抗万古霉素肠球菌的引物对及检测试剂盒和检测方法与流程

本发明属于常见病原菌快速检测领域，涉及一种抗万古霉素肠球菌的引物对及检测试剂盒和检测方法。

背景技术：

万古霉素属于糖肽类大分子抗生素，药力较强，在其他抗生素对病菌无效时会被使用。主要用于葡萄球菌(包括抗青霉素和抗新青霉素株)和肠球菌引起的肠道感染，如心内膜炎、败血症、伪膜性肠炎等。万古霉素曾被认为是抗感染的“最后底线”，但随着万古霉素的广泛使用，各种抗万古霉素的超级细菌已经被陆续分离出来，其中最常见的就是抗万古霉素肠球菌。这也为临床诊断和治疗提出了新的要求，即需要一种快速有效的方法来检测病原菌是否对万古霉素抗受，否则极有可能造成误诊，耽误病情。

抗万古霉素肠球菌是一种移生在肠道的革兰氏阳性球菌，肠球菌典型的排列为成对或短链状，在显微镜下很难与肺炎双球菌区别。肠球菌引起的泌尿道感染相当常见，特别是在接受抗生素治疗或是尿道手术的病患。同时，10％到20％的细菌性心内膜炎，是由肠球菌引起的。

现有的肠球菌的检测方法有菌培养法、显微镜检法、血清学实验检测、普通PCR扩增技术等。其中，菌培养法分离周期长，过程繁琐，不利于早期的快速诊断；显微镜检法虽然快速方便，但容易漏检，阳性率不高，且部分菌种间不易区分；血清学实验检测，对于轻度和局部感染的检测不够灵敏；普通PCR扩增技术虽然特异性高，但不够灵敏，且需要专门的PCR仪。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种抗万古霉素肠球菌的引物对及检测试剂盒和检测方法，该试剂盒特异性好，灵敏度高，能够快速、准确的检测抗万古霉素肠球菌；该检测方法简单、易操作。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种特异性抗万古霉素肠球菌的引物对，该引物对是根据抗万古霉素基因vanA保守序列设计的LAMP引物对，包括两个内引物，两个外引物，以及两条用于提高扩增效率的环引物；其中：

正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

一种检测抗万古霉素肠球菌的试剂盒，包括上述根据抗万古霉素基因vanA保守序列设计的LAMP引物对，以及根据肠球菌ESP基因16S rDNA的保守序列设计LAMP引物对；其中：

正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

试剂盒内包括：

1)LAMP反应缓冲液：共23μl，由以下组分组成：1×Thermopol反应缓冲液，4-10U Bst 2.0DNA Polymerase，dNTP 0.8-1.6mM，Mg²⁺2-14mM，甜菜碱0.6-1.2M，正反向内引物FIP和BIP 0.8-1.6μM，正反向外引物F3和B30.15-0.3μM，正反向环引物LF和LB 0.2-0.6μM，1μl指示剂；

2)阳性对照：2μl阳性模板，阳性模板为含有vanA和16S rDNA基因的质粒；

3)阴性对照：2μl ddH₂O；

4)待测样品检测管：盛装2μl待检测样品。

1×Thermopol反应缓冲液中各组分浓度分别为：20mM Tris-HCl、10mMKCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄及0.1％Triton X-100；Tris-HCl的pH为8.8。

本发明还公开了利用上述的检测抗万古霉素肠球菌的试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：

1)待检样品的富集或DNA的提取

经过12000rpm室温离心1-10min富集1ml血清样本中的肠球菌，弃上清，将沉淀用50-100μl 0.1M PBS缓冲液重悬，经过沸水煮10min然后立即放入冰上；或者，利用商业化试剂盒或传统方法提取待检样品核酸；

2)进行肠球菌的环介导等温扩增反应

首先，将待检测样品置于95-100℃金属浴中5-10min，然后立即置于冰上；然后，在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，并于60-65℃水浴锅中恒温扩增45-90min；最后，放入另一个85℃水浴锅中，5-10min钟后取出进行检测；

3)显色检测

将步骤2)得到的反应产物置于500nm蓝光LED透射仪上进行检测，反应后溶液呈绿色的为阳性，若呈黄色则为阴性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明根据抗万古霉素的基因vanA、肠球菌ESP基因16S rDNA的保守序列设计LAMP引物，能够快速确定肠球菌是否对万古霉素耐受,所涉及的环介导等温扩增技术使用6个区域4条引物，增强了反应的特异性，同时其检测灵敏度是普通PCR扩增技术的100倍以上。同时，本发明所使用的指示剂直接加在反应缓冲体系中，能够在反应前判断反应缓冲液是否失效，反应后无需开盖，避免了气溶胶引起的核酸污染，而且该反应可以在恒温条件下进行，操作简便，不需要昂贵的仪器设备，成本较低。在病原微生物检测方面显示出了极为广阔的前景，而尚未报道使用LAMP方法检测抗万古霉素金黄色葡萄球菌。

附图说明

图1为vanA基因的引物检测抗万古霉素肠球菌的结果；

图2为16S rDNA基因的引物检测肠球菌的结果；

图3为验证vanA基因灵敏度；

图4为验证16S rDNA基因灵敏度。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明公开的抗万古霉素肠球菌检测试剂盒，包括：

a)LAMP反应缓冲液，LAMP反应缓冲液共23μl，由以下组分组成：1×Thermopol反应缓冲液，8U Bst 2.0DNA Polymerase，dNTP 1.5mM，Mg²⁺8mM，甜菜碱0.8M，正反向内引物(FIP和BIP)1.2μM，正反向外引物(F3和B3)0.25μM，正反向环引物(LF和LB)0.5μM，1μl指示剂；

b)阳性对照管：在LAMP反应缓冲液的基础上增加2μl阳性模板，阳性模板为含有vanA/16S rDNA基因的质粒；

c)阴性对照管：在LAMP反应缓冲液的基础上增加2μl ddH₂O；

d)检测管：在LAMP反应缓冲液中加入2μl待检测样品；

使用上述试剂盒检测肠球菌，其具体方法依次包括下列步骤：

1)待检样品的富集或DNA的提取：

经过12000rpm室温离心2min富集1ml血清样本中的肠球菌，弃上清，将沉淀用50μl 0.1M PBS缓冲液重悬，经过沸水煮10min然后立即放入冰上。

或利用商业化试剂盒或传统方法提取待检样品核酸。

2)进行肠球菌的环介导等温扩增反应：

a：将待检测样品置于95℃金属浴中5min，然后立即置于冰上；

b：在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，并于63℃水浴锅中恒温扩增60min；

c：放入另一个85℃水浴锅中，8min钟后取出进行检测；

3)显色检测：

将反应产物置于500nm蓝光LED透射仪上进行检测，反应后溶液呈绿色的为阳性，若呈黄色则为阴性。

实施例1：本发明试剂盒的特异性检

采用发明中的LAMP引物和试剂盒中的LAMP反应缓冲液进行特异性检测，具体方法如下：

以抗万古霉素肠球菌ATCC51858作为标准菌株，2株肠球菌(ATCC700425，ATCC49532)作为参考菌株，并选择其他4株非肠球菌进行特异性实验。所有菌株活化于LB液体培养基中，37℃过夜培养。取1ml菌体，经过12,000rpm离心2min，用50μl PBS重悬，然后置于100℃金属浴中10min，立即置于冰上，作为模板。

取2μl制备好的模板，分别加入到检测vanA基因和16S rDNA基因的试剂盒中，65℃反应60min。然后85℃反应10min，终止反应。

反应结果参见图1和图2，图1中，1:抗万古霉素肠球菌标准菌株ATCC51858；2：肠球菌ATCC700425；3：肠球菌ATCC49532；4：大肠杆菌；5：金黄色葡萄球菌；6：艰难梭状芽胞杆菌；7：肺炎链球菌；8：ddH₂O。图2中，1:抗万古霉素肠球菌标准菌株ATCC51858；2：肠球菌ATCC700425；3：肠球菌ATCC49532；4：大肠杆菌；5：金黄色葡萄球菌；6：艰难梭状芽胞杆菌；7：肺炎链球菌；8：ddH₂O。

结果显示：本发明的vanA引物和LAMP反应体系只对抗万古霉素肠球菌的DNA有扩增，对其他肠球菌和非肠球菌菌株均无扩增；而16S rDNA基因的引物则对抗万古霉素肠球菌和普通肠球菌的DNA模板均有扩增，对非肠球菌则无扩增。说明本发明的试剂盒在检测过程中不会出现假阳性。

若vanA基因和16S rDNA基因同时呈阳性，则说明检测菌株为抗万古霉素肠球菌；若vanA基因阴性，16S rDNA基因阳性，则说明检测菌株为万古霉素敏感肠球菌；若vanA基因阳性，16S rDNA阴性，则说明检测反应体系失效。

实施例2：本发明试剂盒灵敏度检测

通过PCR扩增vanA基因和16S rDNA基因保守序列，经过DNA凝胶回收后，酶切连接到pUC57载体上，然后转入DH5α感受态细胞中，经过氨苄抗性平板筛选培养后，挑取阳性克隆测序验证。测序正确的克隆经过LB液体培养基的培养后，提取质粒，并测定浓度。

将质粒浓度梯度稀释为10ng/μl，1ng/μl，100fg/μl，10fg/μl，1fg/μl，0.1fg/μl，0.01fg/μl，阴性对照组为ddH₂O。

具体操作同实施例1，结果参见图3和图4，图3中，1：10ng/μl；2：1ng/μl；3：100fg/μl；4：10fg/μl；5：1fg/μl；6：0.1fg/μl；7：0.01fg/μl；8:ddH₂O。图4中，1：10ng/μl；2：1ng/μl；3：100fg/μl；4：10fg/μl；5：1fg/μl；6：0.1fg/μl；7：0.01fg/μl；8:ddH₂O。

结果显示，本发明的引物和LAMP反应体系，可以检测到1fp/μl，在试剂操作中能够满足临床需求，且不会造成假阳性。

实施例3：临床样本检测

取30例病人血清样本，进行检测，具体操作同实施例1，结果如表1：

表1

结果显示，本发明的试剂盒能够快速准确的检测抗万古霉素肠球菌，检测结果与RT-PCR扩增的结果一致，不存在假阳性和漏检。