增或测序的用途。
[0043] 起点为在患者中识别的RT，其中所述的患者未使用抗逆转录病毒的药品治疗 过，并且被HIV-1 0组（毒株ESP49)(具有多肤序列SEQIDNO1的RT0_WT)所感染 (〇uinonos-Mal.cuetal.Virology1997 ；236:364-373 ；Menendez-Ariasetal.J.Biol. 化em. 2001 :276:27470-27479)。将运种RT的p66亚基的核巧酸序列克隆至表达载体中， 该表达载体包含合适的限制性位点，W及为了获得并纯化所述的酶的在C末端处的组氨酸 尾部（其后为终止密码子）（具有核巧酸序列SEQIDNO2)。使用该构造并且在定点诱变 过程之后，得到4种变体，其显示比起始酶（RT0_WT)更高的热稳定性并保持了复制保真度。 RT的运种改变潜在地用于扩增困难的RNA，即，包含二级结构的那些和/或富含G:C碱基对 的序列。
[0044] 本发明中所述的多核巧酸和多肤序列的概述示于表1中。
[0045]
[0047] 因此，本发明的第一个目的设及多肤，下文称为本发明的多肤，其编码了由HIV-10 组分离得到的具有RT活性的蛋白质；在高溫下具有较高的稳定性；在超过75Γ的溫度下具 有比WT酶更高的活性，从而保持了其复制可靠性；并表征为：其氨基酸序列与亲代序列SEQ IDNO1具有至少50%的一致性，并且在其氨基酸序列中包含W下位置的改变（例如取代、 删除和/或加入）：
[0048] -与所述的亲代序列的位置358同源的位置，其使用氨基酸精氨酸（时替代原始氨 基酸赖氨酸化）（突变K358R);
[0049] -与所述的亲代序列的位置359同源的位置，其使用氨基酸甘氨酸（G)替代原始氨 基酸丙氨酸（A)(突变A359G);
[0050] -与所述的亲代序列的位置360同源的位置，其使用氨基酸丙氨酸（A)替代原始氨 基酸丝氨酸（S)(突变S360A)。
[0051] 因此，在本发明的优选的目的中，在本发明的多肤中的取代为K358R，A359G和 S360A(逆转录酶RT0_3M)。在本发明的具体的实施方案中，本发明的多肤相当于SEQIDNO 3。 阳05引 RT具有最大的DNA聚合酶活性的溫度（取决于RNA或DNA)被称为最佳溫度。在 高于该溫度时，部分由于RT的热变形而使得催化活性降低。术语"热稳定性"是指当经历 升高的溫度时，例如通常升高至至少50°C的溫度、优选为至少63°C、更优选为至少68°C并 且还要更优选为至少75°C，RT所显示的稳定性。
[0053] 可W通过不同类型的检测来测定本发明的RT的热稳定性。例如但不限于可W通 过分析在RT-PCR(其可W是定性的或定量的）中使用信使RNA模板合成DNA的过程中所获 得的产物的量来估计所述的热稳定性。为了实施上述过程，在升高的溫度下进行逆转录酶 的第一反应，然后通过PCR扩增所获得的互补DNA。在运些反应后所获得的产物的量构成了 在实施逆转录酶反应的溫度下RT稳定性的量度。对琼脂糖凝胶中的产物的分析能够定性 地评价反应的效力。类似地，可W通过实施PCR来测定逆转录阶段的产率，从而测定的ΔCt 值，其中ΔCt=Ct-Ct(参照），其中Ct为其中观察到明显扩增的周期，Ct(参照）为由用 作参照的RT所获得的Ct值的平均值。
[0054] 如本说明书中所用，"在升高的溫度下的合成反应"是指在至少50°C的溫度下、优 选为至少63°C、更优选为至少68°C、更优选为至少75°C、并且还要更优选为至少78°C下实 施的反应，更优选为逆转录反应。 阳化5] 热稳定性"增加"或"增强"的RT定义为与进行比较的RT的热稳定性明显增加或 增强（使用统计学标准）至少1. 5倍、更优选为至少2倍、还要更优选为至少3倍、并且还 要更优选为至少4倍的RT。
[0056] 术语"复制保真度"是指由RT催化的DNA聚合过程的精确性，其受到在合成核酸 (作为模板）的互补DNA过程中区分正确和错误底物（核巧酸或模板-引物复合物）的能 力的影响。
[0057] 可W通过多种类型的检测来分析本发明的RT的保真度，例如但不限于细胞培养 物中的保真度检测或"体外"保真度检测（基因或生物化学）。
[0058] 在生物化学检测中，纯化的RT用于测定在特定的条件（pH、底物浓度等）下在RNA 或DNA模板上的动力学常数。按照运种方式，在稳态和前稳态下，可W获得RT的DNA合成 (RNA依赖的或DNA依赖的）的保真度的动力学参数。在稳态下用于错误引入的生物化学检 测是W测定在引物的3'末端引入核巧酸的动力学常数化。。,和Km)为基础的，并提供了用于 核巧酸的RT的选择性的估计。通过在形成RT/模板-引物二元复合物之后，在不同浓度的 dNTP存在下，测量引物的3'末端（事先使用[丫 32p]ATP标记该引物的5'末端）的核巧酸 的引入，从而测定动力学参数。通过在聚丙締酷胺凝胶上的电泳来分析所得的产物。将所 得的数据拟合Michaelis-Menten等式，并针对正确的和错误的核巧酸来测定参数k。。,（引 入的速率）和Km(Michaelis-Menten常数）。错误引入的效率化。。）定义为由错误的核巧 酸所获得的催化效率化。。,/1〇与由正确的核巧酸所获得的催化效率之间的比例。因此，RT 的较高的保真度意味着错误引入的效率较低。
[0059] 为了使新生DM中的错误被固定，引入错误的核巧酸是不够的，RT还必须能延伸 由于运种错误的引入而生成的错配末端。通过错配延伸检测来进行运种保真度的测量。在 运些检测中，计算在稳态下用于在2种类型的模板-引物复合物上引入正确的核巧酸的动 力学常数：具有正确配对的3'末端的复合物W及具有错配的3'末端的相同的复合物。错 配的延伸效率定义为用于延伸错配末端所获得的kt3t/Km与用于延伸正确配对的末端 所获得的^t/Km之间的比例。 W60] 前稳态下生物化学的检测评估了短时间规模（例如在毫秒级数下）下RT接合及 引入dNTP的能力。按照运种方式，可W计算dNTP与RT/模板-引物二元复合物之间相互 作用的亲和常数化d)化及聚合常数化。。1)。在包含配对的或错配的3'-0H末端的模板-引 物复合物上引入正确的和错误的核巧酸所获得的iw/Kd值，或者由在包含配对的或错配的 3' -0H末端的模板-引物复合物上引入正确的核巧酸所获得的kpDi/Kd值，来测定错误引入 的效率和错配末端的延伸的效率。
[0061] 在由一条链上最初除去与lacZ基因相应的序列之后，通常使用M13mp2隧菌体 的双链DNA作为DNA合成反应的模板-引物，实施最常用的基因检测，命名为"正向突变 检测"。在RT和高浓度的dNTP存在下进行DNA合成反应。在使用反应产物进行细菌转化 后，突变体在包含X-Gal(5-漠-4-氯-3-吗I噪基-β-D-半乳化喃糖巧）和IPTG(异丙基 β-D-l-硫代半乳糖化喃糖巧）的培养基中识别为蓝色/白色隧菌斑。按照运种方式，如果 在DNA合成反应中不具有错误，则结果为深蓝色的隧菌斑。相反，引入一个或多个错误意味 着部分或全部失去了α-互补，运导得到蓝色或白色的隧菌斑。可W将由运些隧菌斑回收 得到的DNA测序，从而测定在由RT引入突变的基因组中确切的数量、类型和位置。
[0062] 复制保真度"增加"或"增强"的RT定义为与未修饰的RT的复制保真度相比增加 或明显增加（使用统计学标准）通常为至少1.5倍、更优选为至少2倍、还要更优选为至少 3倍、并且还要更优选为至少4倍的RT。例如在核巧酸引入的生物化学检测中，在由修饰的 RT所获得的值明显高于未修饰的RT的值（使用统计学标准）时（通常为至少1. 5倍、更 优选为至少2倍、还要更优选为至少3倍、并且还要更优选为至少4倍），考虑保真度增加。 例如在基因检测（"正向突变检测"）中，当由修饰的RT所获得的突变的频率明显增加（使 用统计学标准）时（通常为至少50% (1.5倍）、优选为至少2倍、更优选为至少3倍、并且 还要更优选为至少4倍），为保真度增加。
[0063] 除了携带变化K358R，A359G和S360A的RT(RT0_3M)W外，描述了HIV-1 0 组的RT 的其他变体，该变体包含除了K358R/A359G/S360A组合（通常全部改变）W外的变化，并且 改良了WTRT的热稳定性，即，在升高的溫度下使用RNA作为模板来合成DNA的能力。运些 氨基酸变化和插入属于（例如但未限定本发明的范围）W下几组：
[0064] e)在与SEQIDNO1的位置69同源的位置处，通过插入2个氨基酸丝氨酸和甘氨 酸（SSG)来替代氨基酸苏氨酸灯）（突变T69SSG); W65]f)在与SEQIDNO1的位置355同源的位置处，通过氨基酸丙氨酸（A)来替代氨 基酸苏氨酸灯）（突变T355A);
[0066] g)在与SEQIDNO1的位置357同源的位置处，通过氨基酸蛋氨酸（M)来替代氨 基酸谷氨酷胺怕）（突变Q357M);
[0067] h)在与SEQIDNO1的位置478同源的位置处，通过氨基酸谷氨酷胺（曲来替代 氨基酸谷氨酸巧）（突变E478曲。
[0068] 因此，在本发明的另一个优选的目的中，本发明的多肤在氨基酸K358R/A359G/ S360A中具有变化，并且还具有取代T355A和Q357M(逆转录酶RT0_5M)。在具体的实施方 案中，本发明的多肤相当于SEQIDNO5。
[0069] 在本发明的另一个优选的目的中，本发明的多肤在氨基酸K358R/A359G/S360A中 具有变化，并且还具有T69SSG(逆转录酶RT0_T69SSG_3M)。在具体的实施方案中，本发明的 多肤相当于沈QIDNO7。 阳070] 在本发明的另一个优选的目的中，本发明的多肤在氨基酸K358R/A359G/S360A中 具有变化，并且还具有替代E478Q(逆转录酶RT0_E478Q_3M)。在具体的实施方案中，本发明 的多肤相当于SEQIDNO9。
[0071] 此外，本发明的多肤可W具有小的多肤片段位于侧翼，运些小的多肤片段的存在 是多肤在合适的载体中表达所必需的和/或有利的，并且是本领域已知的。其中在N-末端 具有3个氨基酸（MNS，其为蛋氨酸-天冬酷胺-丝氨酸），包含该序列有助于翻译的起始W 及容留用于构建包含逆转录酶的表达载体的限制性核酸内切酶识别位点。此外，能够改良 多肤的纯化的序列也被包含其中，例如在C-末端处的组氨酸残基尾部，此时其优选地由至 少6个组氨酸残基组成。本发明的多肤的位于侧翼的残基形成了新的多肤序列，该序列包 含本发明的多肤并保持了其逆转录酶的活性。
[0072] 因此，在本发明的另一个优选的目的中，逆转录酶RT0_3M，RT0_5M，RT0_T69SSG_3M 和RT0_E478Q_3M在N-末端具有MNS侧翼序列并且在C-末端具有组氨酸尾部，从而得到具 有逆转录酶活性的多肤：RT0_3M*，RT0_5M*，RT0_T69SSG_3M*和RT0_E478Q_3M*，其在具体 的目的中分别相当于多肤序列沈QIDNO13,沈QIDNO15,沈QIDNO17和沈QIDNO 19。
[0073] 可W通过基因改造或重组DM技术来获得在由HIV-1 0组分离得到的RT的"野生 型"多肤序列中引入了如本发明所述的突变，例如通过定点诱变或随机诱变使编码RT的序 列突变；或者可W通过化学合成核巧酸序列来获得所述的突变，其中所述的核巧酸序列编 码了携带所述的突变的RT的p66亚基。
[0074] 如本说明书中所用，术语"突变"是指一个氨基酸被另一个不同的氨基酸取代。在 序列中单个氨基酸在本发明中表示为XN，其中X为序列中的氨基酸（其设计为氨基酸命名 系统的被广泛接受的单字母代码），二N为序列中的位置。氨基酸序列中的取代点突变表示 为X1NX2,其中XI为未突变的蛋白质序列中的氨基酸，X2为突变的蛋白质序列的新的氨基 酸，而N为氨基酸序列中的位置。
[0075] 此外，使用所提供的信息，本领域的专家能够将本发明中上文所提及的突变结合 起来，从而生成在升高的溫度下具有相似的或改良的新的RT变体。一种可能性是上文提及 的位置中的氨基酸的保守取代。因此，例如保守取代为保持被取代氨基酸的极性和电荷特 征的取代。例如赖氨酸和精氨酸为其中在中性抑下侧链带正电荷的氨基酸，因此赖氨酸变 成精氨酸或者精氨酸变成赖氨酸表示保守变化。根据保守性，构成所有天然蛋白质的基础 的20种氨基酸分类成W下几组：（i)芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）；（ii)脂 肪族氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸）碱性可电离的氨 基酸（组氨酸、赖氨酸和精氨酸）；（iv)酸性可电离的氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）；(v)氨 基酸酷胺（天冬酷胺和谷氨酷胺）；W及（Vi)径基化的氨基酸（丝氨酸和苏氨酸）。一些 作者将半脫氨酸包含在最后一组中。
[0076] 编码本发明的多肤的本发明所述的多核巧酸相当于由编码RT(由HIV-1 0组的毒 株分离得到的（SEQ