专利名称：制备用于在大肠杆菌和昆虫细胞中表达鸭α－干扰素基因的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种基因工程产品的核苷酸序列的制备、表达载体的制备及其表达，具体地说是利用RT-PCR技术克隆鸭α-干扰素基因，并构建了其真核表达载体和原核表达载体，分别在真核表达系统-Sf9和原核表达系统-BL21(DE3)plysS中表达。
背景技术：
干扰素(interferon，IFN)是白细胞等在病毒或其他诱生剂作用下产生的一种具有调节免疫功能和广谱抗病毒活性的蛋白质。干扰素分为两大类型，即I型(主要是α和β)和II型(γ)干扰素。α-干扰素(IFN-α)由白细胞产生，具有较强的抗病毒作用。
鸭I型干扰素基因是在1995年由Schults等首次克隆。当时使用已克隆的ChIFN1作为探针，用Southern杂交法获得了一段长为1.2kb的核苷酸片段，包括鸭I型干扰素的完整阅读框架，即以ATG为起始密码子的576bp的一段核苷酸序列，共编码191个氨基酸，其中N末端的30个疏水氨基酸为信号肽，成熟多肽为161个氨基酸。鸭I型干扰素与鸡I型干扰素相比，核苷酸水平和氨基酸水平的同源性分别为73％和50％。
发明内容本发明的目的在于提供制备用于在大肠杆菌和昆虫细胞中表达鸭α-干扰素基因的方法。
本发明的目的是这样实现的(1)用淋巴细胞分离液分离鸭外周血单核细胞，植物血凝素诱导培养鸭外周血单核细胞，收获诱导培养的细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA；(2)设计扩增鸭α-干扰素基因的特异性引物，如下上游引物P1 20bp5′-GCACAACCCAGGATCCACCA-3′，引入BamH I酶切位点；下游引物P2 19bp5′-GTGCGCGTGTGGGGTACCT-3′；(3)利用RT-PCR技术扩增鸭α-干扰素基因；(4)对鸭α-干扰素基因进行克隆、测序鉴定；(5)利用BamH I(引物中引入)、Sal I(克隆载体pGEM-T上的酶切位点)这两个多克隆位点，将鸭α-干扰素基因定向亚克隆至原核表达载体pET30a和真核表达载体pBlueBacHis2A上；
(6)重组表达质粒pET30a-DuIFN-α转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS；(7)确定原核表达系统中表达鸭α-干扰素的最佳诱导时间和IPTG浓度；(8)鸭α-干扰素在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中的诱导表达；(9)重组表达质粒pBlueBacHis2A-DuIFN-α转染昆虫细胞Sf9细胞株；(10)噬斑分析筛选重组病毒；(11)确定真核表达系统中表达重组鸭α-干扰素的最佳表达时间和感染复数；(12)按最佳表达时间和MOI接种病毒，感染Sf9细胞，在Sf9细胞中表达鸭α-干扰素。
采用本发明的方法生产的产品可用于①研究鸭α-干扰素生物活性及其作用机理。
②制备抗病毒的药物。
本发明的产品优点体现在①pET和pBlueBacHis2A载体系统表达效率非常高。
②两种载体系统都携带His标签，便于纯化。
图1是本发明DuIFN-α基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中下划线表示信号肽，方框表示糖基化位点；图2为构建含有DuIFN-α基因的重组克隆载体的流程图；图3为构建含有DuIFN-α基因的原核表达载体的流程图；图4为构建含有DuIFN-α基因的真核表达载体的流程图。
(五)具体实施方案下面举例对本发明作更详细的描述(1)用淋巴细胞分离液分离鸭外周血单核细胞，植物血凝素(PHA)诱导培养鸭外周血单核细胞，收获诱导培养的细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA；(2)设计扩增鸭α-干扰素基因的特异性引物，如下上游引物(P1) 20bp5′-GCACAACCCAGGATCCACCA-3′，引入一个BamH I酶切位点；下游引物(P2) 19bp5′-GTGCGCGTGTGGGGTACCT-3′；(3)利用RT-PCR技术扩增鸭α-干扰素基因；(4)对鸭α-干扰素基因进行克隆、测序鉴定；(5)利用BamH I(引物中引入)、Sal I(克隆载体pGEM-T上的酶切位点)这两个多克隆位点，将鸭α-干扰素基因定向亚克隆至原核表达载体pET30a和真核表达载体pBlueBacHis2A上；(6)重组表达质粒pET30a-DuIFN-α转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS；(7)确定原核表达系统中表达鸭α-干扰素的最佳诱导时间和IPTG浓度；(8)鸭α-干扰素在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中的诱导表达，具体操作如下把构建好的重组表达质粒pET30a-DuIFN-α，转化宿主菌BL21(DE3)PlysS，挑含重组阳性质粒的单菌落到含有浓度为50ug/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。按1％的接种量将过夜培养的菌液接种于100mL的Kan+/LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h后，菌液光密度值至0.4时马上加入1mM IPTG诱导4h。离心收集诱导的细菌，用PBS洗涤3次，沉淀用PBS溶液重悬起，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5min，然后进行超声处理，以4℃，12000g离心10min，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳；(9)重组表达质粒pBlueBacHis2A-DuIFN-α转染昆虫细胞Sf9细胞株，具体操作如下将10ul(0.5ug)BAC-N-BlueTM Linear DNA(线性化的AcMNPV DNA)，4ul(1ug/ul)重组质粒DNA，1000ul不含血清和添加成份的Grace’s培养基，20ul(1mg/ml)转染试剂(使用前混均)，混均10sec，室温作用15min，转移至用不含血清和添加成份的Grace’s培养基洗涤两次的Sf9细胞单层上，室温下作用4h之后，往每个培养孔中加入3ml含血清的Grace’s完全培养基，27℃培养箱中培养；(10)噬斑分析筛选重组病毒(蓝色噬斑)，具体操作如下将所收获的第四和第八天转染液(重组病毒液)依次稀释2-3个梯度加到弃去培养基的Sf9细胞单层上，作用1h，弃上清，将含血清的完全培养基和2.2％低熔点琼脂糖按1∶1比例混合，加X-gal至终浓度150ug/ml，立即快速加到细胞上，等胶凝固后，倒置6孔培养板，放于27℃培养箱中培养，直到看到噬斑出现；(11)确定真核表达系统中表达重组鸭α-干扰素的最佳表达时间和MOI(感染复数)，具体操作如下①将PCR鉴定的第四轮重组病毒感染2×106对数期Sf9细胞，放于27℃培养箱中培养，直至细胞完全裂解，制备高滴度病毒液；以10倍的梯度将高滴度病毒液稀释至10-6和10-7，分别做噬斑分析，通过计算噬斑数，根据公式滴度(pfu/ml)＝(1/稀释度)×噬斑数，确定其滴度；②根据公式接种所需高滴度病毒液的体积(ml)＝(感染复数×细胞数)/滴度，计算出感染复数(MOI)为5、7和10时，需要接种高滴度病毒液的体积。并设置不接病毒液的Sf9细胞对照。分别于感染后的第1-5天收获细胞，制备SDS-PAGE样品；(12)按最佳表达时间和MOI接种病毒，感染Sf9细胞，在Sf9细胞中表达鸭α-干扰素。
权利要求
1.制备用于在大肠杆菌和昆虫细胞中表达鸭α-干扰素基因的方法，其特征是(1)用淋巴细胞分离液分离鸭外周血单核细胞，植物血凝素诱导培养鸭外周血单核细胞，收获诱导培养的细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA；(2)设计扩增鸭α-干扰素基因的特异性引物，如下上游引物P1 20bp5′-GCACAACCCAGGATCCACCA-3′，引入BamH I酶切位点；下游引物P2 19bp5′-GTGCGCGTGTGGGGTACCT-3′；(3)利用RT-PCR技术扩增鸭α-干扰素基因；(4)对鸭α-干扰素基因进行克隆、测序鉴定；(5)利用BamH I、Sal I这两个多克隆位点，将鸭α-干扰素基因定向亚克隆至原核表达载体pET30a和昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上；(6)重组表达质粒pET30a-DuIFN-α转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS；(7)确定原核表达系统中表达鸭α-干扰素的最佳诱导时间和IPTG浓度；(8)鸭α-干扰素在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中的诱导表达；(9)重组表达质粒pBlueBacHis2A-DuIFN-α与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞Sf9细胞株；(10)噬斑分析筛选重组病毒；(11)确定真核表达系统中表达重组鸭α-干扰素的最佳表达时间和感染复数；(12)按最佳表达时间和MOI接种病毒，感染Sf9细胞，在Sf9细胞中表达鸭α-干扰素。
2.根据权利要求1所述的制备用于在大肠杆菌表达鸭α-干扰素基因的方法，其特征是所述的鸭α-干扰素在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中诱导表达的操作方法为把构建好的重组表达质粒pET30a-DuIFN-α，转化宿主菌BL21(DE3)PlysS，挑含重组阳性质粒的单菌落到含有浓度为50ug/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；按1％的接种量将过夜培养的菌液接种于100mL的Kan+/LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h后，菌液光密度值至0.4时马上加入1mM IPTG诱导4h；离心收集诱导的细菌，用PBS洗涤3次，沉淀用PBS溶液重悬起，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5min，然后进行超声处理，以4℃，12000g离心10min，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳。
3.根据权利要求1所述的制备用于在昆虫细胞中表达鸭α-干扰素基因的方法，其特征是所述重组表达质粒pBlueBacHis2A-DuIFN-α转染昆虫细胞Sf9细胞株的操作方法为将10ul浓度为(0.5ug/ulBAC-N-BlueTM Linear DNA，4ul浓度为1ug/ul重组质粒DNA，1000ul不含血清和添加成份的Grace’s培养基，20ul浓度为1mg/ml转染试剂，混均10sec，室温作用15min，转移至用不含血清和添加成份的Grace’s培养基洗涤两次的Sf9细胞单层上，室温下作用4h之后，往每个培养孔中加入3ml含血清的Grace’s完全培养基，27℃培养箱中培养；将所收获的第四和第八天转染液依次稀释2-3个梯度加到弃去培养基的Sf9细胞单层上，作用1h，弃上清，将含血清的完全培养基和2.2％低熔点琼脂糖按1∶1比例混合，加X-gal至终浓度150ug/ml，立即快速加到细胞上，等胶凝固后，倒置6孔培养板，放于27℃培养箱中培养，直到看到噬斑出现。
4.根据权利要求1和3所述的制备用于在昆虫细胞中表达鸭α-干扰素基因的方法，其特征是所述的确定真核表达系统中表达重组鸭α-干扰素的最佳表达时间和感染复数的操作方法为①将PCR鉴定为纯的第四轮重组病毒感染2×106对数期Sf9细胞，放于27℃培养箱中培养，直至细胞完全裂解，制备高滴度病毒液；以10倍的梯度将高滴度病毒液稀释至10-6和10-7，分别做噬斑分析，通过计算噬斑数，根据公式滴度(pfu/ml)＝(1/稀释度)×噬斑数，确定其滴度；②根据公式接种所需高滴度病毒液的体积(ml)＝(感染复数×细胞数)/滴度，计算出感染复数(MOI)为5、7和10时，需要接种高滴度病毒液的体积；并设置不接病毒液的Sf9细胞对照；分别于感染后的第1-5天收获细胞，制备SDS-PAGE样品。
全文摘要
本发明涉及制备用于在大肠杆菌和昆虫细胞中表达鸭α－干扰素基因的方法。包括编码鸭α－干扰素的基因的克隆，含鸭α－干扰素基因的原核表达载体和重组昆虫杆状病毒转染载体的构建，用所述含鸭α－干扰素基因的重组原核表达载体转化大肠杆菌和诱导表达，用所述含鸭α－干扰素基因的重组杆状病毒转染昆虫细胞及在昆虫细胞中的表达等。通过本方法制备的产品为研究鸭α－干扰素生物活性及其作用机理提供了基础，也可制备成抗病毒的药物。
文档编号C12P21/02GK1861796SQ200510009978
公开日2006年11月15日 申请日期2005年5月13日 优先权日2005年5月13日
发明者王君伟, 任桂萍, 许丽娜, 李洪涛 申请人:东北农业大学