^/1、0-9 1^/1;优选磷、钙、镁、铁浓度的范围内分别为0.3-4.3 1^/1、 1- 7.2 mg/L、0.5-4.8 mg/L、1-9 mg/L;溶解氧浓度的范围为1 mg/L-饱和浓度(约为8 mg/ L);通过调节添加的缓冲溶液量而将反应的pH值控制在4-8.5之间；盐度范围为0%-4%(以 NaCl计）；温度范围为7-23° C。初始苯酚浓度范围为250-2000 mg/L;初始污泥浓度范围为 0.5-2.5 g/L;F/M比范围为0.1-1.6;苯酚投加方式则可分为一次性投加(单批次处理)和多 次反复投加(批序式处理）。
[0012] 结果表明，碳氮比在5-40(w/w)之间、溶解氧水平在4-8 mg/L之间时，污泥生长和 胞内PHA积累皆可达到较高的速度，同样元素磷(0.3-4.3 mg/L)、钙(0-7.2 mg/L)、镁(Ο-? 8 mg/L) 、铁 (0-9 mg/L) 在这些浓度范围内 时细胞生长和 PHA 积累的速度也较高。 因此确 定这些浓度范围是较为优化的操作条件，实际废水中的相应元素在这些范围内变化时皆可 获得较高PHA积累效率。低溶解氧水平(〈0.5 mg/L)阻碍生长和PHA合成，而最佳溶解氧水平 则确立在1-4 mg/L之间，此时PHA合成较快而曝气能耗较小。在生长介质中添加碱性缓冲物 质控制pH值，发现pH降到5以下时微生物生长和PHA合成皆趋于停滞。而在添加适当缓冲物 质，将pH值控制在6.5-8.5之间，则两者皆可正常进行、且无明显差别。使用三个苯酚浓度 (250/500/1000 mg/L)和三个初始污泥浓度(0.5/1.0/1.5 g/L)组合，发现在低/中/高三个 苯酚浓度水平下，提高初始污泥浓度对于加快生长和PHA合成皆有正面作用。生长介质中的 初始苯酚浓度如较低，生长速度和PHA积累速度皆较高，而高浓度对于这两个过程有一定的 抑制作用。就提高PHA在胞内的比例而言，在高污泥浓度下，低/中/高三个苯酚浓度的差别 不大;而在中等污泥浓度下，中等浓度的苯酚相对于高/低两个水平而言有更好的效果。就 总PHA量的提高而言，高苯酚浓度+高污泥浓度的组合效率最高。在工业化生产时如需处理 高浓度的苯酚废水(如1000-2000 mg/L)，应将污泥浓度提高到2 g/L以上，以减轻抑制作用 并获得较高的PHA生产效率。
[0013] 进一步试验了批序式工艺以模仿实际工程中多批次连续处理废水的情况。采用总 体苯酚投加量不变，分一次/二次/四次投加不同浓度苯酚的方法。发现一次性投加高浓度 苯酚的操作方法延长了整个处理过程的时间，但提高了最终PHA在胞内的比例和最终PHA的 产率;而分四次投加低浓度苯酚与分两次投加中等浓度苯酚，其处理时间相仿，最终的PHA 产率和PHA在胞内的比例也较为接近，但两者皆低于一次性投加高浓度的情况。因此如果需 要缩短总体处理时间，则采用多次添加低浓度苯酚的方式较为高效;而如果目标为获得具 有最高PHA比例的细胞，则可采用一次性添加高浓度苯酚的方式。同时此种方式也更符合高 浓度工业废水的处理要求，简化了整体工艺。
[0014] 在批序式处理开始时胞内的PHA干重比例（PHA%)与生长和PHA积累的速率呈反相 关。即反应开始时细胞内已经累积的PHA水平越低，加入苯酚开始反应后细胞生长越快、PHA 累积也越快。当胞内PHA比例达到一个较高的水平之后，积累速度明显变慢乃至停滞，而细 胞生长和苯酚降解也减缓。最终，观察到胞内PHA的干重比例有一个上限值，在本发明的试 验条件下此值在55-60%范围内。因此确定较为可持续的PHA生产方式，即在一个批次的PHA 积累后，取出一部分污泥作为提取PHA的原料，剩余的污泥则经历一个饥饿期以降低其胞内 PHA比例，然后作为开始下一批次的材料。
[0015]低温(7-13°C)对于微生物生长和PHA合成有明显的抑制作用，但反应仍可进行。而 中高温15-23°C下速度明显加快，因此认为这是较为适宜的温度范围。0-2%盐度（以NaCl计） 范围内细胞生长和PHA积累受到负面影响，其速率低于0%盐度的条件，但此影响可逆，而4% 盐度产生的损害则不可逆。因此在实际操作中应避免高盐度的冲击。
【附图说明】
[0016]图1.碳氮比对于细胞生长和PHA积累的影响。
[0017]图2.添加不同剂量碱性缓冲剂对于细胞生长和PHA积累的影响（500 mg/L苯酚， C/N=10)〇
[0018] 图3.溶液中溶解氧水平对于细胞生长和PHA积累的影响（500 mg/L苯酚，C/N= 10)〇
[0019] 图4.不同初始苯酚/污泥浓度组合下生长和PHA积累速率的比较(C/N=10)。
[0020] 图5.不同方式批序式投加苯酚对生长和PHA积累的影响。
[0021]图6.相似初始污泥浓度下、不同初始胞内PHA水平对于生长和PHA积累的影响。 [0022]图7.盐冲击对于细胞生长和PHA积累的影响。
【具体实施方式】
[0023]本发明从上海一城市污水处理厂取得剩余活性污泥，作为接种物进行针对于高浓 度苯酚的驯化。使用批序式工艺操作反应器，在两个月中逐步提高反应器进水中的苯酚浓 度，最终得到适应500 mg/L苯酚浓度的混合菌种活性污泥。将反应器混合液取出，经过高速 离心分离后得到污泥，与一定组成的生长介质混合，并且进行曝气和搅拌。此生长介质包含 氮、磷、铁、钙、镁、微量元素和碱性缓冲液等组分，这些组分可以分别改变浓度以研究其对 细胞生长和PHA积累的影响。在生长介质和污泥完全混合的条件下加入不同剂量的苯酚，定 期取样监测600nm下的吸光度(0D600)作为细胞生长的指标，然后在样品中加入酸性尼罗红 染料染色PHA，监测产物的荧光强度作为PHA含量的指标。重复取样直至加入的苯酚完全降 解完毕，作为一个反应批次;再次加入苯酚重复以上过程，以模拟批序式反应工艺。通过以 上步骤试验确定操作条件的影响如下： a.碳氮比(C/N)影响:在两个初始污泥浓度(0.5/1.4 g/L)和两个初始苯酚浓度(250/ 500 mg/L)下分别平行试验了C/N~5、10、20、40(w/w)这几个水平。结果表明这个范围内 的变化对于细胞生长和胞内PHA积累的影响并不十分显著，皆能达到较快的生长和PHA合成 速度。因此在实际操作中这个范围内的C/N可以认为是合适的条件。在低污泥/低苯酚浓度 下低碳氮比（C/N=5)能略微促进苯酚降解和细胞生长，而C/N=40小幅提高了最终胞内PHA的 含量。数据见图1 (横坐标-反应时间/min)。
[0024] b. pH和添加缓冲液的影响：由于苯酚降解产生有机酸，因此本发明使用添加碱性 缓冲液NaHC03的方法来中和酸性物质、保持pH值。平行设立三个样品，分别添加0 mL/5 mL/ 10 mL NaHC03 (0.5 mol/L)，以确定降解过程中的pH值对于过程的影响。发现在不添加缓 冲液的情况下，溶液中的pH值很快下降到4左右，同时细胞生长和PHA都趋于停滞。而在添加 缓冲液的情况下，pH也有所降低，添加5 mL时降低到6.5左右，而添加 10 mL时全程pH都高于 7,说明酸性物质被全部中和。这两个情况下，细胞生长和PHA均未受到明显的负面影响，两 者的生长速率和PHA积累速率基本一致并且较高。由此说明中性偏碱性的环境更有利于细 胞生长和PHA积累，而酸性环境、尤其是低于5的pH严重阻碍这两个过程。数据见图2(横坐 标-反应时间/m i η )。
[0025] c.溶解氧水平的影响:本发明采用固定搅拌速率而改变曝气强度的方法，研究了 三个溶解氧水平(低/中/饱和）下生长和PHA积累的情况。发现中等溶解氧水平4-5 mg/L和 高(饱和)溶解氧水平约10 mg/L下，生长和PHA积累没有很大的差别并且较高。因此在实际 操作中这个范围的溶解氧浓度是合适的条件。而低溶解氧水平0.4-1 mg/L则减缓了这两个 过程，在提高到1-2 mg/L之后PHA积累速率有明显提高。由于曝气本身要消耗电力增加成 本，因此推测在本发明的条件下，PHA积累在1-4 mg/L有一个最佳的溶解氧水平，可以达到 较高的速率而产生较低的能耗。具体数据见图3(横坐标-反应时间/min)。
[0026] d.磷、钙、镁、铁浓度的影响：采用不添加/中等浓度/两倍中等浓度三个浓度水 平，平行研究这些元素的作用。发现三个浓度范围下细胞生长和PHA积累无明显差异，因此 可以认为这些元素的水平变化对于短期内的（1-2小时)微生物生长和胞内PHA积累过程无 显著影响（不另附数据）。在实际操作中磷在0.3-4.3 mg/L、钙在0-7.2 mg/L、镁在0-4.8 mg/L、铁在0-9 mg/L范围内可以认为是合适的条件。
[0027] e. F/M比的影响：一般认为，较高的F/M比有利于PHA的积累，因为过多的碳源不能 被有限的微生物立即用于生长，从而转化为PHA进行储藏。然而也有研究认为，当F/M较低 时，会加剧混合菌群中微生物之间对于碳源的争夺，有一些微生物此时通过加强PHA合成能 力来争夺有限的碳源，从而保持自己的竞争优势。在使用苯酚这类有毒底物时，情况又更为 复杂，因为苯酚对于微生物的毒害作用与其在体系中的的浓度正相关，而此时较高的微生 物浓度则能在一定程度上减轻苯酚的毒害和抑制作用。
[0028]为了更好地研究F/M比的影响，设计了一个试验矩阵。采用三个初始苯酚浓度和三 个初始污泥浓度，分别研究在每一种组合条件下的生长和PHA积累情况。这三个苯酚浓度分 别为250、500、1000 mg/L，三个初始污泥浓度则为0 · 55-0 · 65、0 · 9-1 · 3、1 · 4-1 · 7 g/L。在实 际测试中观察到，大多数反应呈现线性的反应动力学特征，因此假设生长和PHA合成皆为假 零级反应(pseudo-zero order reaction)，使用生长和PHA浓度变化曲线中的线性部分，进 行线性拟合，求得假零级反应常数(pseudo-zero order rate constants)。图4中列出了这 些数据进行比较，其中PHA比例使用了分数(而不是百分数）。
[0029]就生长速率而言，其与初始污泥浓度呈正相关，而与初始苯酚浓度呈反相关。即苯 酚浓度越高，一定初始污泥浓度下的生长速率越低，这说明了苯酚对于细胞生长的确有抑 制作用。而PHA积累的情况则较为复杂，在低污泥浓度下，系统中的总PHA浓度变化趋势与细 胞生长趋势相同，即低苯酚浓度更有利于这个过程。而在中等污泥浓度下，最高的速率出现 于中等苯酸浓度下（0.0138 g/L, min @ 500 mg/L)，而250/1000 mg/L下的速率相差不大 (分别为0.0099/0.0089 g/L, min)。在高污泥浓度下，最高的速率则出现于1000 mg/L苯酸 浓度下（0.0251 g/L，min)，而250/500 mg/L下的速率较为接近(分别为0.0202/0.0178 g/ L，min)。就PHA在细胞内的比例而言，低/中污泥浓度的趋势与PHA总浓度相似，而高污泥浓 度下，最高的增长速率出现在250 mg/L下(0.0108)。然而高污泥浓度下的三个苯酚浓度，以 及中等污泥/中等苯酚浓度这几个情况的速率值都较为接近，平均为0.0094 ± 0.001 /min。 可以认为这是本实验条件下最高的PHA%增长速率。
[0030]提高初始污泥浓度在三个苯酚浓度下对于加快生长和PHA合成皆有正面作用，但 程度不同。在250 mg/L苯酚浓度下，低/高污泥浓度下的生长速率相差约4倍，而在1000 mg/ L下则相差近6倍，说明提高系统中的污泥浓度在一定程度上有助于减轻苯酚的毒性。对于 PHA总量的提高而言，这两个比例分别为5倍和13倍，说明苯酚对于PHA合成的抑制作用高于 对于生长的抑制，而提高污泥浓度不仅有利于克服苯酚的毒性，还提高了 PHA总量的积累速 率。就PHA总产量而言，高苯酚浓度+高污泥浓度的组合很可能是较为优化的方案。对于提高 PHA在胞内的比例而言，苯酚的毒性并不那么明显，而提高污泥浓度的影响也较为微弱。对 于这个参数，最佳的组合是较高的污泥浓度和适当的苯酚浓度组合。在中等污泥浓度下，苯 酚水平在500 mg/L较为适宜，而高污泥浓度下苯酚浓度小于1000 mg/L即可。
[0031] f.批序式操作和极端高苯酚浓度：由于高浓度苯酚对于微生物的抑制作用，因此 当源废水苯酚浓度过高的时候，可以采用稀释的办法降低其毒性。由此本发明进一步研究 了同等剂量的苯酚分一次或多次投加的效果。图5举例显示1000 mg/L*l次、500 mg/L*2次、 和250 mg/L*4次条件下的情况，在每次苯酚降解完之后立刻投加下一次（以箭头显示，横坐 标-反应时间/m i η )。
[0032] 250 mg/L*4和500 mg/L*2这两种情况下，苯酚的总降解时间接近，而最后的总PHA 产量也基本一致，但250 mg/L*4的条件下最终污泥浓度较高而胞内PHA比重较低。相较而 言，单次投加 1000 mg/L苯酚延长了总体的降解时间、降低了最后的污泥产量，而更多的苯 酚可能被用于PHA积累。1000 mg/L*l的条件提供了最高的总PHA产量和最高的最终胞内PHA 比例。因此这几种不同的苯酚投加方法在时间消耗、PHA产量和产率、总体工艺效率上各有 利弊。如果需要缩短总体处理时间，则采用多次添加低浓度苯酚的方式较为高效;而如果目 标为获得具有最高PHA比例的细胞，则可采用一次性添加高浓度苯酚的方式。同时此种方式 也更符合高浓度工业废水的处理要求，简化了整体工艺。
[0033] 进一步试验了极端高苯酚浓度(2000 mg/L)对于污泥生长和PHA积累的影响，此时 采用更高的初始污泥浓度。发现极端高苯酚浓度对污泥的抑制作用更加强烈，需要近7个小 时才能完全降解，在这个阶段内污泥浓度从2.35 g/L上升到3.5 g/L，而PHA总浓度从0.43 g/L上升到2 g/L，胞内PHA比重从18%上升到58%(不另附数据）。这个数值可以认为接近于 本发明条件下胞内PHA比重的最高值，结合其他数据，可认为这个值在55%-60%之间。
[0034] g.胞内初始PHA%水平的影响：在纵观各次试验数据时发现，在投加苯酚时，胞内 初始的PHA%水平可能对于整体工艺效率有影响。因此将多批数据综合比较，举例说明初始 污泥浓度近似时(〇. 9-1.2 g/L)，初始胞内PHA%水平对于生长和PHA进一步积累的影响。数 据见图6(横坐标-反应时间/min)。
[0035]大致上来说，较低的初始胞内PHA水平更有利于苯酚降解和PHA积累。在同样的初 始污泥浓度约1.1 g/L下，初始PHA水平3.4%的情况下250 mg/L的苯酚可以在20 min内被完 全降解，而初始PHA水平>30%时完全降解则需要近100 min。另外，初始PHA%较高的时候，添 加苯酚之后荧光强度下降得越多，而此后的PHA总量和PHA%增加得越慢。利用直线部分计算 假零级速率常数，显示于下表： 表1不同初始PHA%水平下的假零级速率常数比较
因此，为了提高总体的工艺效率、使投加的苯酚能够被尽快地吸收、转化、降解，应该采 用初始胞内PHA%较低的污泥作为工具。在批序式操作的工艺中，可以在污泥中累积的PHA水 平达到一定程度后将其取出一部分，作为提取PHA的原料。而其余的部分应令其经历一定的 饥饿期，消耗掉胞内的PHA使其降低到一定的较低水平，以利于下一批苯酚降解/细胞生长/ 胞内PHA积累。
[0036] h.温度的影响:温度对于细胞中各种酶的活性皆有重要影响，也影响到苯酚的降 解、细胞生长、以及PHA合成的过程。有研究发现，低温下碳源转化为PHA的效率有所下降。另 外有研究认为，低温能大大加剧苯酚的毒性，严重地抑制细胞活性。本发明采用两个温度范 围（低/高），比较相同条件下细胞生长和PHA积累的速率。这两个温度范围分别为7-13Γ和 15-23Γ，一些试验条件和结果见下表： 表2不同温度下假零级速率常数比较
比较各个初始苯酚和污泥浓度下、两个温度范围内的污泥生长和PHA积累速率发现，高 温条件下这三个速率均大大高于低温条件。这说明在本发明条件下，低温对于细胞和PHA积 累均有负面影响。这两个过程在l〇°C以下均能进行，但在15-23° C范围内效率大大提高。因 此在大规模的工业化运行中，可以加入一定的保温措施，更有利于稳定高效PHA的生产。
[0037] i.盐冲击的影响：由于含有苯酚的废水一般为工业来源，其中成分比较复杂。在 实际的工业生产中，可能会出现废水的组分突然发生变化、如盐度突然升高之类的状况。因 此本发明试验了在正常PHA生产过程中盐度突然升高对于过程的影响。以氯化钠作为模型 物质，模拟不同程度盐冲击的情况，结果如图7所示(横坐标-反应时间/min)。
[0038] 从图7可见，0%盐度（即控制组）的污泥生长和PHA积累都达到了较高的效率，投加 的苯酚在120min左右降解完毕。到这个阶段为止，三个样品的趋势基本重合。然而在40分钟 加入NaCl之后，两个盐冲击样品污泥的生长和PHA的积累都受到了严重的影响。表现为 0D600突然剧烈下降，其中浓度为4%盐实验组的下降更为明显。这说明高盐度的冲击有可能 影响到了细胞的完整性，甚至使其破裂。在40min之后的一段时间里，两个盐冲击样品的 0D600都表现了稳定-上升的趋势，其中2%盐浓度的实验组更为迅速。但这并不一定意味着 污泥完全恢复了活性。
[0039] 高盐冲击对PHA积累也有明显的负面影响，但并不如污泥生长如此明显。具体表现 为，2%盐度样品在加入NaCl后仍能继续积累PHA，直到3小时左右时的速率约为0-40 min的 一半。与此同时此样品中PHA%也继续上升最终达到约30%，比控制组低了20%。然而4%的盐度 对于污泥的冲击是不可逆的，在加入NaCl后其PHA积累几乎停滞，而PHA%甚至有所下降。加 盐后的污泥苯酚的降解速率也大大降低，直至经过6个小时，两个高盐冲击组中的苯酚都未 降解完毕。由此可以断定，盐度对污泥的生长、PHA的积累及苯酚的降解影响较大。在本发明 试验条件下，2%盐度尚在污泥可以承受的范围内，而4%则产生了不可逆的损害。在实际工程 中可能需要对于废水的盐度进行一定控制，使其不超过2%。如果需要在高盐度下进行苯酚 降解和PHA合成，则需要进一步的进行污泥驯化。
【主权项】
1. 一种使用有毒工业污染物苯酚制备聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于具体步骤 为： (1) 使用城市污水处理厂的剩余活性污泥作为接种物，对该活性污泥经过一定的驯化 过程，使其完全适应500mg/L以上的高苯酚浓度，可以将此浓度的苯酚在短时间内完全降解 完毕； (2) 将上述得到的完全适应高苯酚浓度的混合菌种污泥，放在反应器内培养，每两到三 天添加一次苯酚、氮、磷、钙、镁、铁营养物质，进行维持和培养； (3) 每次进行PHA生产时，将混合菌种污泥取出一部分进行高速离心分离，沉淀，得到浓 缩污泥； (4) 将此浓缩污泥与氮、磷、钙、镁、铁营养液混合，并加入一定量的碱性缓冲溶液，以调 节反应体系的pH值，形成一个批次的反应混合液； 其中，对反应混合液中各营养物质的浓度分别进行调节，形成一定的浓度梯度;调整初 始取出的原始浓缩污泥，使此反应混合液具有一定的初始污泥浓度;对此反应混合液进行 曝气充氧和搅拌混合，通过调节曝气的强度以改变体系中的溶解氧浓度； (5) 然后加入一定量的苯酚，使其具有一定的初始浓度;苯酚加入之后污泥即开始细胞 生长和聚羟基脂肪酸酯(PHA)积累;直至本次加入的苯酚完全降解完毕，作为一个苯酚处理 和PHA积累的批次。2. 根据权利要求1所述的制备聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，在上一个批次的苯 酚降解结束之后，再次加入一定量的苯酚和氮、磷、磷、钙、镁、铁营养元素，开始下一个批 次，以继续提高PHA的总量和在胞内的比例。3. 根据权利要求1或2所述的制备聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，氮元素以NH4Cl 形式，磷元素以K2HPO4形式，钙元素以CaCl2形式，镁元素以MgSO 4形式，铁元素以FeSO4形式加 入。4. 根据权利要求3所述的制备聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，反应体系中，控制 碳氮比重量为5-40(w/w);其计算方法为：由苯酸的浓度计算出初始的碳元素浓度，碳浓度= 76.6%苯酚浓度，将此浓度与加入的氮元素浓度相比，则得到初始的碳氮重量比:C/N(w/w); 控制初始污泥浓度为0.5-2.5 g/L;控制初始苯酚浓度为250-2000 mg/L;初始苯酚浓度和 污泥浓度之间的比值:F/M为0.1-1.6。5. 根据权利要求1、2或4所述的制备聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，步骤(4)的 反应混合液中，控制磷、钙、镁、铁的浓度分别为0.3-4.3 1^/1、0-7.2 11^/1、0-4.8 11^/1、0-9 1^/1，溶解氧浓度为111^/1-饱和浓度;控制?!1值为6.5-8.5。6. 根据权利要求5所述的制备聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，控制体系的盐度以 NaCl 计为 0%-4%。7. 根据权利要求5所述的制备聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，控制体系的温度为 7-23 cC。
【文档编号】C12P7/62GK105907806SQ201610419904
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】张轶, 阿皮热旦·吾斯曼, 万春黎, 刘翔
【申请人】复旦大学