初乳中的肽的纯化的制作方法

专利名称：初乳中的肽的纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及初乳中肽的纯化。本发明尤其涉及到初乳中的Colostrinin的纯化。
背景技术：
初乳是一种粘性的乳腺分泌物，其特征在于其中存在新生哺乳动物正常发育所必需的多种成分。它是分娩后的最初的乳汁分泌物并含有高浓度地免疫球蛋白(IgG、IgM和IgA)和非特异性蛋白质。出生后约4-5天，初乳被成熟母乳所取代。与成熟母乳相比，初乳具有低的糖含量，但更富含脂质、矿物盐和免疫球蛋白。初乳还含有多中漂浮细胞，例如粒细胞和基质细胞、中性白细胞、单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞。初乳还富含生长因子、激素和细胞因子。
在初乳中所存在的蛋白质中，已知酪蛋白是最普遍的形成团聚体(微团)的蛋白质，这在所有的哺乳动物中是类似的。许多蛋白质和肽通过弱的疏水力和离子作用力被结合到那些团聚体上。结果所形成的蛋白质微团网状物具有诱捕具有不同特性的小分子量化合物例如脂质、碳水化合物和肽的能力，形成了独特的同质溶液。该微团帮助这些微分子比较均匀地分散到整个初乳中，并且还防止它们形成非期望的团聚体。
已经报道了来自乳的众多具有不同生物学活性的肽。一些肽以其天然状态存在，一些肽可以经母乳蛋白质的酶促蛋白质水解被释放出来。尤其感兴趣的是那些被结合到酪蛋白微团上的天然存在的肽。除了酪蛋白、钙和磷酸盐以外，所述微团还含有柠檬酸盐、小离子(minorions)、脂酶和纤溶酶以及各种包载在这些结构中的肽。因此，对许多来自于乳的成分的下游纯化处理近来变成了乳品加工业中最具挑战性的工作。
通常，对乳的下游处理是通过添加凝乳酶以产生凝乳块而凝结酪蛋白开始的，然后将该凝乳块从液体乳清中分离，之后它们可以被加工和熟化以制备各种各样的乳酪。凝乳酶分解了κ-酪蛋白分子，这使得酪蛋白微团整体坍缩。结果，乳中的许多可溶性成分被包载在该沉淀物中而被忽视。尤其是具有高亲水指数的小分子肽，例如Colostrinin，可能被损失。
最初用于获得Colostrinin的纯化方案(Janusz et al.)包括依赖于pH的酪蛋白沉淀；及随后的各种层析步骤，包括离子交换层析、亲和层析和分子筛；并结合硫酸铵沉淀。尽管这一方法是可重复的，但是却很费力且很难被扩大化以进行工业应用。其后，许多利用薄膜过滤的方案被发展起来用于从乳和初乳中回收低分子量肽，但是所有这些方法都有缺点。
切向流过滤被用于乳品加工业中的一个标准方案中以用于分离乳成分。例如，Kutzko et al.在发明名称为“乳中的生物学活性肽的纯化”的美国专利6,268,487中公开了一种通过切向流过滤分离乳成分的方法。
同样，Roger et al.在发明名称为“从乳清中获得富含α-乳清蛋白的产品的方法及其用途”的美国专利4,485,040中提出了一种超滤法以在介于6.3和7之间的pH值(例如6.6)和介于30℃和60℃之间的温度条件下、在一薄膜上分离乳成分，该薄膜的截断值大于5,000(例如50,000)。
Wilson et al.在发明名称为“从初乳中获得转移因子的方法、由该方法所获得的转移因子及其用途”的美国专利4,816,563也描述了超滤法的使用。事实上，乳或初乳的过滤是现今的乳品加工业中的标准程序。Wilson et al.描述了使用一种制剂来从初乳中制备转移因子。其中合适的制剂包括醇、酮和聚乙烯乙二醇。但是没有任何关于从初乳中回收Colostrinin的描述。
US 5,216,129公开了一种用于从浓缩在蛋白质中的乳清产品中获得κ-酪蛋白-糖巨肽的方法。该方法包括使用溶液容积的5％-25％浓度的乙醇。所述血清产品不Colostrinin。
UK 1,438,008公开了一种用醇从蛙的皮肤中提取特定的八肽的方法。
JP 520062796公开了一种使用醇等从Ribia akane Nakai的根提取环肽的方法。
J Pharm Pharmaceut Sci，Vol 5，2002.MEC Lutsiak et al.，″Analysisof peptide and lipopeptide content in liposomes″，p279-284中公开了一种用于从脂质体提取肽的方法。
Journal of Antibiotics，Vol XL，1987，E Meyers et al.，″Xylocandina new complex of antifungal peptides I.Taxonomy，isolation andbiological activity″，p1515-1519中公开了一种从洋葱假单胞菌细菌中提取肽的方法。
Acta Endocrinologica，vol 111，1986，WF Blum et al.，″Isolation andpartial characterisation of six somatomedin-like peptides from humanplasma Cohn fraction IV″，p271-284中公开了使用乙醇从人血浆中提取生长调节素样肽。
J Dairy Research，vol 54，1987，DS Home，″Ethanol stability ofCasein micelles-a hypothesis conceming the role of calcium phosphate″，p389-395中公开了关于酪蛋白微团结构和钙释放的假设性详细说明。
Ir.J.Fd.Sci.Technol.，vol 9，1985，MM Hewedi et al，″Recovery ofmilk protein by ethanol precipitation″，p11-13中公开了一种用乙醇沉淀乳蛋白的方法。
Colostrinin，也被称为Colostrinine，富脯氨酸多肽或PRP于1974年被首次从绵羊初乳中分离(Janusz et al，FEBS Lett.，49，276-279)。
WO98/14473中描述了Colostrinin的某些治疗用途，尤其是在治疗老年性痴呆方面的用途，该专利的内容在此通过引用被并入本发明。在该专利申请中描述了Colostrinin在当时可测定到的物理学特性。尽管所述物理学特性是正确的，自该申请提交后对Colostrinin的理解已经发生了改变。WO98/14473还描述了一种用于从未加工过的初乳中提取Colostrinin的方法，这一方法通常被称做“Janusz”方法。这一方法现在是从初乳中提取Colostrinin的最为根本的方法。该方法的缺点是很难获得工业化的规模，且由该方法所得的产量低。
WO00/75173描述了许多在Colostrinin中所发现的肽，WO02/46211描述了许多可在Colostrinin中被发现的其它肽，该专利的内容在此通过引用被并入本发明。
对Colostrinin相当感兴趣的是存在各种只能从初乳中被分离出来，而不能从成熟乳汁中分离出来的多肽。分娩后的期间内，Colostrinin在乳腺分泌物中的浓度骤然减少，直至分娩后的第3天结束。Colostrinin肽如此短的生存期表明了它们在幼儿免疫系统的早期发育中的重要作用并保护了新生儿免受环境的影响。
近来还发现了Colostrinin是以两种形式存在，游离的和团聚的(结合的)。游离形式的Colostrinin被认为是保护新生哺乳动物免遭氧化性应激所必需的，所述应激在出生后立即出现。结合或团聚形式被认为认为是在出生后的一段延长的时期内维持了这一功能。此外，Colostrinin的结合形式被认为参与了不同的器官和系统的发育和或保护。当没有氧化性应激问题时，游离的Colostrinin浓度开始降低。当游离形式被耗尽时，Colostrinin的结合形式被慢慢释放到体液中以调节生理学功能。这一模型在关于分娩后特定的Colostrinin肽从初乳中逐渐消失的研究中找到了依据。
Colostrinin复合物目前被认为组成了至少5个亚组的肽；每一个亚组有其自身的特有的疏水模式。证据表明由于特殊排列的非极性、极性、芳香族、正电荷和负电荷氨基酸的存在，这些肽有形成团聚体的倾向。此外，所述多肽的氨基酸组成及其疏水特性进一步表明这一团聚能力。
从目前所能得到的信息来看，本发明人已经发现当Colostrinin肽以其天然形式存在时具有最佳的生物学活性。当Colostrinin肽被纯化时，它们开始相互作用形成具有表观上较弱的生物学活性的非共价结合的复合物。Colostrinin被认为是超过62种不同的肽的混合物，其衍生自前体蛋白质例如膜联蛋白、β-酪蛋白、一种假定的β-酪蛋白同系物和与目前GenBank数据库中的任一特定蛋白质不具有同源性的其它蛋白质。

发明内容
本发明的一个目的是开发一种用于从含有较高分子量的物质的液体中提取和回收肽的新方法。本发明的一个特定的目的是开发一种从未加工的初乳中纯化Colostrinin的新方法，使得Colostrinin可以以具备生物学活性和足够纯的形式以高产量进行制备。该纯化方法将回收大多数游离形式和团聚形式的Colostrinin肽。按每单位重量来说，不含有污染物和自身团聚体的纯化的Colostrinin将更具活性。本发明的另一目的是开发一种纯化方案，该方案将提供由特定的生物学活性所表征的一组均一的肽。
本发明是基于这样一个出乎意料的发现简单的提取方法可以被用以从初乳中以高的纯化程度提取Colostrinin。
本发明的一个方面提供了一种用于从哺乳动物初乳中回收肽的方法，该方法包括将所述初乳与一种醇混合以形成一醇相和一沉淀物，所述醇相包括醇和至少一部分待回收的肽；将所述醇相从所述沉淀物分离；和回收所述醇相。
本发明尤其适用于从初乳中纯化Colostrinin，以下的描述主要针对于这一特殊的应用。
所述醇可以是任何当与初乳混合时能形成包含Colostrinin肽的醇相并能沉淀不需要的较高分子量的物质的醇。
所述醇可以是直链的或支链的，也可以含有一个或多个羟基；优选一个羟基。优选地，所述醇含有1-5个碳原子，更优选1-4个碳原子，最优选1-3个碳原子。本发明人已经发现用甲醇或乙醇获得了最佳结果。
所述醇理想地是以浓缩的形式被添加到初乳中优选所述醇为至少80％纯，更优选至少95％纯，最优选基本上100％纯。
添加到初乳中的所述醇的量优选例如能使得总组合物中的醇浓度为40％(v/v)-80％(v/v)，更优选50％(v/v)-70％(v/v)，甚至更优选55％(v/v)-65％(v/v)，最优选达60％(v/v)。
将所述醇与未加工的初乳混合的步骤(称做“提取”)优选在室温下搅拌进行10-30分钟。这形成了一含有酪蛋白和其它蛋白质的沉淀物，而Colostrinin以醇相保留在溶液中。本发明的一个重要的、出乎意料的特征是Colostrinin肽几乎全部以醇相保留在溶液中，而初乳的其它成分被沉淀下来。
随后该沉淀物可以通过任一传统的方法从醇相中除去，优选以约15,000g进行离心，且包含Colostrinin的所述醇相被回收。然后从所述醇中优选通过蒸发分离出Colostrinin，以形成被回收的富Colostrinin相(其基本上为Colostrinin的水溶液)。
从Colostrinin肽除去醇的步骤可以通过蒸发或广泛的超滤进行，并结合水或缓冲液交换；但优选蒸发。蒸发可以在温度典型地为10℃-50℃的范围内进行。优选约30℃的温度。蒸发或过滤可以在30分钟-12个小时或者更长(例如过夜)的一段时期内进行。尽管超滤是一个可行的选择，但是采用蒸发的回收率更高。有望通过在真空中进行蒸发除去醇。除去醇后，可以将足够量的水添加到富Colostrinin相中以将工作液的容积提升至约最初的体积。
在一个优选的实施方式中，来自醇-提取步骤的沉淀物被用更多量的醇充分洗涤，并再次分离和回收醇相。该第二次回收的醇相可以含有一些Colostrinin肽，它们在第一次提取的时候被代入沉淀物中。第二次回收的醇相可以被直接添加到从第一次提取回收的醇相中，或者该醇的一些或全部可以被先除去。在醇被除去之后，残留物可以被直接添加到富Colostrinin相中。
任选地，在除去醇之后，可以再进行一次离心步骤以将除去醇的期间所形成的任何沉淀物从剩余的溶解片段中除去。
在本发明一个特别优选的实施方式中，向所述醇相，或优选向富Colostrinin相中添加一种沉淀剂(优选在任一额外的离心步骤之后)。沉淀剂的目的是促使Colostrinin肽的沉淀。本发明人已经发现硫酸铵尤其适于用做沉淀剂，但其他能实现相同目的材料也能代替使用或补充使用。最有效的沉淀剂是带有多重电荷的阴离子的盐，例如硫酸盐、磷酸盐和柠檬酸盐。对于阳离子而言，可使用单价离子，NH4+优于K+，而K+优于Na+。典型的沉淀剂是钠、钾和铵的硫酸盐、磷酸盐和柠檬酸盐，然而硫酸铵是最为优选的。沉淀剂可替换为有机多聚体，例如聚乙烯乙二醇。用沉淀剂进行沉淀进一步降低了酪蛋白污染并进一步纯化了Colostrinin肽片段，使得形成了基本上不含IgG的肽的均一的肽池，该肽将在约两天的时间内被分离。这一方法使得Colostrinin肽的快速分离成为可能。
沉淀剂的添加量优选能提供30％(w/v)-80％(w/v)的饱和，优选40％(w/v)至60％(w/v)的饱和，最优选达50％(w/v)的饱和。饱和百分率是指沉淀剂在液体中的饱和，例如硫酸铵，沉淀剂优选以饱和的水溶液的形式添加(即100％(w/v)的饱和)。
但是，沉淀剂也可以以少量的晶体形式添加，每次添加后继以剧烈的搅拌以避免局部饱和，例如搅拌约30分钟。这可以进行至知道全部沉淀剂都被溶解。这一技术可能花费几个小时，因此较不为优选。
沉淀剂的添加使得Colostrinin肽从溶液中被沉淀下来。当添加完成后，优选将该混合物放置一段时间，典型地为30分钟，可能伴随搅拌，或优选伴随震荡。
在这一阶段，所述混合物包含一水液相和一沉淀物。所述液相包含溶解在其中的沉淀剂，还可能包含一些在醇提取步骤中未被沉淀的更高分子量的物质。所述沉淀物包含Colostrinin肽。优选通过以15,000g的离心力进行离心随后将所述液相从沉淀物除去，并回收所述沉淀物。
被回收的沉淀物优选被溶解在所必需的最小量的水中；继以透析，典型地是用0.01M PBS(磷酸盐缓冲溶液)或水进行。进行该透析步骤以除去过量的离子，尽管一些沉淀剂离子可能残留下来。然后被透析后的溶液可以通过离心被澄清，然后被冻干。最终的物质包含分离的Colostrinin肽，其可以被储存在-20℃以备将来用于制备药物、营养保健品和其它组合物。这些都可以通过传统方法来制备。
可以进行各种质量控制试验以确保最终的物质适用于制备药物这样的试验是本领域技术人员所已知的，但可以包括SDS PAGE、等电聚焦电泳图谱、氨基酸分析、通过使用单特异性抗体的ELISA方法测定Colostrinin的抗原成分、测定诱导细胞因子例如γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)的能力以及测定抗氧化特性。最终的物质不银该含有任何高分子量蛋白质。如果质量控制试验表明存在杂质，则最终的物质需要被进一步纯化。有几种可以从最终物质中除去杂质的方法，例如尺寸排阻层析、羟磷灰石层析、反向层析、超滤和高氯酸进行分馏。
尺寸排除层析的例子包括以下步骤。必其中的杂质必须被除去的物质在pH7.2(浓度2.0mg/ml)、100mM的磷酸盐缓冲液中被重构。将10毫升新鲜的被重构的物质置于一被Bio-Gel P30(BioRad)填充并被相同的缓冲液平衡过的柱(2.5cm直径×90cm长)上。以流速20ml/小时层析过夜。收集样本(4ml)，根据SDS PAGE分散制备对应于低分子量蛋白质和肽(＞18K)的最终的物质池。
羟磷灰石层析的例子包括以下步骤。其中的杂质必须被除去的物质在pH 6.5(浓度2.0mg/ml)、10mM的磷酸盐缓冲液中被重构。将10毫升新鲜的被重构的物质置于一被Bio-Gel HTP(BioRad)填充并被相同的缓冲液平衡过的柱(0.7cm直径×6cm长)上。以流速0.25ml/小时进行层析。用平衡缓冲液洗涤柱以除去所有未结合的物质。随后，用线性梯度(10mM-500mM)的磷酸盐缓冲液处理洗脱液。收集样本(4ml)，根据SDS PAGE分散制备对应于低分子量蛋白质和肽(＞18K)的最终的物质池。
反向高效液相层析的例子包括以下步骤。其中的杂质必须被除去的物质在0.1％(V/V)三氟乙酸(TFA)中以浓度2.0mg/ml)被重构。将5毫升新鲜的被重构的物质置于一填充有10μm Nucleosil 100 C18(Knauer)并被于0.1％TAF中的20％的乙腈平衡过的柱(8mm直径×150mm长)上。以1.0ml/分钟的流速进行层析。用平衡缓冲液洗涤柱以除去所有未结合的物质。随后，用于0.1％TAF中的100％的乙腈处理洗脱液。收集样本(2ml)，根据SDS PAGE分散制备对应于低分子量蛋白质和肽(＞18K)的最终的物质池。
高氯酸分馏的例子包括以下步骤。其中的杂质必须被除去的物质在pH7.2(浓度2.0mg/ml)、100mM的磷酸盐缓冲液中被重构。高氯酸(0.45M HClO4)被添加至浓度为0.15M，将该混合物在室温下搅拌1小时。结果所得的沉淀物通过离心被除去，含有被纯化的CLN的上清液用1M KOH调节至pH7.0并放置过夜。KClO4晶体通过过滤器过滤被除去，上清液用水透析过夜。在本发明的另一个实施方式中，高氯酸分馏被用做硫酸铵沉淀步骤的替代方式。
超滤的例子包括以下步骤。其中的杂质必须被除去的物质在pH7.2(浓度2.0mg/ml)、10mM的磷酸盐缓冲液中被重构。超滤使用标准的超滤方案在Centricon+Ultracell PL-10或Hollow fiber AmiconH1P10-20中进行。
如上面所提及的那样，本发明人已经发现Colostrum包含以微团形式存在的蛋白质片段。已经观测到在用醇提取之间，当未加工的初乳被用微团破坏物质进行预处理并继以不同pH水平的微团重构剂处理时，Colostrinin可以以较高的产量被回收。因此，在本发明的一个优选的实施方式中，未加工的初乳被用微团破坏物质进行预处理，这促使微团坍塌；然后用微团重构剂处理，这被认为是破坏了初乳中的酪蛋白结构，释放更多的Colostrinin肽。
微团破坏物质优选是一种钙螯合剂，例如EDTA(乙烯-二胺-N，N，N′，N′-四乙酸)，其也结合Mg+；或具有类似特性的EGTA(乙二醇-O，-O′-二(2-氨基-乙基)-N，N，N′，N′-四乙酸)。其目的是释放一部分，优选大多数的被包载在酪蛋白微团间的肽。
微团破坏物质优选以能生成其中微团破坏物质浓度为25-250mM的溶液的量被添加。该混合物被搅拌并被静止放置10-30分钟的一段时间。可以在添加了微团溶解物质后立刻加入醇，或者，在一个更优选的实施方式中，添加微团破坏物质后，在添加醇之前，添加微团重构物质。所述微团重构物质优选是Ca2+离子来源，例如CaCl2。所述微团重构物质通过提供微团形成所必需的钙离子而具有重新形成微团的能力(重新钙化)。
在一个优选的实施方式中，在添加微团破坏物质、微团重构物质和醇之前，Colostrum被调节至pH值从5.5-8.0，更优选为5.5-7.5。最优选，Colostrum被调节至pH值从6.5-7.5。还更优选，Colostrum被调节至pH值从7.0-7.5，最优选到7.4。可以在pH计的控制下通过添加酸或碱来调节pH。
基本上不含IgG肽的均一的池可以使用根据本发明的方法而以为高产量被分离出来。通过同时中和疏水力和离子作用力，我们可以获得肽的最佳生理学结合。根据本发明通过甲醇提取所得Colostrinin肽的产量通常约为每升初乳500-600mg。用EDTA和氯化钙进行预处理，所述产量被提高到约为每升初乳4000-5000mg。这相对于现有技术中使用WO98/14473中所描述的Janusz方法所获得的产量约为每升初乳中200-300mg。
本发明可被用于从初乳中分离任何已知存在于初乳中的肽，特别是，(i)在WO00/75173中所公开的肽，即LQTPQPLLQVMMEPQGD(SEQ ID 1)；MPQNFYKLPQM(SEQ ID 2)；VLEMKFPPPPQETVT(SEQ ID 3)；LKPFPKLKVEVFPFP(SEQ ID 4)；SEQP(SEQ ID 5)；DKE(SEQ ID 6)；DPPPPQS(SEQ ID 7)；LNF(SEQ ID 8)；VLPPNVG(SEQID 9)；KYKLQPE(SEQ ID 10)；SEEMP(SEQ ID 11)；DSQPPV(SEQID 12)；FPPPK(SEQ ID 13)；VVMEV(SEQ ID 14)；DLEMPVLPVEPFPFV(SEQ ID 15)；LFFFLPVVNVLP(SEQ ID 16)；MQPPPLP(SEQ ID 17)；DQPPDVEKPDLQPFQVQS(SEQ ID 18)；VYPFTGPIPN(SEQ ID 19)；SLPQNILPL(SEQ ID 20)；TQTPVVVPPF(SEQ ID 21)；LQPEIMGVPKVKETMVPK(SEQ ID 22)；HKEMPFPKYPVEPFTESQ(SEQ ID 23)；SLTLTDVEKLHLPLPLVQ(SEQ ID 24)；SWMHQPP(SEQ ID 25)；QPLPPTVMFP(SEQ ID 26)；MHQPPQPLPPTVMFP(SEQ ID 27)；PQSVLS(SEQ ID 28)；LSQPKVLPVPQKAVPQRDMPIQ(SEQ ID 29)；AFLLYQE(SEQ ID30)；FLLYQEPVLGPVR(SEQ ID 31)；RGPFPILV(SEQ ID 32)；或ATFNRYQDDHGEEILKSL(SEQ ID 33)。
(ii)在WO02/46211中所公开的肽，即LVYPFTGPIPNSLPQNILP(SEQ.ID 34)；MIVVRLLQNEVPE(SEQ.ID 35)；SLSQSKVLPV(SEQ.ID 36)；LQTQTPVV(SEQ.ID 37)；EMPFPKY(SEQ.ID 38)；PVEPFT(SEQ.ID 39)；VPPFLQ(SEQ.ID 40)；PMFLQ(SEQ.ID 41)；EHMFV(SEQ.ID 42)；TDRD(SEQ.ID 43)；VQPT(SEQ.ID 44)；PKVK(SEQ.ID 45)；DDDE(SEQ.ID 46)；TEEV(SEQ.ID 47)；YQQE(SEQ.ID 48)；FPPQ(SEQ.ID 49)；GFGI(SEQ.ID 50)；LQS(SEQ.ID 51)；VVV(SEQ.ID 52)；GGK(SEQ.53)；DMV(SEQ.ID 54)；ESQ(SEQ.ID 55)；GRV(SEQ.ID 56)；VEE(SEQ.ID 57)；IGN(SEQ.ID 58)；FFQ(SEQ.ID 59)；RMF(SEQ.ID 60)；FPP(SEQ.ID 61)；MHH(SEQ.ID 62)；NTE(SEQ.ID 63)。
(iii)在W098/14473中所公开的九肽，即VESYVPLFP(SEQ.ID64)。
因此，本发明可以被用于分离由SEQ.ID 1-64所鉴定到的任何肽的方法中，这些肽或者是单独的，或者是一被选定的一组或全部在一起。
本发明可被应用于任何哺乳动物初乳，不过，绵羊、牛或人的初乳是最为常用的。此外，本发明除了从初乳分离Colostrinin肽以外还有更广泛的应用。本发明被认为在分离肽与蛋白质、脂质和其它生物学物质的混合物中的小肽方面有广泛的应用。
此外，根据本发明的分离方法不必自直接从哺乳动物所获得的初乳开始。优选在用本发明的分离方法处理之前对初乳进行处理，例如进行脱脂。因此，本发明可以被有效地应用于初乳衍生物，条件是该衍生物仍然包含Colostrinin。
根据本发明的方法可以被有效地应用于体液，包括脑脊髓液、唾液、血液、腹水或尿。本发明尤其适用于设计乳液中的肽的分离。
因此，应该意识到上述技术可以在从含有较高分子量成分的液体中的肽的一般性分离方面具有更为广泛的应用，所述较高分子量成分包括但不限于蛋白质、脂质、碳水化合物和/或核酸。一般而言，所述液体是以含水的液体形式存在，其具有每一种肽以及悬浮或溶解在该液体中的其它成分。因此，本发明的另一方面提供了一种用于从含有所述肽以及较高分子量的物质的液体中回收肽的方法，所述较高分子量的物质例如是蛋白质、脂质、碳水化合物和/或核酸，所述方法包括将所述液体与一种醇混合以形成一醇相和一沉淀物，所述醇相包括醇和其中至少一些肽，所述沉淀物包括至少一部分较高分子量的物质；将所述醇相从所述沉淀物分离；和回收所述醇相。
除非另有说明，本文中的百分比组成是指物质的重量百分比。


本申请引用以下附图，其中
图1是概述用于Colostrinin的提取/纯化方案的图；和
图2表示的是在以下所描述的SDS-PAGE分析的结果。
实施例
将根据以下实施例对本发明进行进一步的描述。
纯化方案
对每一比较样本来说，使用10ml的混合初乳。所述初乳收集自绵羊产后的不同阶段，并被冷冻直至进行试验时。如以下所说明的那样，用于以下实施例中的该方案是相同的，除了通过pH或EDTA对未加工过的材料进行了最初的处理外。
实施例110ml未加工过的混合初乳(pH～6.5)。
实施例2用25mM EDTA处理过的10ml未加工过的混合初乳(pH～6.5)，并继以添加50mM CaCl2(重新钙化)。
实施例3被调节为pH7.4的10ml混合初乳。
实施例4用25mM EDTA处理调节至pH7.4混合初乳，并继以添加50mM CaCl2(重新钙化)。
相同来源的未加工过的混合初乳(10ml的等分试样)被用作初始材料，在添加甲醇前，在特定的pH值或EDTA/CaCL2处理条件下处理1小时。添加100％甲醇直至在每一初乳样品中的终浓度为60％。该混合物在室温下被搅拌30分钟，然后在15,000g被离心。除去上清，在干燥器中使得所述醇从上清中挥发，直至上清的体积减少至约8.0ml(这花费约30-60分钟)。等量的饱和硫酸铵(100％)被添加到上清中以达到终浓度为50％硫酸铵。然后，该上清/硫酸铵混合物于4℃被轻轻摇动过夜，使得Colostrinin肽被沉淀下来。该制剂在15,000g被离心以形成包含Colostrinin肽的小球。所述小球被溶解在蒸馏水中并以0.01M PBS(磷酸盐缓冲液)进行透析过夜。通过这一方法制备的Colostrinin肽可以在各种试验中被分析并被储存于-20℃。
蛋白质回收试验
在冷冻前，可以通过读取溶液在280nm处的光密度得到蛋白质浓度。蛋白质回收结果被示于下表1。
表1
结果表明从最初的10ml的初乳等分试样回收蛋白质高度依赖于pH值。这些产量高于使用Janusz方法的产量，且是通过更简单、更快速的方法获得的。
抗原识别试验
通过基于所制备的抗九种合成肽的抗体的ELISA方法对终物质的抗原性图谱进行测定，所述合成肽的序列已经被预先鉴定并列于表2。
表2
抗原分类A、B、C和D在WO 00/75173中有所解释。LF是乳铁传递蛋白的一个片段，其具有抗菌特性，IgG-2抗体片段用做Colostrinin纯度的指标。
简单地说，96孔ELISA平板被根据方案1-4所回收的Colostrinin样品(约每毫升0.1M重碳酸盐缓冲液(pH9.0)中10微克蛋白质)包被。该平板在37℃条件下被温育3小时，用偶联缓冲液洗涤，并用牛血清白蛋白(BSA)制成的标准溶液进行阻断。50微升的稀释的BSA(0.75％的溶液)被吸取到每一孔；根据最初的滴度被稀释的50微升的血清样品(蛋白A纯化的抗特异性抗原的兔抗抗体)被添加到每列的柱A。移下平板，进行1∶2的连续稀释液。所述平板在室温下被加盖温育60分钟；然后用PBS溶液洗涤4遍。50微升体积的山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶缀合的抗体(在BSA中以1∶1000稀释)被吸取到每个孔并在室温下温育60分钟。然后将所述平板用PBS洗涤溶液洗涤4遍，并将50微升的底物2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸-磷酸氢二铵盐)被添加到每个孔中并在室温下温育2分钟。通过加入50微升1％SDS到每一孔中终止比色反应，将平板在Dynatech平板读数计(405nm处)。
这些试验的结果(平均滴度)被示于下表3中。该值以单位/ml×103计。“单位”被定义为适于识别抗原的最后的稀释度。很清楚每种肽在提取物中的回收量在pH7.4时是最高的(试验3和4)，对于这些肽测定了终物质(A-1；A-3；B-8；B-9；C-2；C-11；D-1；Lf和IgG-2)。在两个试验中，所述抗原在所测试的最高稀释度全部被识别。
表3
氨基酸分析
根据本发明所纯化的Colostrinin的氨基酸组成确认含有高含量的脯氨酸(～20％)和酸性氨基酸。表4显示了以前所描述的Colostrinin与本发明的Colostrinin间的氨基酸组成的高度相似性。
表4 CLN的氨基酸分析
*根据M.Janusz et al.ref.(FEBS LETTERS 1974，49，276-279)所公开的Colostrinin。
**根据使用Janusz et al.方案的进一步的工作所获得的Colostrinin的平均结果。
***根据本发明的方法的Colostrinin。
生物学试验
对根据本发明的新方案所制备的CLN的潜力进行了测定并将之与传统方法进行了比较，结果证明两者在以下活性方面是相似的1)4HNE-蛋白质加合物的减少；2)ROS的细胞内水平的降低；3)4HNE-介导的谷胱甘肽损耗的抑制；和4)4HNE-诱导的c-Jun NH2-末端激酶的激活抑制。
SDS PAGE分析
在还原条件下，用1D 15％聚丙烯酰氨进行凝胶电泳。用1％考马斯蓝进行的染色表明根据本发明与传统发方法所获得的最终的CLN制剂两者之间有着惊人的相似性。
图2表示SDS PAGE分析的结果。将样本再水合并测定其蛋白质含量，将相等量的蛋白质在1D 15％的凝胶上进行SDS PAGE，随后用考马斯蓝染色。在该图中，STD代表分子量标记1代表根据Januszet al.的Colostrinin；2代表根据本发明的Colostrinin；和3代表被EDTA/CaCl2修饰过的根据本发明的Colostrinin。根据SDS PAGE分析，根据本发明所获得的Colostrinin与参比物质几乎完全相同(Janusz方法)。用EDTA/CaCl2进行修饰也提供了相似的物质，尽管较高分子量蛋白质组分有所增加。
将会意识到本发明可以被修饰。例如，提取剂而不是醇可以被用于提取。使用酮已经通过使用酮获得了一些成功，例如丙酮。同样，硫酸铵沉淀步骤可以被前面所描述过高氯酸分馏所替代。同时，用于本发明的方法的起始物被描述为是为加工过的初乳或脱脂初乳，将意识到其它形式的初乳或部分纯化的初乳也可被用做起始物。例如，本发明的方法可以利用或进一步纯化Colostrinin肽，该肽以前已经通过本领域已知的方法如Janusz方法被纯化。
序列表
<110>雷根医疗公开有限公司
<120>初乳中的肽的纯化
<130>PAC/20362WO
<150>GB0305552.2
<151>2003-03-11
<160>64
<170>PatentIn version 3.1
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Val Glu Ser Tyr Val Pro Leu Phe Pro
1 权利要求
1.一种用于从哺乳动物的初乳或初乳衍生物中回收肽的方法，该方法包括将所述初乳与一种醇混合以形成一醇相和一沉淀物，所述醇相包括醇和至少一部分待回收的肽；将所述醇相从所述沉淀物分离；和回收所述醇相。
2.权利要求1的方法，其中所述醇是甲醇或乙醇。
3.权利要求1或2的方法，进一步包括从所述被回收的醇相除去至少一部分醇以得到一浓缩的肽相并回收所述浓缩的肽相的步骤。
4.权利要求1、2或3的方法，进一步包括将一沉淀剂溶解在所述被回收的醇相或浓缩的肽相中，所述沉淀剂能促使至少一部分肽的沉淀。
5.权利要求3或4的方法，其中所述沉淀剂是硫酸铵。
6.前述权利要求中任一项的方法，进一步包括在添加醇之前向所述初乳中添加EDTA。
7.权利要求1-5中任一项的方法，其中的混合物含有结合了肽的蛋白质微团，所述方法进一步包括在添加醇之前向液体中添加微团破坏剂的步骤，所述微团破坏剂能破碎液体中的微团。
8.权利要求7的方法，其中所述微团破坏剂是EDTA或EGTA。
9.前述权利要求中任一项的方法，进一步包括在添加醇之前向混合物中添加CaCl2。
10.权利要求7或8的方法，进一步包括在添加醇之前向液体中添加微团恢复剂以再次形成蛋白质微团。
11.权利要求10的方法，其中所述微团恢复剂是CaCl2。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述液体在添加醇之前被预先处理至处于pH6.5-7.5的范围。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中被添加到液体中的所述醇的量足以使基于液体总体积的醇浓度为40-80％(v/v)。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中被添加到液体中的所述醇的量足以使基于液体总体积的醇浓度为50-70％(v/v)。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中被添加到液体中的所述醇的量足以使基于液体总体积的醇浓度为55-65％(v/v)。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中被添加到初乳中的所述醇基本上是100％纯的。
17.前述权利要求中任一项的方法，其中回收自初乳的肽包含Colostrinin。
18.前述权利要求中任一项的方法，其中的液体是已经过一或多个步骤的处理的哺乳动物的初乳衍生物。
全文摘要
本发明涉及初乳中的肽的纯化方法。该方法包括添加醇例如甲醇或乙醇至该混合物中以形成一富含肽的醇相和一沉淀物。随后回收富含肽的醇相并进行进一步的分馏。本发明在纯化初乳中的Colostrinin方面尤其适用。
文档编号C07K14/47GK1788016SQ200480012790
公开日2006年6月14日 申请日期2004年3月10日 优先权日2003年3月11日
发明者耶日·亚历山大·乔治亚季斯, 安东尼·波兰诺斯基, 塔德乌什·威尔什, 玛丽安·L.·克鲁策尔 申请人:雷根医疗公开有限公司