专利名称：乙型肝炎病毒(HBV)的疏水性修饰的preS衍生肽及它们作为HBV和HDV进入抑制剂的使用的制作方法
技术领域：
本发明涉及乙型肝炎病毒(HBV)的疏水性修饰的preS衍生肽，该preS衍生肽来 源于HBV preS共有序列并且其N末端优选被酰基化以及其C末端可选地被修饰。这些HBV 的疏水性修饰的PreS衍生肽是非常有效的HBV进入抑制剂以及HDV进入抑制剂，因此适用 于HBV和/或HDV感染的抑制、原发HBV和/或HDV感染的预防以及(慢性)乙型肝炎和/ 或丁型肝炎的治疗。本发明进一步涉及包含这些HBV的疏水性修饰的preS衍生肽的药物 和疫苗组合物。
背景技术：
现今，大约20亿人携带HBV血清标记。他们中的大约4亿是被HBV慢性感染的。 根据疾病控制中心(CDC)，如果他们没有接受适当的治疗(1)，15-25%的慢性HBV感染的人 在十年内有发展成肝细胞癌(HCC)的倾向。HBV相关的肝细胞癌(HCC)预测性很差并且因 此HBV被世界卫生与健康组织(WHO)归类为最重要的天然存在的人致癌因子。尽管有预防 疫苗，在未来的十年中感染的人数仍将上升，这是由于世界人口的增加和在贫穷国家中预 防的限制。在工业国家，HBV基本上是通过肠胃外的途径传播。90-95%的被急性感染的、有 免疫能力的个体清除病毒，因此获得了终生的免疫防护。他们当中大约5-10%的人发展成 乙型慢性肝炎(在德国300，000-500，000人)。相反，在高流行区域，特别是在中非和东亚， 传播的主要模式是垂直地从母亲至儿童。令人遗憾的是，没有完全免疫能力的儿童的感染 导致了 90-98%的慢性疾病过程。因此乙型肝炎相关的肝细胞癌在这些国家中的许多中是 最普通的恶性肿瘤。当前被认可的治疗乙型慢性肝炎病毒(HBV)感染的治疗方案，或者是针对已经建 立感染后的病毒基因组的复制步骤(Lamivudine，Adefovir, Entecavir)或者是作为免疫 系统的调节剂(干扰素α)。令人遗憾的是，只有10-25%的病人在这种治疗上保留着持久 的病毒反应，尤其反映了核苷酸抗性突变体的快速选择。尽管预防性疫苗的有效性，但发展 新的以迄今为止不受影响的复制步骤如病毒进入为靶点的治疗方法仍是极为重要的。病毒进入的特异性抑制是吸引人的治疗概念，以便控制和最终消除急性和慢性感 染。对于HIV，通过由36个氨基酸组成的gp41蛋白衍生肽(Fuzeon )，防止了病毒和细胞 膜的融合(2)，成功地实现对病毒进入的干扰。尽管预防疫苗和逆转录酶(RT)抑制剂的有效性，全世界HBV感染的人数和HBV相 关的死亡人数(当前每年大约500，000人)还在增加。大约三分之二的原发性肝癌可归因 于持续的HBV感染(3)。目前治疗遵循两个策略⑴干扰素(IFN α )治疗调节针对HBV的免疫反应并显 示了直接抗病毒效果，这在大约30%的被治疗的病人中导致长时间的临床益处，但没有根 除病毒；(ii)病毒逆转录酶抑制剂的给药抑制病毒复制并且在一年的治疗后伴随着显著的生物化学和组织的改进。然而，长时间的治疗与抗性病毒株的出现是相关的(4)。HBV是哺乳动物和鸟类的小包膜DNA病毒家族的原型(5)。HBV的包膜包括三种 称为L(大的)、M(中等的)、以及S(小的)蛋白(参见
图1A)。它们共有具有四个跨膜区 的C-末端S结构域。M和L蛋白带有另外的N末端延伸的55个氨基酸(preS2)和取决于 基因型的107或118个氨基酸(preSl)(参见图1B)。在病毒粒子中，L、M和S的化学计量 比是大约1 1 4，同时非常充足分泌的非传染性的亚病毒微粒(SVPs)几乎唯一地包含 S蛋白以及仅仅微量的L蛋白(6)。在合成期间，L的preSl结构域被豆蔻酰基化并且被移 位通过内质网(ER)。该修饰对于HBV的感染性是必需的(7，8)。HBV感染早期情况的研究被限制，因为直到最近既没有细胞培养系统也没有小动 物模型(9)。HBV易感染的H印aRG细胞系的发展促进了 HBV进入的系统研究并且导致了包 膜蛋白衍生的进入抑制剂的发现(10)。此外，至今为止还没有针对HDV感染的有效治疗，HDV是一种利用HBV包膜蛋白进 入肝细胞中的卫星拟病毒(satellite virusoid) (15，17，20)。在本领域中需要提供针对 HDV感染的有效治疗。因此，本发明的目的是提高方法和手段用于抑制、预防和/或治疗HBV感染和现有 技术存在的其他HBV相关的疾病，并且因此本发明的目的是提供改进的方法和手段，允许 有靶点的和有效的抑制、预防和/或治疗HBV感染和HBV相关的疾病。本发明的进一步的目标是提供方法和手段用于抑制、预防和/或治疗HDV感染和 HDV相关的疾病。
发明内容
根据本发明，通过提供HBV的疏水性修饰的preS衍生肽来实现这个目标。上述疏水性修饰的preS衍生肽的通式如下Hm-P-Rn,P是所述的preS衍生肽并且包含HBV preS共有序列的氨基酸序列或者其变体。H是所述preS衍生肽P的疏水性修饰，其是P的N末端并且选自酰基化和疏水性 部分的添加；其中m至少是1。R是上述preS衍生肽P的可选的C末端修饰(S卩η是0或至少是1)。根据本发明，此外通过提供药物组合物来实现这个目标，该药物组合物包含至少 一种此处说明的HBV的疏水性修饰preS衍生肽和可选择的药学上可接受的载体和/或赋 形剂。根据本发明，此外通过提供本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽和/或各自 的药物组合物用于疾病的诊断、预防和/或治疗来实现这个目标。根据本发明，此外通过提供本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或药物组合 物用于抑制HBV和/或HDV感染、用于预防HBV和/或HDV原发感染和/或用于治疗乙型 肝炎和/或丁型肝炎来实现这个目标。根据本发明，此外通过使用本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或药物组合 物用于可抑制HBV和/或HDV感染的药物的研制、用于预防HBV和/或HDV原发感染和/ 或用于治疗(慢性)乙型肝炎和/或(慢性)丁型肝炎来实现这个目标。
根据本发明，此外通过抑制HBV和/或HDV感染的方法、预防HBV和/或HDV原发 感染和/或治疗(慢性)乙型肝炎和/或(慢性)丁型肝炎的方法来实现这个目标，上述 方法通过利用本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或药物组合物来实现上述功能。根据本发明，此外通过提供疫苗组合物来实现这个目标，该疫苗组合物包含至少 一种此处说明的HBV的疏水性修饰preS衍生肽和可选择的药学上可接受的载体和/或赋 形剂。
具体实施例方式在下面对本发明进行更详细的描述之前，应理解本发明并不限于此处描述的特定 的方法、流程和试剂，因为这些可能会改变。也应理解此处使用的术语只是为了描述特定的 实施方式，并不是想限制本发明的范围，本发明只是被附后的权利要求限制。除非另外定 义，此处使用的所有技术和科学术语具有的含义应当与本领域中的技术人员通常理解的一 样。为了本发明，此处引用的所有参考文献全部并入此处以供参考。HBV的疏水性修饰的preS衍生肽如上所述，本发明提供了乙型肝炎病毒(HBV)的疏水性修饰的preS衍生肽。HBV的包膜包括三种称为L(大的)、M(中等的)、S(小的)的蛋白(参见图1A)。 它们共有具有四个跨膜区的C-末端S结构域。M和L蛋白带有另外的N末端延伸的55个 氨基酸和取决于基因型的107或118个氨基酸(preS2和preSl)(参见图1B)。因此，根据本发明的术语HBV的“preS衍生”肽指的是具有与HBV的L蛋白N末端 延伸段(preSl)相对应的氨基酸序列的肽，优选地，该“preS衍生”肽具有与种类和基因型 A至H以及卷毛猴(WMHBV)、黑猩猩以及大猩猩乙型肝炎病毒的共有序列相对应的氨基酸序 列，但是该“preS衍生”肽还包括其变体，优选N末端和/或C末端截断型变体、氨基酸置换 变体。SEQ ID NO. 1显示种类和基因型A至H以及卷毛猴(WMHBV)的HBV preS共有氨基 酸序列。参见图2中排列，显示HBV preS共有序列(Consensus)和八种HBV基因型(A-H) 以及卷毛猴HBV(WMHBV)PreS序列含有2_48位点氨基酸。注意基因型A、B、C、E、F、G和H 在它们的N-末端具有高达11个另外的氨基酸。本申请中的HBV “基因型C”的氨基酸序列指的是人工序列，它与HBV基因型C相 对应或与其相等，正如基因库ABV02850. 1中所示，只是本发明基因型C中的位点46 (根据 下面描述的编号)是赖氨酸(K)，代替了基因库序列中的谷氨酰胺(Q)；本申请中HBV基因 型C序列可以被称为“HBV基因型C Q46K”。参见SEQ ID NOs. 4、12、21_27。图2也显示了 HBV preS共有序列的氨基酸残基的编号，将在整个说明书中被参眧.
/、、、 ·氨基酸残基位点1是基因型D (以前被描述为亚型ayw，参见SEQ ID NO. 5)的蛋氨 酸(Metl)，而氨基酸残基位点(-11)是基因型C (SEQ ID NO. 4)的蛋氨酸(Met (-11))。在 体内，Metl或者Met (-11)分别被细胞的蛋氨酰氨肽酶切断并且被随后转移的来自于豆蔻 酰-CoA的豆蔻酰残基修饰，该豆蔻酰残基通过N-豆蔻酰转移酶分别转移至氨基酸残基位 点2甘氨酸(Gly2)或者氨基酸残基位点(-10)甘氨酸(Gly (-10))。基因型D的N-末端氨基酸残基是天然氨基酸甘氨酸(Gly2)并且根据由L的基础开放阅读框(Underlying Open Reading Frame)的密码子开始的相应编号被编号为2 (或者基因型C的Gly(-lO))。HBV preS共有序列也包括基因型A、B、C、E、F、G和H的另外的N-末端氨基酸(被 指定在“_”位置)。因此，全部HBV preS共有序列包含位点(-11)至48。因此，上述的编号与SEQ ID NO. 1中氨基酸的实际编号之间存在差异，比如Met (-11)，残基编号(-11)，在SEQ ID NO. 1中被列为氨基酸残基1 ；Gly (-10)，残基编号(-10)，在SEQ ID NO. 1中被列为氨基酸残基2 ；Metl，残基编号1，在SEQ ID NO. 1中被列为氨基酸残基12 ；Gly2，残基编号2，在SEQ ID NO. 1中被列为氨基酸残基13 ；Gly48，残基编号48，在SEQ ID NO. 1中被列为氨基酸残基58。SEQ ID NO =IHBV preS 共有序列(位点(-11)至 48)(-11)-M GGffSS TPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFRA NSNNP DffDFN PNKDH WPEAN KVG-48SEQ ID N0:2HBV 基因型 A(-11)-M GGffSS KPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DffDFN PVKDD WPAAN QVG-48SEQ ID N0:3HBV 基因型 B(-11)-M GGffSS KPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFKA NSENP DffDLN PHKDN WPDAN KVG-48SEQ ID NO :4人工氨基酸序列，与HBV基因型C相对应，除了 46位点上是赖氨酸 (K)而不是谷氨酰胺(Q)以外；Q46K(-11)-M GGffSS KPRQG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DffDFN PNKDH WPEAN KVG-48SEQ ID N0:5HBV 基因型 DI-MGQNL STSNP LGFFP DHQLD PAFRA NTANP DffDFN PNKDT WPDAN KVG-48SEQ ID NO 6 HBV 基因型 E(-10)-MGLSff TVPLE WGKNI STTNP LGFFP DHQLD PAFRA NTRNP DWDHN PNKDH WTEAN KVG-48SEQ ID N0:7HBV 基因型 F(-11)-M GAPLS TTRRG MGQNL SVPNP LGFFP DHQLD PLFRA NSSSP DffDFN TNKDS WPMAN KVG-48SEQ ID NO :8HBV 基因型 G(-10)-MGLSff TVPLE WGKNL SASNP LGFLP DHQLD PAFRA NTNNP DWDFN PKKDP WPEAN KVG-48SEQ ID NO :9HBV 基因型 H(-11)-M GAPLS TARRG MGQNL SVPNP LGFFP DHQLD PLFRA NSSSP DffDFN TNKDN WPMAN KVG-48SEQ ID NO :10WMHBVI-MGLNQ STFNP LGFFP SHQLD PLFKA NAGSA DffDKN PNKDP WPQAH DTA-48
8
对于SEQ ID NOs. 2-10参见基因库登录号HBV 基因型 A 基因库 AAT28684. 1HBV 基因型 B 基因库 AAU01950. 1HBV基因型C基因库ABV02850. 1(其中位点46是赖氨酸(K)(如同在SEQ IDN0. 4 中)而不是谷氨酰胺(Q)(在ABV02850. 1中)。HBV 基因型 D 基因库 AAR19337. 1HBV 基因型 E 基因库 ABS31101. 1HBV 基因型 F 基因库 ABK19774. 1HBV 基因型 G 基因库 AAF34735. 1/AF160501_3HBV 基因型 H 基因库 AAM09052. 1WMHBV基因库 AAC16905. 1根据本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽的通式如下Hm-P-Rn,其中P是所述preS衍生肽；H是P的所述疏水性修饰；R是P的C末端修饰；m至少是1 ；η是0或者至少是1。根据本发明的HBV的preS衍生肽，P，包含-如SEQID NO. 1所示的HBV preS共有序列的氨基酸序列，SEQ ID NO.或者-其变体。“变体”优选是N-末端和/或C-末端截断型变体、氨基酸置换或缺失变体、或延长 变体。此外，变体还包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含被修饰的氨基酸、非天然的氨基酸 或者拟肽类或另外的可以模拟肽主链/结构的化合物。优选的，变体选自SEQ ID NO. 1的N-末端和/或C-末端截断型变体；氨基酸置换 或缺失变体；包含被修饰的氨基酸、非天然的氨基酸或者拟肽类或另外的可以模拟肽主链 /结构的化合物的变体。根据本发明，疏水性修饰的preS衍生肽的变体包含SEQ ID NO. 1的至少10或20 个连续的氨基酸，并且可以由 SEQ ID NO. 1 的 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48 个
或更多的氨基酸或它的变体组成。N-末端和/或C-末端截断型变体优选包含SEQ ID NO. 1的至少48个连续的氨基 酸(优选残基2至48)，更优选的是SEQ ID NO. 1的至少17个连续的氨基酸(优选残基5 至21)或SEQ ID NO. 1的至少20个连续的氨基酸(优选残基2至21)。术语“变体”也指的是在不同病毒种类、菌株或者嗜肝DNA病毒种类的亚型中发现 的同源序列，如HBV菌株α UHBV菌株LSH(黑猩猩分离菌)、卷毛候HBV(WMHBV)或者选自 下组的菌株HBV基因型A至H，以及此处描述的HBV基因型C，Q46K (如SEQ ID N0. 4)。术语“变体”也指的是与SEQ ID NO. 1至少有50%序列同一性的同源序列，或者此
9处公开的任何其他氨基酸序列，优选具有70 %，更优选80 %，更进一步优选90 %或者95 % 的序列同一性。因此，根据本发明的优选的疏水性修饰的preS衍生肽中，P包含SEQ ID NO. 1的 变体，其具有不同病毒种类、菌株或者亚型的氨基酸序列或者其变体，优选具有HBV基因型 或卷毛猴HBV (WMHBV)的氨基酸序列。优选地，P包含选自SEQ ID NOs. 2至10的氨基酸序列或者其变体(参见图2)。在根据本发明的疏水性修饰的preS衍生肽的优选实施方式中，P包含SEQ ID NO. 1的变体，其具有选自下组的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1中显示的HBV preS共有序列的氨基酸残基2至21、氨基酸残基5至21、氨基酸残基5至15或氨基酸残基9至15 (参见[SEQ ID NO. 15])。更加优选地，P不包含在SEQ ID NO. 1的残基9至22上的氨基酸置换和/或缺失， 例如通过删除残基17至22。更加优选地，P不包含在SEQ ID NO. 1的残基9至15上的氨基酸置换和/或缺失。更加优选地，NPLGFFP基序[SEQ ID N0. 15](对应于SEQ ID NO. 1的残基9至15) 没有被中断或者被修饰，例如通过D-氨基酸来取代残基11-15。更加优选地，根据本发明的疏水性修饰的preS衍生肽中，P包含SEQ ID NO. 1的 变体，其具有选自下组的氨基酸序列共有序列的氨基酉堯残基2至48[SEQ ID Ν0. 11]；
基因型C的氨基酉堯残基2至48[SEQIDN0.12]
基因型C的氨基酉堯残基2至21[SEQIDNO.13]
基因型C的氨基酉堯残基5至21[SEQIDNO.14]
基因型C的氨基酉堯残基9至15[SEQIDNO.15]
基因型D的氨基酉堯残基2至48[SEQIDNO.16]
基因型D的氨基酉堯残基5至48[SEQIDNO.17]
基因型D的氨基酉堯残基2至33[SEQIDNO.18]
基因型D的氨基酉堯残基5至33[SEQIDNO.19]
基因型D的氨基酉堯残基2至21[SEQIDNO.20]
基因型D的氨基酉堯残基9至15[SEQIDNO.15]。
因此优选地，P包含选自SEQIDNOs. 11 至 20 的氨基变体。对于P的优选的氨基酸序列，参见下述，表1-7，附图和实施例。SEQ ID NO. 1的“变体”也包括具有氨基酸缺失、氨基酸置换(例如通过其他氨基 酸或通过等构物(具有与蛋白质氨基酸相似的结构和空间相似性的被修饰的氨基酸)的保 守或非保守的替换)、氨基酸添加或等构物添加的变体或者“类似物”，，只要在肽浓度低于 10 μ Μ，和优选低于1 μ M下，序列能引起70%的HBV感染的抑制。保守的氨基酸置换典型地涉及在相同种类的氨基酸中的置换。这些种类包括例 如
_具有不带电荷的极性侧链的氨基酸，如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪 氨酸；_具有碱性侧链的氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；-具有酸性侧链的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；以及-具有非极性侧链的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸和半胱氨酸。本发明的疏水性修饰的preS衍生肽优选可被修饰以便具有增加的免疫原性。例 如，这种增加的免疫原性指的是增加免疫接种后引发的抗体范围，或者允许产生能够压制 不同病毒株感染的抗体。在另一个实施方式中，本发明的疏水性修饰的preS衍生肽优选可被修饰以便降 低它们的免疫原性。这种疏水性修饰的preS衍生肽在治疗应用以便抑制体内HBV感染上 特别有用，同时避免或限制了副作用。因此，优选地通过置换和/或缺失修饰的基序是承担免疫原性的序列，如B细胞表 面抗原和/或T细胞表面抗原以及此外的抗体识别基序。HBV的B细胞表面抗原优选是SEQ ID NO. 1的氨基酸残基20至23，基序DPAF ；共 有序列(SEQ ID NO. 1)和基因型C(SEQ ID NO. 4)的氨基酸残基26至32，基序NSNNPDW ；或 者基因型 D (SEQ ID NO. 5)的 NTANPDW。在优选的实施方式中，SEQ ID NO. 1的氨基酸残基20至23被修饰，优选通过氨基 酸置换，和/或氨基酸残基26至32被修饰，优选通过氨基酸置换和/或缺失。优选地，SEQ ID NO. 1的氨基酸残基20至23 (基序DPAF)通过丙氨酸氨基酸置换 被修饰，优选地变成基序APAF。优选地，SEQ ID NO. 1的氨基酸残基26至32通过丙氨酸氨基酸置换被修饰，优选 地变成基序NANAPDff或者NAAAPDW。在优选的实施方式中，P包含选自SEQ ID NOs. 21至28的氨基酸序列SEQ ID NOs. 或者其变体。参见下述，表2、7和各个附图和实施例。在更加优选的实施方式中，P包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO. 11 (共有序列的残基2至48)，SEQ ID N0. 12 (基因型 C 的残基 2 至 48)，SEQ ID N0. 13 (基因型 C 的残基 2 至 21)，SEQ ID N0. 4 (基因型C的残基(_11)至48)，以及SEQ ID N0. 20 (基因型 D 的残基 2 至 21)。PreS衍生肽P的疏水性修饰(H)是P的N-末端。“N-末端”指的是N-末端的疏水性修饰，即各自的第一个氨基酸残基(如Gly2)， 但是也包括在接近N-末端上的疏水性修饰，如各自的氨基酸残基(_4)、(-3)、(-2)、(-1)、1、2或3或4。因此，疏水性修饰可以进一步通过在接近P的N-末端的位点 连接疏水性部分来获得。根据本发明，上述的HBV的preS衍生肽的疏水性修饰是将疏水性部分添加到肽上。
此外，m至少是1，即用至少1个疏水性部分或者基团修饰。在本发明的优选实施方式中，m是1、2、3、4或更多。亦即，P可以用一个以上疏水 性部分或者基团修饰，例如2个。疏水性部分或者基团相互之间可以是相同的或者不同的。根据本发明，上述的HBV的preS衍生肽的疏水性修饰是选自-酰基化；_疏水性部分的添加。酰基化优选选自用羧酸、脂肪酸和具有亲脂性侧链的氨基酸的酰基化。优选脂肪酸是饱和的或者不饱和的脂肪酸，支链的或者无支链的脂肪性，优选具 有8至22个碳原子(C8至C22)。更加优选的，酰基化的疏水性修饰选自用豆蔻酰(C14)、棕榈酰(C16)或者硬脂酰 (C18)的酰基化。优选疏水性部分的添加选自胆固醇、胆固醇的衍生物、磷脂、糖脂、甘油酯、类固 醇、神经酰胺、异戊二烯衍生物、金刚烷、法尼醇、脂肪基、多环芳烃化合物的添加。疏水性部分的连接优选通过共价键进行，其可以通过氨基甲酸酯、酰胺、醚、二硫 化物或者任何其他的在本领域技术人员能力之内的连接来完成。因此，本发明的疏水性修饰，优选的酰基化的preS衍生肽优选是脂肽类，因为它 们的N-末端的亲脂性或者疏水基团/部分。对于优选的疏水性修饰的preS衍生肽，参见表1和2。本发明的更加优选的疏水性修饰的preS衍生肽如下所述-P 包含自 SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 4 禾口 SEQ IDNO. 20的氨基酸序列以及-H是用豆蔻酰(C14)或者硬脂酰(C18)、优选用硬脂酰(C18)酰基化的疏水性修 饰。因此，本发明更加优选的疏水性修饰的preS衍生肽是如下肽的名称氨基酸序列 疏水性修饰_HBVpreS/'2-_48 ■旨St (共有序列)SEQ ID NO. 11硬脂酰(C18)
HBVpreS/'2-_48as (共有序列)SEQ ID NO. 11豆蔻酰(C14)
HBVpreS/'2-硬脂酸(c)SEQID NO.12硬脂酰(C18)
HBVpreS/'2-豆蔻酰(Q)SEQID NO.12豆蔻酰(C14)
HBVpreS/'2--21硬脂酸(C)SEQID NO.12硬脂酰(C18)
HBVpreS/-11)-48 硬腿(C)SEQID NO.4硬脂酰(C18)
HBVpreS/-11)-48 豆麵(C)SEQID NO.4豆蔻酰(C14)
HBVpreS/'2-硬脂酸(D)SEQID NO.20硬脂酰(C18)其中(C)指的是HBV基因型C Q46K。基因型C序列的优选实施方式在本发明的非常优选的实施方式中，根据本发明的疏水性修饰的preS肽P包含来 源于基因型C的氨基酸序列。本发明的来源于基因型C的疏水性修饰的preS衍生肽比相应的基因型D更加有效地抑制HBV感染。参见图3和表3.如上所述，本申请中的HBV “基因型C”的氨基酸序列指的是人工序列，其与基因库 ABV02850. 1中所示的HBV基因型C相对应或相同，除了在本发明的基因型C中位点46 (根 据如下所述的编码)是赖氨酸(K)而不是基因库序列中的谷氨酰胺(Q)；本申请中的HBV基 因型C序列也可以称作“HBV基因型C Q46K”。参见SEQ ID NOs. 4、12、21_27。如上所述的用于HBV preS共有序列的相同的编号被用于基因型C序列的氨基酸 残基的编号(参见图2)，比如Met (-11)，残基号码(-11)，在SEQ ID NO. 4中被列为氨基酸残基1 ；Gly (-10)，残基号码(-10)，在SEQ ID NO. 4中被列为氨基酸残基2 ；Metl，残基号码1，在SEQ ID NO. 4中被列为氨基酸残基12 ；Gly2，残基号码2，在SEQ ID NO. 4中被列为氨基酸残基13，并且在SEQ ID NO. 12 中被列为氨基酸残基1 ；Gly48，残基号码48，在SEQ ID N0. 4中被列为氨基酸残基58，并且在SEQ ID N0. 12 中被列为氨基酸残基47。SEQ ID N0 12氨基酸序列，与HBV基因型C的位点2至48相对应，除了在位点46 上是赖氨酸(K)而不是谷氨酰胺(Q) ；Q46K2-GTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DffDFN PNKDH WPEAN KVG-48P可以优选地选自下组 SEQ ID N0. 12 (基因型C的残基2至48)，
(基因型C的残基(-11)至48)， (基因型C的残基2至21)， (基因型C的残基5至21)，以及 (基因型C的残基9至15)。在基因型C序列的优选的实施方式中，乙型肝炎病毒(HBV)的疏水性修饰的preS 衍生肽的通式如下Hm-P-Rn，其中优选地P是preS衍生肽或者其衍生物，该preS衍生肽包含SEQ ID N0. 12的氨基酸序列 或者至少10个连续氨基酸的该序列的N-或/和C-末端截断型变体，其衍生物包含被修饰 的氨基酸、非天然的氨基酸或拟肽类；H是preS衍生肽P的疏水性修饰，其是P的N-末端，并且选自酰基化和疏水性部 分的添加；R是上述preS衍生肽P的C-末端修饰；m至少是1;以及η是0或者至少是1。本发明的优选的肽对于HBV和/或HDV感染的抑制、急性HBV和/或HDV感染的 预防、和/或乙型肝炎和/或丁型肝炎的治疗是特别有效的。优选地，P包含SEQ ID Ν0. 12 (基因型C的残基2至48)的氨基酸序列，或由其组 成。同样优选地，P包含SEQ ID N0. 12的氨基酸序列的变体，其中变体包含SEQ ID
SEQID N0. 4
SEQID NO. 13
SEQID NO. 14
SEQID NO. 15NO. 12的至少10个连续的氨基酸残基(优选残基9至18)，更加优选15个或20个，并且可 以由 SEQ ID NO. 12 的 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48 或更多的氨基酸残基组成。
优选地，包含于P中的SEQ ID NO. 12的连续的氨基酸残基选自基因型C的氨基酉堯残基9至15[=SEQIDN0.15]
基因型C的氨基酉堯残基2至15，
基因型C的氨基酉堯残基9至18，
基因型C的氨基酉堯残基2至18，
基因型C的氨基酉堯残基2至20，
基因型C的氨基酉堯残基2至21[=SEQIDNO.13]，
基因型C的氨基酉堯残基5至21[=SEQIDNO.14]，
基因型C的氨基酉堯残基2至25，
基因型C的氨基酉堯残基2至30，
基因型C的氨基酉堯残基2至35，
基因型C的氨基酉堯残基2至40，
基因型C的氨基酉堯残基2至45，
基因型C的氨基酉堯残基2至46，或者
基因型C的氨基酉堯残基2至48[=SEQIDNO.12]。
在一个实施方式中，P包含SEQ ID NO. 12的各个剩余的氨基酸残基，称作 基因型C的氨基酸残基16至48， 基因型C的氨基酸残基19至48， 基因型C的氨基酸残基21至48， 基因型C的氨基酸残基22至48， 基因型C的氨基酸残基26至48， 基因型C的氨基酸残基31至48， 基因型C的氨基酸残基36至48， 基因型C的氨基酸残基41至48， 基因型C的氨基酸残基46至48，或者 基因型C的氨基酸残基47至48，
它们或者与SEQ ID NO. 12的各个氨基酸残基相同，或者是它们的衍生物， 其中衍生物包含至少一种修饰，所述修饰选自下组氨基酸置换、氨基酸缺失、被 修饰的氨基酸、非天然的氨基酸或者拟肽类，
其中至少一种修饰是1、2、3、4、5或更多的修饰。 优选的氨基酸置换如此处所描述。 更优选地，P包含选自下组的氨基酸序列
-包含SEQ ID N0. 12的氨基酸残基2至15、以及与其相邻的SEQ ID N0. 12的氨 基酸残基16至48的衍生物的氨基酸序列；-包含SEQ ID N0. 12的氨基酸残基2至20和与其相邻的SEQ ID N0. 12的氨基酸残基21至48的衍生物的氨基酸序列；-包含SEQID NO. 12的氨基酸残基2至25和与其相邻的SEQ ID NO. 12的氨基酸 残基26至48的衍生物的氨基酸序列；-包含SEQID NO. 12的氨基酸残基2至30和与其相邻的SEQ ID NO. 12的氨基酸 残基31至48的衍生物的氨基酸序列；-包含SEQID NO. 12的氨基酸残基2至35和与其相邻的SEQ ID N0. 12的氨基酸 残基36至48的衍生物的氨基酸序列；-包含SEQID N0. 12的氨基酸残基2至40和与其相邻的SEQ ID N0. 12的氨基酸 残基41至48的衍生物的氨基酸序列；以及-包含SEQID N0. 12的氨基酸序列的氨基酸序列；其中衍生物包含至少一种修饰，所述修饰选自下组氨基酸置换、氨基酸缺失、被 修饰的氨基酸、非天然的氨基酸或者拟肽类，其中至少一种修饰是1、2、3、4、5或更多的修饰。在基因型C序列的优选实施方式中-P包含选自SEQ ID N0. 12的氨基酸序列SEQ ID N0.或者相应的被描述的变体/ 衍生物/修饰，-H是用豆蔻酰(C14)或者硬脂酰(C18)、优选用豆蔻酰(C14)酰基化的疏水性修 饰。豆蔻酰基化的修饰在体内和药物应用上是优选的，这是由于它的高安全性，如没 有硬脂酰基团的副作用(固有的免疫反应等等)。因此，本发明的更加优选的疏水性修饰的preS衍生肽是下述HBV preS/(-ll)-48siest (C) [SEQ ID NO. 4]HBV preS/2-48 豆蔑S (C)[SEQ ID NO. 12]HBVpreS/2-21se (C)[SEQ ID NO. 13]HBVpreS/5-21se (C)[SEQ ID NO. 14]HBVpreS/9-15se (C)[SEQ ID NO. 15]最优选HBVpreS/2-48 豆蔑S (C) [SEQ ID NO. 12],上述的preS衍生肽P的C-末端修饰(R)优选是具有能防止降解，如体内降解的 部分的修饰。“C-末端”指的是在C末端的修饰，即相应的最后的氨基酸残基，但是也包括接近 C-末端的修饰，如倒数第二个氨基酸残基、倒数第三个氨基酸残基或更多氨基酸残基(比 如一种D-氨基酸的引入，防止载体被酶降解，比如通过羧肽酶作用)。本领域的技术人员将能根据各种应用选择相应的合适的部分。优选的可以防止降解的部分，选自酰胺、D-氨基酸、被修饰的氨基酸、环状氨基酸； 天然的和合成的聚合物，如PEG、聚糖。在一个实施方式中，P与肽或者蛋白融合，肽或者蛋白优选选自白蛋白和人IgGs 的Fc结构域。融合优选是P的C-末端。
此外，η是0或者至少是1，即C-末端的修饰(R)是可选的。优选地，η是1。在本发明进一步的实施方式中，η是1、2、3、4或更多。亦即，P的C-末端或者其接 近位点可以被一个以上的部分或者基团修饰，例如2个。该部分或者基团相互之间可以是 相同的或者不同的。在本发明的一个实施方式中，H和/或R通过连接物或隔离物与P连接。连接物或间隔物对于本领域的技术人员是已知的，例如聚丙氨酸、聚甘氨酸、碳水 化合物、(CH2)n基团。因此，本领域的技术人员将能根据各种应用选择相应的合适的连接物或者间隔 物。在优选的实施方式中，根据本发明的疏水性修饰的preS衍生肽带有标记或者标 签，其优选地选自荧光染料、放射性同位素和对比剂。优选的放射性同位素是1、，125!，99!!^，1^，6^，11、，’，177!^。优选的荧光染料是Alexa染料、罗丹明和荧光素的衍生物、Cy-染料。优选的对比剂是钆(Gd)复合体、超磁性铁(supramagnetic Fe)复合体和粒子、包 含高原子序数的原子的化合物，即用于计算机层析成像术(CT)的碘、微泡和载体例如包含 这些对比剂的脂质体。本发明的肽可以通过各种易于为本领域的技术人员所知的步骤来制备，一般是通 过合成化学步骤和/或基因工程步骤制备。合成化学步骤更为特别地包括固相顺序(sequential)及分组(block)合成(11)。 固相的顺序步骤可以利用已建立的自动化方法比如通过使用自动化肽合成器来实行。在这 个步骤中，α _氨基保护的氨基酸被连接至树脂支持物上。使用的树脂支持物可以是常规地 在本领域中使用的用于(多)肽的固相制备的任何合适的树脂，优选为与聚氧化乙烯共聚 合的聚苯乙烯以便提供位点用于与初始引入的ο-氨基保护的氨基酸形成酯。本发明者运 用的此优选方法已经被清楚地描述(参见比如12)。氨基酸被一个接一个地(逐步的)引 入。与引入一个氨基酸相对应的每次合成循环包括脱保护步骤、连续的洗涤步骤、与活化的 氨基酸的连接步骤和随后的洗涤步骤。这些步骤的每一步继之以过滤。用于连接的反应试 剂是经典的用于(多)肽合成的反应试剂，如二环己基碳二亚胺、羟基苯并三唑、苯并三氮 唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鐺六氟磷酸盐(卡特缩合剂)和叠氮磷酸二苯酯。在树 脂上合成多肽之后，在苯甲醚、乙二硫醇或者2-甲基吲哚存在的条件下，通过用强酸如三 氟乙酸进行处理，将多肽从树脂上分离出来。然后通过经典的纯化技术，尤其是通过HPLC， 来纯化化合物。本发明的肽也可以通过连接被选择性地保护的(多)肽段来得到，这种连接如在 溶液中被实现。肽还可以通过本领域中的技术人员所熟知的基因工程技术来生产。真核表达系 统，例如杆状病毒系统，是特别合适的。根据这个步骤，蛋白质在感染了重组体杆状病毒的 昆虫细胞中被表达，此重组体杆状病毒包含编码异源蛋白质的核酸序列并调节核酸序列， 如启动子。一些细胞系可用于重组体杆状病毒感染，例如来自于美式培养物保藏所的细胞 系Sf-9(CRL 1711)。在真核表达系统如大肠杆菌中的表达，也是特别合适的。
肽的疏水性部分的引入可以通过各种易于为本领域的技术人员所知的步骤来完 成，包括合成的和基因工程方法。可供选择的，肽和/或融合肽(即疏水性修饰的肽)可以通过被稳定转染的真核 细胞系如CHO和其他细胞系来产生，这些细胞系是本领域中为人所熟知的并且通常被用于 产生疫苗等等。由于N-末端47-preSl氨基酸促进豆蔻酰基化蛋白质/肽的分泌的固有特 性，生物活性的疏水性修饰的肽可以从细胞培养的上清液中提取出来。本发明的疏水性修饰的preS衍生肽的特征本发明的疏水性修饰的preS衍生肽是多功能的肝炎病毒进入抑制剂并且还呈现 亲肝性/肝趋性，即它们以肝为靶点。肝趋性尤其在图11中被显示。上述亲肝性被进一步的公开在本发明者的相应的美国临时专利申请中，标题是 “乙型肝炎病毒(HBV)的疏水性修饰preS衍生肽和它们作为载体应用于将化合物特定的传 送给肝”，此专利是在同一天申请的并且被全部并入此处以供参考。本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽是非常合适的和有效的HBV进入抑制 剂，并且是HDV的进入抑制剂，或者在体外(如通过防止HBV颗粒与肝细胞的结合和/或内 化)或者在体内。正如附图和实施例所显示的，本发明的疏水性修饰的preS衍生肽有高抑制活性， 即它们以极低的剂量有效地抑制HBV和/或HDV感染。更优选的实施方式的IC5tl值的范围 是0. 01至500nM，优选0. 025至50nM，更优选0. 05至25nM。参见表1。本发明的来源于基因型C的疏水性修饰的preS衍生肽比相应的基因型D的preS 衍生肽更加有效地抑制HBV感染。此外，本发明的疏水性修饰的preS衍生肽可以被加工成不含有免疫原性的抗原 表位，但是仍然呈现强抑制活性，如在其序列中不包含免疫原性抗原表位、但仍具有约SnM 的IC5tl值的HBVpreS/2-21硬脂气本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽也可以交叉防止HBV基因型C和D，因 为来源于基因型C的肽(如HBVpreS/2-2(C)或者HBVpreS/2-48(C))可以抑制 HBV基因型D的进入。药物和疫苗组合物如上所述，本发明提供一种药物组合物，其包含至少一种此处描述的HBV的疏水 性修饰的preS衍生肽和可选择的药学上可接受的载体和/或赋形剂。根据本发明的药物组合物包含-至少一种此处描述的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽；-此处描述的结合物；以及-可选择的药学上可接受的载体和/或赋形剂。根据本发明的药物组合物非常好的适用于此处描述的所有使用和方法。如上所述，本发明提供一种疫苗组合物，其包含至少一种此处描述的HBV的疏水 性修饰preS衍生肽和可选择的药学上可接受的载体和/或赋形剂。根据本发明的疫苗组合物非常好的适用于此处描述的使用和方法。“药学上可接受的载体或者赋形剂”指的是任何媒介物(vehicle)，在其中或者利 用它们可以配制根据本发明的药物或者疫苗组合物。它包括盐溶液如磷酸盐缓冲盐水。通常，稀释剂或者载体是根据给药的模式和途径以及标准药学工作规范来选择的。医疗应用如上所述，本发明提供了本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽和/或相应的 药物组合物的首次医疗使用。因此，根据本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物是合适的并 且因此被提供用于诊断、预防和/或治疗疾病。如上所述，本发明进一步提供本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽和/或相 应的药物组合物用于某些疾病的诊断、预防和/或治疗。在优选的实施方式中，本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或药物组合物被 提供用于抑制HBV和/或HDV感染、用于预防HBV和/或HDV原发感染和/或用于治疗乙 型肝炎和/或丁型肝炎，优选用于治疗乙型慢性肝炎和/或丁型慢性肝炎。在优选的实施方式中，本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或药物组合物用 于药物研制，该药物用于抑制HBV和/或HDV感染、用于预防HBV和/或HDV原发感染和/ 或用于治疗乙型肝炎和/或丁型肝炎。优选地，本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物被提供用于 HBV和/或HDV感染的抑制。优选地，本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物被提供用于预 防HBV和/或HDV的原发感染。优选地，HBV的任何基因型的HBV感染都被抑制或被预防。本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽可以交叉预防HBV基因型C和D，因为 来源于基因型C的肽(如HBVpreS/2-21 脂s (C)或者HBVpreS/^IS (C))可以抑制HBV 基因型D的进入。在优选的实施方式中，本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物 作为HBV和/或HDV的进入抑制剂被使用/被提供。优选地，本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物被提供用于治 疗乙型肝炎和/或丁型肝炎，尤其是乙型慢性肝炎和/或丁型慢性肝炎。本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽是非常合适的和有效的HBV进入抑制 剂，并且是HDV的进入抑制剂，或者在体外(如通过防止HBV颗粒与肝细胞的结合和/或内 化)或者在体内。此外，本发明提供了一种体外抑制HBV感染肝细胞的方法，包含使用如上所述的 疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物。合适的肝细胞包括人主要的肝细胞或者称作H印aRG(22)的肝癌衍生细胞系(在 法国专利申请0109044中被描述的)、来自于Tupaia belangeri (23)的肝细胞，它们也是容 易受到HBV感染的。此外，如上所述，本发明提供通过利用本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽 或药物组合物，用于抑制HBV和/或HDV感染的方法、预防HBV和/或HDV原发感染和/或 治疗(慢性)乙型肝炎和/或(慢性)丁型肝炎的方法。给药途径优选地，本发明的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物的给药途径选自下组皮下的、静脉的、□服的、鼻的、肌肉的、经皮的、吸入的、通过栓剂的。用于鼻的给药或应用的优选实施方式是鼻喷入法。有效治疗剂量本发明的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物被提供以致于它们包含有效 治疗剂量的上述药物组合物的上述疏水性修饰的PreS衍生肽。本发明的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物的“有效治疗剂量”指的是足 以抑制HBV和/或HDV感染、预防HBV和/或HDV原发感染、治疗乙型肝炎和/或丁型肝炎 和/或疫苗接种和/或体内抑制HBV和/或HDV进入的剂量。优选的有效治疗剂量的范围是每kg体重10 μ g至lmg，优选地是10 μ g至100 μ g。对于本发明的疏水性修饰的preS衍生肽作为疫苗的使用，优选的有效治疗剂量 的范围是每kg体重10 μ g至lmg。如果使用的疏水性preS衍生肽的IC5tl值是约ΙΟηΜ，那么优选的有效治疗剂量是 每kg体重约100 μ g或每个病人1至5mg的范围。优选的每个病人1至5mg的有效治疗剂 量可以一天给药一次或者在其他实施方式中每2-3天仅给药一次。优选的有效治疗剂量取决于各自的应用和想要的抑制、治疗或者疫苗接种的结^ ο本领域的技术人员将能确定合适的有效治疗剂量。HBV受体的识别本发明还涉及一种用于体外和/或体内识别肝细胞受体的方法，此方法涉及HBV 的连接和/或穿透，和/或包括使用如上所述的疏水性修饰的PreS衍生肽定量表达上述受 体。上述肝细胞受体可以在哺乳动物或者相应的动物模型中被识别，优选小鼠或人。尤其是，上述方法包括如下步骤-将肝活组织检查或者肝细胞与本发明的疏水性修饰的preS衍生肽在如下条件 下相接触一段时间足以允许上述肽与在肝细胞表面表达的受体特异性的结合；-检测上述肽与受体的结合；以及-识别上述受体。这可以根据本领域的技术人员所熟知的经典步骤来完成。比如，可以包括本发明 的疏水性修饰的PreS衍生肽的放射性的、酶的或者荧光标记和随后利用合适的方法检测。 许多荧光物质是已知的并且可以被用作标记物。这些包括，如荧光素、罗丹明、金胺、得克萨 斯红、Cy3, Cy5, DIGE-标记物。酶标记包括将酶连接至所研究的分子上，如多肽，并且可以 通过任何比色法、分光光度法或者荧光分光光度法来检测。发明者识别出能有效的阻断HBV在体外和体内的进入的HBV-preS-表面蛋白 质-衍生脂肽。本发明关于这些抑制肽的生物分布(biodistribution)研究显示它们有 选择性的聚集在肝上，在肝上它们结合肝细胞并被推测进入肝细胞。这种亲肝性需要肽的 N-末端酰基化并且依赖于在N-末端47preSl氨基酸内的某种HBV preS基序，即在氨基酸 残基2至21 (或者优选最小序列的残基9至15)内的某种HBV preS基序。发明者观察到 此肽序列另外含有膜转位信号，这可以促进甚至完整的融合蛋白穿过质膜的输送(未公开 出版的结果)，这开启了如下可能性将任何种类的药物特定地运输至肝细胞的质膜或者甚至有选择性进入该细胞。本发明者已经显示HBV preSl衍生脂肽能以极低的剂量完全预防被移植的 uPA-RAG-Ι小鼠模型中的HBV感染。此外关于这些HBVpreS衍生的进入抑制剂的药物代谢 动力学研究表明了显著的亲肝性和非常高的血清稳定性(t1/2 ca. 60h)和在靶器官中的长 半衰期(t1/2 ca.24h)。肽的N-末端的酰基化以及某些氨基酸序列的完整性都是必须的。 因此，此肽可以被用作用于肝脏的特定药物靶点的多功能载体来克服肝细胞的感染或者治 疗肝细胞癌。(参见本发明者的相应的美国临时专利申请，标题是“乙型肝炎病毒(HBV)的疏 水性修饰的PreS衍生肽和它们作为载体应用于将化合物特定的传送给肝”，此专利是在同 一天申请的。)此外本发明人证明了这个原理WMHBV感染可以通过体内皮下注射HBV包膜蛋白 衍生肽的应用来有效的被阻断。这将开启新的预防急性HBV感染和用于乙型慢性肝炎的治 疗选择的前景。因为用于本发明的uPA/RAG-2/Pfp小鼠缺乏B细胞、T细胞和NK细胞，所以 假定了肽对易感染的肝细胞的直接抑制作用。这可以被酰基化的PreS衍生肽在肝脏上的 有效的聚集、接着可能通过胆汁途径被缓慢的清除所支持。这两个特性允许以极低剂量和 低频率进行皮下注射应用。假设5天内5次0.2mg/kg HBV/preS2-48 的注射导致预防 WMHBV感染的建立，大约30倍更高活性的肽HBV/PreS2-48 KSt以低于7 μ g/kg 13nmol/ kg的剂量每天给药或者每两天给药的连续给药可能是有效的。考虑到从小鼠中获得的每体 重的有效药物学剂量必须用大约10的因子纠正用于人(13)，每个人的有效剂量 被预期是 低于IOOyg/天。用于治疗慢性HBV感染的基于核苷酸类似物的方案频繁地导致抗性突变体的选 择(4，14)。这需要另一个策略和新的药物来针对HBV复制循环的不同步骤。HBV脂肽的进 入抑制代表了这种方法。由于作用模式，发明者认为其对任何种类的核苷酸抗性突变体均 是有效的。此外，因为肽的活性需要PreSl结构域(15)中的保守序列，所以肽对任何HBV 基因型均是活性的。与Fuzeon 将HIV gp41蛋白质作为靶点从而允许分子内的代偿的突 变的出现相反，以前的研究表明酰基化的HBV脂肽针对细胞组分来防止HBV和它的受体的 相互作用(16，17)。因此，抗性突变体的出现看起来是不可能的。用于HBVpreS衍生的脂肽的临床应用的明显的指征是预防还没有建立的HBV感染 (如暴露后预防、垂直传播或者肝移植的再感染的预防)。然而，进入抑制剂在慢性感染的 病人中也是有效的，如与干扰素α或者病毒RT的抑制剂相结合。因为HBV慢性感染的维 持一方面取决于被免疫系统清除的感染肝细胞的动力学转换和另一方面取决于被治愈的/ 原初细胞的(再)感染，故在uPA嵌合系统中评估这种医疗方法的有效性从而在抗病毒治 疗下(19)抑制感染的传播和抗性株的出现将是很有意义的。HBVpreS衍生的脂肽也可以抑制体外HDV的感染，HDV是一种利用HBV包膜蛋白进 入肝细胞中的卫星拟病毒(15，17，20)。因为到目前为止还没有有效的用于HDV的感染的治 疗，故preS衍生的脂肽代表第一个有选择性的疗法用于这个经常并发的肝脏疾病。在有免疫能力的病人中HBVpreS-衍生脂肽的应用引发细胞的和体液的免疫反 应。这将有益于治疗结果，因为已知识别HBVpreS/2-48的抗原表位的抗体可以压制体外 HBV感染(21)。此外，可推定天然感染中的病毒的消除需要HBVpreS-特异性免疫的成功建立。因此，除了直接干扰病毒的进入，通过肽的PreS的特异性免疫应答的刺激有助于通过 细胞溶解型或者非细胞溶解型免疫反应、特别是与IFNα相结合的病毒的消除。表1优选的疏水性修饰的preS衍生肽
肽的名称氨基酸序列IC50/IC90HBVpreS/ (-11) -48 (共有序列)共有序列SEQ ID N0.1HBVpreS/2-48m>T (共有序列)SEQID NO. 11IC50 70 pMHBYpreS/2-48stearoyl (共有序列)SEQID NO.l 1IC5o 50 pM基因型C肽* HBVpreS/ (-11) -48myr (C)天然的SEQ ID NO.4IC50 4 nMlitHBVpreS/ (-11) -48stearoyl (C)SEQ ID NO,4IC50 1 nM* HBVpreS/2-48myr (C)SEQID NO. 12IC90 5 nM*HBVpreS/2-48stcaroyl (C)SEQ ID NO.12IC90 1 nMHBVpreS/5-48myr (C)截断XT iV^= N-木辆HBVpreS/5-48stearoyl (C)型HBVpreS/9-48myr (C)HBVpreS/9-48翁0yl (C)HBVpreS/2-21myr (C)截断N-和/或C-末SEQ ID型■UJ.J mNO. 13HBVpreS/2-2Istearoyl (C)SEQ ID NO.13HBVpreS/5-21myr (C)SEQID NO. 14HBVpreS/5-2Islearoyl (C)SEQ ID NO. 14HBVpreS/9-21myr (C)HBVpreS/9-2Istearoyl (C)HBVpreS/2-15myr (C)HBVpreS/2-15stearoyl (C)HBVpreS/5-15myr (C)HBVpreS/5-15stearoyl (C)HBVpreS/9-15myr (C) **SEQ ID NO. 15HBVpreS/9-15stearoyl (C”*SEQID NO. 15HBVpreS/ (-2) -20palm (C)IC50 25 nM基因型D肽HBVpreS/l-48myr (D)天然的SEQ ID NO.5HBVpreS/2-48mjT (D)SEQID NO. 1权利要求
一种乙型肝炎病毒(HBV)的疏水性修饰的preS衍生肽，其通式如下Hm P Rn，其中，P是所述的preS衍生肽，其包含如SEQ ID NO.1所示的HBV preS共有序列的氨基酸序列或者其变体，其中变体优选选自于SEQ ID NO.1中的至少17个连续的氨基酸的N 末端和/或C 末端截断型变体；氨基酸置换或者缺失变体；包含被修饰的氨基酸、非天然的氨基酸或者拟肽类的变体；H是preS衍生肽P的所述疏水性修饰，其是P的N末端并且选自于酰基化和疏水性部分的添加，所述酰基化优选用羧酸、脂肪酸、C8 C22脂肪酸、具有亲脂性侧链的氨基酸的酰基化，所述疏水性部分的添加选自于胆固醇、胆固醇衍生物、磷脂、糖脂、甘油酯、甾族化合物、神经酰胺、异戊二烯衍生物、金刚烷、法尼醇、脂肪基、多环芳烃化合物的添加，m至少是1，R是所述preS衍生肽P的C末端修饰，其优选为可以防止降解的选自下组的部分酰胺、D 氨基酸、被修饰的氨基酸、环状氨基酸；天然的和合成的聚合物比如PEG、聚糖，n是0或者至少是1。
2.如权利要求1所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，H是酰基化的疏水性 修饰，所述酰基化选自于用豆蔻酰(C14)、棕榈酰(C16)或者硬脂酰(C18)的酰基化。
3.如权利要求1或2所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，H和/或R通过 连接物或隔离物与P连接。
4.如权利要求1至3中任一项所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，P包含 SEQ ID NO. 1中的至少20个连续的氨基酸的N-末端和/或C-末端截断型变体。
5.如权利要求1至4中任一项所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，P包含 SEQ ID NO. 1的变体，所述变体具有选自下组的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1中显示的HBV preS共有序列中的氨基酸残基2至21、残基5至21、残基5至15或残基9至15。
6.如权利要求1至5中任一项所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，P不包 含在SEQ ID NO. 1中的残基9至15上、优选在SEQ ID NO. 1中的残基9至22上的氨基酸 置换和/或缺失。
7.如权利要求1至6中任一项所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，P包含 SEQ ID NO. 1的变体，所述变体具有不同病毒种类、菌株或者亚型的氨基酸序列、优选HBV基 因型或卷毛猴HBV (WMHBV)的氨基酸序列或者其变体。
8.如权利要求7所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，P包含选自SEQ IDNOs. 2至10的氨基酸序列或者其变体。
9.如权利要求1至8中任一项所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，P包含 选自SEQ ID NOs. 11至20的氨基酸序列或者其变体。
10.如权利要求1至9中任一项所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，SEQID NO. 1中的氨基酸残基20至23被修饰，优选通过氨基酸置换而被修饰；并且/或者氨基酸 残基26至32被修饰，优选通过氨基酸置换而被修饰。
11.如权利要求10所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，SEQID NO. 1中的 氨基酸残基20至23通过丙氨酸氨基酸置换而被修饰，优选被修饰成基序APAF。
12.如权利要求10或11所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，SEQID NO. 1 中的氨基酸残基26至32通过丙氨酸氨基酸置换而被修饰，优选被修饰成基序NANAPDW或 者 NAAAPDW。
13.如权利要求10至12中任一项所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，P包 含选自SEQ ID NOs. 21至28的氨基酸序列或者其变体。
14.如权利要求1至13中任一项所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，P包 含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 20，优选选自 SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ IDN0. 4。
15.如权利要求14所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，H是用豆蔻酰(C14) 或者硬脂酰(C18)、优选用硬脂酰(C18)进行酰基化的疏水性修饰。
16.如前述权利要求中任一项所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，P包含 SEQ ID N0. 12中的至少10个连续的氨基酸残基，优选包含SEQ ID N0. 12中的至少15或 20个连续的氨基酸残基，更加优选地，包含于P中的SEQ ID N0. 12中的连续的氨基酸残基选自下组SEQ IDN0. 12中的氨基酸残基9至15、氨基酸残基2至15、氨基酸残基9至18、氨基酸残基2至 18、氨基酸残基2至20、氨基酸残基2至21、氨基酸残基5至21、氨基酸残基2至25、氨基 酸残基2至30、氨基酸残基2至35、氨基酸残基2至40、氨基酸残基2至45和氨基酸残基 2 至 46。
17.如前述权利要求中任一项所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，P包含选 自下组的氨基酸序列-包含SEQ ID N0. 12中的氨基酸残基2至15和与其相邻的SEQ ID N0. 12中的氨基酸 残基16至48的衍生物的氨基酸序列；-包含SEQ ID N0. 12中的氨基酸残基2至20和与其相邻的SEQ ID N0. 12中的氨基酸 残基21至48的衍生物的氨基酸序列；-包含SEQ ID N0. 12中的氨基酸残基2至25和与其相邻的SEQ ID N0. 12中的氨基酸 残基26至48的衍生物的氨基酸序列；-包含SEQ ID N0. 12中的氨基酸残基2至30和与其相邻的SEQ ID N0. 12中的氨基酸 残基31至48的衍生物的氨基酸序列；-包含SEQ ID N0. 12中的氨基酸残基2至35和与其相邻的SEQ ID N0. 12中的氨基酸 残基36至48的衍生物的氨基酸序列；-包含SEQ ID N0. 12中的氨基酸残基2至40和与其相邻的SEQ ID N0. 12中的氨基酸 残基41至48的衍生物的氨基酸序列；以及-包含SEQ ID N0. 12中的氨基酸序列的氨基酸序列；其中衍生物包含至少一种选自下组的修饰氨基酸置换、氨基酸缺失、被修饰的氨基 酸、非天然的氨基酸或者拟肽类，其中至少一种修饰是1、2、3、4、5种或更多种的修饰。
18.如前述权利要求中任一项所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，P包含SEQ ID NO. 12中的氨基酸序列或者有至少10个连续氨基酸的该序列的N-或/和C-末端 截断型变体，或者包含被修饰的氨基酸、非天然的氨基酸或拟肽类的其衍生物。
19.如权利要求16或19所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，H是用豆蔻酰 (C14)或者硬脂酰(C18)、优选用豆蔻酰(C14)进行酰基化的疏水性修饰。
20.如权利要求1至18中任一项所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，所述 preS衍生肽带有标记物，所述标记物优选选自荧光染料、放射性同位素和对比剂。
21.如权利要求1至19中任一项所述的疏水性修饰的preS衍生肽，其特征在于，所述 preS衍生肽与一种肽或者蛋白融合，所述肽或者蛋白优选选自白蛋白和人IgG的Fc结构 域。
22.—种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1或21中任一项所述的HBV的疏水 性修饰的preS衍生肽和可选择的药学上可接受的载体和/或赋形剂。
23.如权利要求1或21中任一项所述的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者如权利 要求22所述的药物组合物用于诊断、预防和/或治疗疾病。
24.如权利要求1或21中任一项所述的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者如权利 要求22所述的药物组合物用于抑制HBV和/或HDV感染。
25.如权利要求1或21中任一项所述的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者如权利 要求22所述的药物组合物用于预防原发性HBV和/或HDV感染。
26.如权利要求24或25所述的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物，其 特征在于，HBV的任何基因型的HBV感染都被抑制或被预防。
27.如权利要求24或25所述的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物作为 HBV和/或HDV的进入抑制剂。
28.如权利要求1或21中任一项所述的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者如权利 要求22所述的药物组合物用于治疗乙型肝炎和/或丁型肝炎，尤其是乙型慢性肝炎和/或 丁型慢性肝炎。
29.如权利要求24至26中任一项所述的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组 合物，其特征在于，其包含有效治疗量的如权利要求1或20中任一项所述的HBV的疏水性 修饰的preS衍生肽或者如权利要求21所述的药物组合物。
30.如权利要求29所述的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物，其特征在 于，所述有效治疗量的范围是每kg体重10 μ g至lmg，优选地是10 μ g至100 μ g。
31.如权利要求29或30所述的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物，其 特征在于，给药途径选自下组皮下的、静脉内的、口服的、鼻腔的、肌内的、经皮的、吸入式 的、栓剂型的。
32.如权利要求1或21中任一项所述的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者如权利 要求22所述的药物组合物的应用，用于制造抑制HBV和/或HDV感染、预防原发性HBV和 /或HDV感染和/或治疗乙型肝炎和/或丁型肝炎的药物。
33.一种疫苗组合物，其包含至少一种如权利要求1或21中任一项所述的HBV的疏水 性修饰的preS衍生肽和可选择的药学上可接受的载体和/或赋形剂。
34.如权利要求33所述的疫苗组合物，其特征在于，其包含有效治疗量的至少一种如 权利要求1或21中任一项所述的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽。
全文摘要
本发明涉及乙型肝炎病毒(HBV)的疏水性修饰的preS衍生肽，该preS衍生肽来源于HBV preS共有序列并且其N末端优选被酰基化以及C末端可选的被修饰。这些HBV的疏水性修饰的preS衍生肽是非常有效的HBV进入抑制剂以及HDV进入抑制剂，因此适用于HBV和/或HDV感染的抑制、HBV和/或HDV原发感染的预防以及(慢性)乙型肝炎和/或丁型肝炎的治疗。本发明进一步涉及包含这些HBV的疏水性修饰的preS衍生肽的药物和疫苗组合物。
文档编号C07K14/02GK101970464SQ200980103167
公开日2011年2月9日 申请日期2009年1月26日 优先权日2008年1月25日
发明者斯蒂芬·厄本, 沃尔特·米尔 申请人:鲁普莱希特-卡尔斯-海德堡大学