内化rgd肽相关的方法和组合物的制作方法

专利名称：：内化rgd肽相关的方法和组合物的制作方法
技术领域：
：本发明在广义上涉及分子医学、肿瘤学和血管生物学领域，更具体而言，涉及选择性归巢于肿瘤和血管发生部位的包含RGD序列的整联蛋白结合肽。
背景技术：
：RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)在许多细胞促粘附细胞外基质蛋白中是细胞表面受体的关键识别序列，所述细胞外基质蛋白包括纤连蛋白、玻璃粘连蛋白、层粘连蛋白、一些胶原等(RuOslahti，2003)。整联蛋白是细胞表面受体的一个大家族，可在RGD序列处结合于细胞外基质。大致三分之一的整联蛋白使用RGD序列作为它们的识别位点；其他的识别另外的序列。在凝血中，R⑶序列还可介导血小板与血纤蛋白原的结合。可将R⑶肽和拟肽用于调整整联蛋白活性。这些化合物还可用于将治疗及诊断化合物送递至整联蛋白有活性的部位。大量药物开发工作集中于R⑶和相关肽，并且，大量基于RGD的药物已上市或者在临床试验中(Ruoslahti，2003；2004)。肿瘤、组织再生和炎症可诱导从已有血管生长新血管。该过程称为血管发生，其对于伤口愈合是至关重要的，这是因为新血管形成使得多种介质、养分和氧到达愈合组织(Marin1997，Singer&Clark1999，Falanga2006，Folkman2006)。新形成的血管在结构上不同于已有血管。这类差异的主要特征是这种差异存在于肿瘤血管与正常血管之间(Ruoslahti,2002)。在非恶性组织以及在恶变前损害中血管生成性血管与肿瘤血管具有相同标记物，但也存在不同的标记物(Hoffmanetal.,2003Joyceetal.，2003)。癌症治疗发展的一个主要障碍是相对缺乏可选择性靶向癌症而几乎不靶向正常组织的试剂。例如，放射疗法和手术是通常的局部疗法，它们可造成治疗区正常组织的大量损伤，导致斑痕形成及正常组织损失。相反，化学疗法一般是全身性给药，其可造成进行快速细胞更新和连续细胞分裂的器官(例如骨髓、粘膜、皮肤和小肠)的大量损伤。结果是，在以化学治疗药物经静脉内治疗癌症患者时，经常出现不良副作用，例如恶心、脱发和血细胞计数下降。这类不良副作用可能限制可安全给药的药物量，从而抑制存活率并影响患者的生命质量。因此，需要新的治疗策略用于选择性靶向肿瘤，以提高诊断和治疗的有效性并且以降低伴随全身疗法的副作用。本发明通过提供如下这样的分子满足了该需求，即该分子4可选择性归巢于肿瘤，并适合于将药物、基因治疗载体或其他试剂选择性靶向至合适组织。同时提供了相关优点。
发明内容本文公开了包含这样一个氨基酸片段的分离肽，即该氨基酸片段包含SEQIDNOUSEQIDN0:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列，或者具有一个或多个保守氨基酸置换的SEQIDNO1,SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列。所述肽的长度可以少于100、50或20个残基。所述氨基酸片段可以是环化的，例如经二硫键环化。所述肽可选择性归巢于血管发生部位、损伤部位、手术部位、肿瘤、关节炎部位或者表达一种或多种αν整联蛋白及/或神经毡蛋白-1的细胞或组织。例如，所述细胞或组织可表达一种或多种αν整联蛋白，或者所述细胞或组织可表达一种或多种αν整联蛋白和神经毡蛋白-1。例如，所述整联蛋白可以为ανβ3整联蛋白、ανβ5整联蛋白、α5β1整联蛋白或它们的结合物。在一些形式中，所述氨基酸片段可包含氨基酸序列RGDR/K/H(SEQIDNO:325)。例如，所述氨基酸片段可包含氨基酸序列CRGDR/K/HGPD/HC(SEQIDNO326)。另外例如，所述氨基酸片段可包含氨基酸序列CRGDR/K/HGPD/E/HC(SEQIDNO:327)。另外例如，所述氨基酸片段可包含氨基酸序列CRGDR/K/HGP/VD/E/HC(SEQIDNO:328)。因此，例如，所述氨基酸片段可包含氨基酸序列CRGDHGPDC(SEQIDNO313)、CR⑶HGPEC(SEQIDNO314)、CR⑶HGPHC(SEQIDNO315)、CR⑶HGVDC(SEQIDNO316)、CR⑶HGVEC(SEQIDNO317)、CRGDHGVHC(SEQIDNO318)、CRGDKGPDC(SEQIDNO1)、CRGDKGPEC(SEQIDNO3)、CRGDKGPHC(SEQIDNO302)、CRGDKGVDC(SEQIDNO319)、CRGDKGVEC(SEQIDNO320)、CRGDKGVHC(SEQIDNO321)、CRGDRGPDC(SEQIDNO2)、CR⑶RGPEC(SEQIDNO290)、CRGDRGPHC(SEQIDNO303)、CRGDRGVDC(SEQIDNO322)、CRGDRGVEC(SEQIDNO323)或CRGDRGVHC(SEQIDNO:324)。本文还公开了一种缀合物，其中所述缀合物包含一个部分，所述部分连接于包含这样一个氨基酸片段的分离肽，即该氨基酸片段包含SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO:330)之一的氨基酸序列，或者具有一个或多个保守氨基酸置换的SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列。所述部分可以为抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化学治疗剂、细胞毒剂、抗炎剂、抗关节炎剂、纳米颗粒、多肽、核酸分子、小分子、荧光团、荧光素、罗丹明、放射性核素、铟-111、锝-99、碳-11、碳-13或它们的结合物。所述部分可以为治疗剂，例如核心蛋白聚糖(decorin)。所述部分也可以为可检测试剂。所述缀合物可包含病毒，例如噬菌体。还公开了一种将一个部分定向至血管发生处的方法，包括向所述受试者给予一种缀合物，其中所述缀合物包含一个部分，所述部分连接于包含这样一个氨基酸片段的分离肽，即该氨基酸片段包含SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO:5330)之一的氨基酸序列，或者具有一个或多个保守氨基酸置换的SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDN0:3、SEQIDNO:290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列。所述部分可用于治疗癌症、糖尿病失明、年龄相关性黄斑变性、类风湿关节炎或银屑病，或者用于促进伤口愈合。所述缀合物可具有治疗效应，例如包括减少炎症、加快伤口愈合速度、减少瘢痕组织的量、减少疼痛、减少肿胀或减少坏死。所述受试者可具有一个或多个待靶向的部位，其中所述部分被定向至所述一个或多个待靶向的部位。所述受试者可患有癌症，其中所述部分被定向至所述受试者的肿瘤血管发生处。例如，所述缀合物对所述癌症可具有治疗效应。例如，肿瘤大小可减小，或者肿瘤的生长可减少、停止或逆转。所述部分还可用于检测癌症以及/或者使一种或多种肿瘤显现。还公开了一种将一个部分定向至肿瘤的方法，包括向所述受试者给予所述缀合物，其中所述缀合物包含一个部分，所述部分连接于包含这样一个氨基酸片段的分离肽，即该氨基酸片段包含SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列，或者具有一个或多个保守氨基酸置换的SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO:330)之一的氨基酸序列。所述方法还可包括，确定所述受试者中的肿瘤是否表达一种或多种αν整联蛋白以及/或者神经毡蛋白-1，以及，如果所述肿瘤表达一种或多种αν整联蛋白以及/或者神经毡蛋白-1，则将所述缀合物给予所述受试者。例如，所述肿瘤可表达一种或多种αν整联蛋白，或者所述肿瘤可表达一种或多种αν整联蛋白和神经毡蛋白-1。所述方法还包括，确定所述受试者中的肿瘤是否以高于正常的水平表达神经毡蛋白-1，以及，如果所述肿瘤以高于正常的水平表达神经毡蛋白-1，则将所述缀合物给予所述受试者。所述肿瘤中的细胞可表达αν整联蛋白。所述肿瘤中的细胞可表达神经毡蛋白-1。所述肿瘤中的细胞可表达神经毡蛋白_2。所述肿瘤中的细胞可表达神经毡蛋白-1和/或神经毡蛋白_2。所述肿瘤中的细胞可表达αν整联蛋白和神经毡蛋白-1。所述肿瘤中的细胞可以高于正常的水平表达神经毡蛋白-1。所述整联蛋白例如可以为ανβ3整联蛋白、ανβ5整联蛋白、α5β1整联蛋白或它们的结合物。所公开的方法和组合物的其他优点一部分将在下文的描述中阐明，一部分可以从说明书中获知，或者可通过实施所公开的方法和组合物而得知。所公开的方法和组合物的优点将通过所附权利要求书中具体指明的要素和组合实现和获得。应当理解的是，上文的一般性描述和下文的具体描述都仅仅是示例性和解释性的，并不是对本发明要求保护范围的限制。附图包含于本说明书中并构成本说明书的一部分，附图阐述了所公开方法和组合物的一些实施方案，它与文字描述一起作为对所公开方法和组合物的原理的解释。图1示出以下过程中的Τ7噬菌体文库的富集模式的实例对选择性归巢于人前列腺癌的骨(胫骨)异种移植物中血管的肽进行筛选。进行了3轮离体噬菌体展示，随后进行1轮体内噬菌体展示。然后，将所选的噬菌体库经又一轮离体噬菌体展示并将它与靶肿瘤的结合和与正常骨的结合相比较。将来自体内筛选回合和离体最后一轮的随机个体噬菌体克隆测序。结果显示于表1中。图2A、2B和2C示出iRGDl肽向多种人异种移植物肿瘤的归巢。将荧胺标记的iRGDl肽(200μg)通过尾静脉注入至在胫骨和脑中携带PPC1人前列腺癌异种移植物(A)、MIAPaCa-2人胰脏原位异种移植肿瘤(B)或MDA-MB-435乳腺癌原位异种移植肿瘤(C)的免疫缺陷小鼠。在循环4.5小时后，对小鼠灌注以除去未结合的肽，采获器官并且在UV光(左图)和白光(右图)下观察。图3A和3B示出iRGDl肽向鼠胰腺癌的归巢。A，将200μg荧胺标记的iRGDl肽通过尾静脉注入至患胰管腺癌(PDAC)的转基因小鼠，并使所述肽循环4.5小时。B，将过量的非标记的iRGDl(2mg/小鼠)注入PDAC小鼠，30分钟后如A中所述注入荧胺标记的iRGDl肽。所示为在UV光(左)和白光(右)下观察的采获器官。图4A、4B、4C和4D示出FAM_iRGD肽在PDAC损害中时间依赖性体内归巢模式。将大约200μg的FAM-iRGDl注入至携带PDAC的小鼠，并使其循环15分钟(A)、30分钟(B)、2小时(C)和4.5小时(D)。分别显示以DAPI进行的核染色，以及以CD31抗体进行的血管内皮细胞染色。可注意到注入FAM-iRGDl后15分钟(A)-30分钟(B)，染剂停留于血管(箭头)或血管周围细胞(A，右上角窗口内箭头)，但在2小时(C，箭头)或4.5小时(D，箭头)后未观察到所述肽的血管染色。在肽注入后30分钟，肽荧光出现于肿瘤腺中(B，主图和右上角插图)；在2小时(C，星号)和4.5小时(D，星号)后所述肿瘤中的一些个体细胞呈强阳性。图5示出iRGDl肽在体外内化至肿瘤细胞中。将培养于涂敷有I型胶原的盖玻片上的PPCUMDA-MB-435和MIAPaCa-2细胞在37°C下与10μM荧胺-iRGDl孵育2小时，以质膜标记物和核染剂DAPI染色，并在共聚焦显微镜下成像。图6A和6B示出iRGD噬菌体内化至肿瘤细胞中。A，在37°C下，将展示iRGD肽、RGD-4C(CDCRGDCFC，SEQIDNO4)或CG7C(对照噬菌体)的T7噬菌体与多种肿瘤细胞系一起孵育30分钟。通过以酸性缓冲液冲洗细胞除去结合于细胞表面的噬菌体，援救并滴定内化的噬菌体。iR⑶噬菌体的内化比RGD-4C(CDCRGDCFC，SEQIDNO4)的内化显著更有效。B，展示iR⑶肽(主图)或CG7C对照肽(右上框)的T7噬菌体在37°C下与培养于涂敷有I型胶原的盖玻片上的PPCl细胞孵育2小时，以T7抗体、质膜标记物和DAPI染色以显示核，并通过共聚焦显微镜显像。注意，iRGD广泛地内化至肿瘤细胞中，而对照噬菌体(插图)未内化至肿瘤细胞中。图7A和7B示出展示CG7C(对照噬菌体)或在筛选中出现的iRGD变体的实例(SEQIDNO:1、106、302、2、262和303)的噬菌体的结合(A)和内化(B)。在4°C(A)和37°C(B)下，将PPCl细胞与噬菌体孵育1小时。援救结合于细胞表面的噬菌体(A)或内化至所述细胞中的噬菌体(B)用于滴定。图8A和8B示出展示CG7C(对照噬菌体)、iRGDl、或携带对每个(下划线)氨基酸进行丙氨酸置换的iRGD变体(SEQIDNO:1和304-310)的噬菌体的结合(A)和内化(B)。在4°C(A)和37°C(B)下，将PPCl细胞与噬菌体孵育1小时。援救结合于细胞表面的噬菌体(A)或内化至所述细胞中的噬菌体用于滴定。注意，5种残基R、G、D、K和G中任一种的丙氨酸突变会消除或大大降低iRGD噬菌体与肿瘤细胞的结合和其在肿瘤细胞中的内化。图9A和9B示出展示CG7C(对照噬菌体)、CRGDKG、CRGDK、CRGD或CRG(分别为SEQIDNO5-8)的噬菌体的结合㈧和内化⑶。在4°C(A)和37°C⑶下，将PPCl细胞与噬菌体孵育1小时。援救结合于细胞表面的噬菌体(A)或内化至所述细胞中的噬菌体用于滴定。图IOA和IOB示出展示系列肽的UV灭活噬菌体对iRGDl噬菌体结合于肿瘤细胞(A)或内化至肿瘤细胞(B)的抑制。A，将PPCl细胞以100-1000倍过量的UV灭活的展示iRGDl、KGD(CKGDKGPDC，SEQIDNO9)或CG7C(对照噬菌体)的噬菌体进行预处理，然后在4°C下与活化iRGD噬菌体或CG7C噬菌体共孵育1小时。滴定结合于细胞表面的噬菌体。B，如A中所述地处理PPCl细胞，不同点是将它们在37°C下与iRGDl或CG7C噬菌体共孵育。如对于图5A所述，救援内化的噬菌体用于滴定。图IlA和IlB示出抗整联蛋白抗体系列对iRGDl噬菌体结合㈧和内化⑶的抑制。A，在4°C下，将PPCl细胞在有或无抗整联蛋白抗体系列的条件下预处理或者以作为对照的正常小鼠IgG预处理30分钟，然后在4°C(A)或37°C⑶下以iRGDl噬菌体或CG7C对照噬菌体孵育1小时。援救并滴定结合于细胞表面的噬菌体(A)或内化至所述细胞中的噬菌体(B)。抗αV整联蛋白亚基的功能阻断抗体可有效地抑制所述iRGDl噬菌体的结合和内化。图12A-12E示出iRGD肽的体内肿瘤归巢。a,将PBS中大约200μg的FAM-iRGD或对照肽静脉注射至携带新生胰管腺癌(PDAC)的LSL-Kras，p53_fl/+，p48_Cre小鼠(BardeesyandDePinho，Pancreaticcancerbiologyandgenetics.NatureRev.Cancer2,897-909(2002))。使所述肽循环2小时，收集器官并在UV光(左图)或白光(右图)下观察。箭头指向肿瘤。b、c，iRGD和对照肽体内分布的定量。如本文中他处所述，将FAM-iRGD；非整联蛋白结合iRGD突变体FAM-CRGEKGPDC(SEQIDNO291)(FAM-iRGE)；以及FAM标记的环状多甘氨酸肽(FAM-CG7C)注射至PDAC小鼠(BardeesyandDePinho,Pancreaticcancerbiologyandgenetics.NatureRev.Cancer2，897-909(2002))(b)。在一些情况下，在FAM-iRGD之前30分钟注射10倍过量的未标记iRGD肽或iRGE肽(c)。以ImageJ软件定量测定每个组织中的荧光。以Student'st检验进行统计分析。在c中未注射未标记肽的FAM-iR⑶归巢作为100%。η=3；误差棒，标准差；双星号，ρ<0.01。d，来自以标明的肽、噬菌体和微团注射的小鼠的原位22RV-1人前列腺癌异种移植物的共聚焦图像。iRGD与类似的整联蛋白结合的非内化肽CRDGC(SEQIDNO301)相当。游离肽的循环时间为2小时，展示肽的噬菌体为15分钟，肽偶联微团为3小时。箭头指向血管壁内或刚好在血管壁之外的FAM-CRGDC(SEQIDNO292)肽或CRGDC(SEQIDNO292)噬菌体，表明它归巢于肿瘤血管，但不扩散和内化。显示了来自3个肿瘤的每一个的多个切片的代表性视野。比例尺=50μm。e，注射以Cy7标记的FAM-iRGD微团或FAM对照微团的PDAC小鼠(BardeesyandDePinho(2002))的全身成像。在注射所述微团后3小时拍摄图像。仅显示以虚线描绘的皮肤脱毛区域。浅着色，800nm(Cy7)；较深着色，700nm(背景荧光)。荧光器官的锯齿形状由小鼠的呼吸引起。图13A-13C示出iRGD结合于αv整联蛋白。a，合成iRGD肽及其变体以及相应非感染噬菌体对iRGD噬菌体与PPCl前列腺癌细胞结合的抑制作用。b、c，整联蛋白抗体或对照小鼠IgG对iRGD噬菌体与PPCl细胞⑶和M21细胞(c)结合的抑制作用。统计分析以ANOVA(a、c)和Student'st检验进行(b)。在a中，将无抑制剂的iRGD噬菌体结合作为100%。η=3；误差棒，标准差；单星号，ρ<0.05；双星号，ρ<0.01；三星号，ρ<0.001。图14Α-14Ε示出肿瘤细胞内iRGD内化中的CendR基序。a,以非感染RPARPAR(SEQIDNO296)或RPARPARA(SEQIDNO297)噬菌体预处理或者未经其预处理的PPCl细胞内的胰蛋白酶处理的iRGD噬菌体的内化。b，合成CRGDK(SEQIDN6)、RPARPAR(SEQIDNO296)和RPARPARA(SEQIDNO297)肽以及相应的非感染噬菌体对CRGDK(SEQIDNO6)噬菌体与PPCl结合的抑制。c，CRGDK(SEQIDNO6)噬菌体与以神经毡蛋白_1阻断抗体(抗NRP-I抗体)或对照山羊IgG处理的PPCl细胞的结合(左图)，以及与以神经毡蛋白-IcDNA转染以诱导神经毡蛋白-I(NRP-I)强表达、以仅载体转染或未转染的M21细胞的结合(右图)。d，展示CendR内化肽RPARPAR(SEQIDNO296)和CRGDK(SEQIDNO6)的非感染噬菌体对PPCl内iRGD和iRGE噬菌体内化的抑制。e，阻断神经毡蛋白_1功能的抗神经毡蛋白-1抗体(抗NRP-1)对PPCl细胞内iRGD噬菌体内化的剂量依赖性抑制。统计分析以ANOVA(a、b、d)和Student'st检验进行(c、e)。在b中，将无抑制剂的CRGDK(SEQIDNO6)噬菌体结合作为100%。η=3；误差棒，标准差；单星号，ρ<0.05；双星号，ρ<0.01；三星号，ρ<0.001。图15Α和15Β示出内肿瘤细胞iRGD的内化涉及神经毡蛋白-1。a，以iR⑶噬菌体孵育的PPCl细胞的共聚焦显微镜图像。对所述细胞进行噬菌体、神经毡蛋白-1和细胞核的染色。右图是左图中虚线区域的高倍放大图。注意，iR⑶噬菌体内化于PPCl细胞内，并且与神经毡蛋白-1共同位于核周区域(箭头)和细胞核(箭头)。比例尺=20μm。b，与整联蛋白(右图)和神经毡蛋白_1(左图)表达相关的FAM-iRGD肽(绿色)在PDAC(BardeesyandDePinho(2002))中的时间依赖性归巢。FAM-iRGD靶向的血管对于αν整联蛋白和神经毡蛋白-1(箭头)都呈阳性。插图显示FAM-iR⑶靶向的血管的⑶31染色。在所检查的几乎所有肿瘤导管中，为αν整联蛋白阳性。对于神经毡蛋白-1亦呈强阳性的肿瘤细胞(箭头)和肿瘤导管(星号)在内化和保留FAM-iRGD方面有极强的能力。比例尺=50μm。图16A和16B示出合成iRGD肽向原位异种移植物和自发小鼠肿瘤的归巢。将PBS中大约200μg的FAM-iRGD经静脉给予携带肿瘤的小鼠。使所述肽循环2小时，收集器官并在UV光或白光下观察。箭头指向肿瘤。a，所述肿瘤为人前列腺癌PPCl(Zhangetal.,Lymphaticzipcodesinpremalignantlesionsandtumors.CancerRes.66,5696-5706(2006))的脑和腔骨异种移植物，以及22rv_l(Drakeetal.，Assessingtumorgrowthanddistributioninamodelofprostatecancermetastasisusingbioluminescenceimaging.Clin.Exp.Metastasis22，674-684(2005))、人胰腺癌MIAPaCa-2(Sugaharaetal.,ChondroitinsulfateEfragmentsenhanceCD44cleavageandCD44-d印endentmotilityintumorcells.CancerRes.68，7191-7199(2008))和人乳腺癌BT474(Rusnaketal.，Theeffectsofthenovel,reversibleepidermalgrowthfactorreceptor/ErbB-2tyrosinekinaseinhibitor，GW2016,onthegrowthofhumannormalandtumor-derivedcelllinesinvitroandinvivo.Mol.CancerTher.1，85-94(2001))的原位异种移植物。b，自发小鼠肿瘤为RIP_Tag2小鼠的胰岛肿瘤(Hanahm，Heritableformationofpancreaticβ-celltumorsintransgenicmiceexpressing9recombinantinsulin/simianvirus40oncogenes.Nature315,115-122(1985))禾口K14-HPV16小鼠的宫颈月中瘤(Arbeitetal.,ProgressivesquamousepithelialneoplasiainK14-humanpapillomavirustype16transgenicmice.J.Virol.68,4358-4368(1994))。图17示出iRGD噬菌体穿透至肿瘤组织中并内化至所述肿瘤细胞中。来自以iRGD、RGD-4C或CG7C噬菌体注射的转基因小鼠的PDAC肿瘤的共聚焦图像。箭头指向噬菌体阳性的血管，星号显示肿瘤导管。上方右图示出上方左图中虚线区域的放大图。该插图表示RGD-4C噬菌体靶向的血管。iR⑶噬菌体广泛地扩散至肿瘤实质中并内化至肿瘤细胞中，而RGD-4C噬菌体靶向血管但保持接近血管。CG7C噬菌体未显示肿瘤归巢。比例尺=50μm。图18示出iRGD噬菌体和CG7C噬菌体在与PPCl细胞结合和它们在PPCl细胞中内化方面的比较结果。在4°C或37°C下，将PPCl细胞以iRGD或CG7C噬菌体处理1小时。为了评估内化，在噬菌体滴定之前通过以酸缓冲液洗涤所述细胞以除去结合于细胞表面的噬菌体。注意，在4°C下未出现iRGD噬菌体的内化。以Student'st检验进行统计分析。η=3，误差棒表示标准差。图19Α和19Β示出肿瘤细胞中整联蛋白的表达。a、b，通过流式细胞术分析的PPCl(A)和M21细胞⑶中的整联蛋白表达。该表达谱代表未染色的细胞(浅灰色)的值，以及与小鼠IgG(深灰色)或作为一抗的适当整联蛋白抗体(带箭头的非阴影)孵育的细胞的值。图20示出从以FAM-iR⑶肽处理的PPCl细胞回收的肽片段。在存在蛋白酶体抑制剂MG132的情况下，将PPCl细胞在37°C下与FAM_iRGD肽(FAM在N末端)孵育90分钟。以抗FITC抗体亲和柱回收肽片段并通过质谱法进行分析。注意，存在FAM-CRGDK[M+H](m/ζ1,049)(SEQIDNO6)和FAM-CRGDK[M+Na](m/z072)(SEQIDNO6)，并且不存在全长FAM-iRGD(m/z:1，419)。从用作抗FITC抗体亲和柱的同种型对照的小鼠IgG柱未回收到主肽片段，或者在未暴露于FAM-iRGD的PPCl细胞裂解物就抗FITC抗体进行分级时未回收到主肽片段(未显示)。以FAM在C末端标记的iRGD肽通过所述细胞未产生GPDC-FAM(预计来自产生CRGDK(SEQIDNO6)的iRGD切割作用的988质量单位片段)(未显示)。这表明仅结合神经毡蛋白-1的N末端片段(CRGDK；SEQIDNO6)内化，这可能出现于如下情况下，即在内化之前所述iRGD肽的K-G键被蛋白酶水解切割，并且二硫键减少。省略MG132仅产生小于FAM-CRGDK(SEQIDNO6)的肽(未显示)，表明细胞内FAM-CRGDK(SEQIDNO6)在蛋白酶体中被降解。图21A和21B示出CRGDK(SEQIDNO6)噬菌体和与整联蛋白表达相关的肿瘤细胞的结合。a，整联蛋白抗体不抑制CRGDK(SEQIDNO:6)噬菌体与PPCl细胞的结合。b，CRGDK(SEQIDNO6)噬菌体类似地结合于αν整联蛋白表达水平不同的Μ21细胞(αν整联蛋白表达模式参考图19Β)。图22示出iRGD和CRGDK(SEQIDNO6)噬菌体的PPCl和M21细胞内化作用。将细胞在37°C下以iR⑶或CRGDK(SEQIDNO6)噬菌体处理1小时，然后进行酸缓冲液洗涤以除去结合于细胞表面的噬菌体。注意，在神经毡蛋白-1高表达的PPCl细胞中，CRGDK(SEQIDNO6)噬菌体的内化比iRGD噬菌体更有效，而在M21细胞中情况相反。图23示出，缺少CendR元件的RGD噬菌体不能有效地内化至肿瘤细胞中。与表达iRGD噬菌体变体CRGDGGPDC(SEQIDNO298)、CRGDC(SEQIDNO292)或RGD-4C的T7噬菌体一起孵育的PPCl细胞的共聚焦显微镜图像。对所述细胞进行噬菌体(箭头指示)、神经毡蛋白-1(远端及侧面)和细胞核(中心块)的染色。CRGDGGPDC(SEQIDNO298)噬菌体的右图是左图虚线区域的高倍放大图。注意，RGD噬菌体可结合于细胞的表面(箭头)，但不能有效地内化至细胞中。比例尺=10μπι。图24示出iRGD的两步内化机制。iRGD肽(SEQIDNO1)积聚于肿瘤中表达αν整联蛋白的内皮细胞及其他细胞表面。RGD基序可介导整联蛋白的结合。所述肽被细胞表面相关蛋白酶切割，以将所隐含的CendR元件RXXK/R(SEQIDNO13和14)暴露于C末端(有剪刀的虚线)(SEQIDNO:6和311)。然后，所述CendR元件介导与神经毡蛋白-1的结合，结果是内化至细胞中。所述肽可携带一种载物至细胞中，例如简单的化学物或纳米颗粒，条件是所述载物连接于iRGD肽的N末端，这是因为在所述肽内化之前二硫键似乎断裂(有箭头的虚线)。所丢掉的肽为SEQIDN0:312。图25A-25C示出来自噬菌体展示筛选的肿瘤和富集数据。a，PPCl胫骨异种移植物上图，以ImageStationInVivoFX拍摄的下图中所示区域的χ射线图像。箭头指向胫骨中的肿瘤。b，从注射至左心室中的100万个肿瘤细胞弥散的GFP-PC-3肿瘤。使用IllumatoolBrightLightSystemLT-9900在UV光下对小鼠进行成像。将生长于骨(例如颂、桡骨、股骨)中的肿瘤用于筛选。c，在连续的噬菌体展示筛选回合中得到富集的实例。具体实施例方式通过参考对下文中包括的具体实施方案和实施例的具体描述，以及参考附图及其上下文的描述，可以更容易地理解所公开的方法和组合物。在公开并描述本发明的化合物、组合物、物质、装置和/或方法之前，应当理解，除非另外指出否则它们不局限于具体的合成方法或具体的重组生物技术方法，或者除非另外指出否则它们不局限于具体的试剂，因为这些理所当然可以有变化。还应当理解，本文中使用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，不是意欲进行限制。A.综述将噬菌体展示肽文库的体内筛选用于探测肿瘤中的血管特化。该方法已揭示了血管中高水平的异质性；并且对于大量的正常器官和组织、肿瘤以及动脉粥样硬化损伤已鉴定了组织特异性归巢肽(Rajotteatal.，1998；Ruoslahti，2002；Liuetal.，2003；Zhangetal.,2005；Koloninetal.，2006)。在血管和淋巴管中，肿瘤已被显示携带特异性血管标记物(Ruoslahti，2002;Laakkonenetal.,2002；2004；Zhangetal.，2006)。可以认为，在噬菌体展示筛选中已用作靶的研究肿瘤类型可能揭示具有肿瘤选择性的其他归巢肽序列。选择前列腺癌和前列腺癌转移作为靶肿瘤。已发现了这样的一类肽，即这类肽选择性地靶向新血管或者表达αν整联蛋白的细胞和组织。在一些形式中，所述肽具有序列CRGDR/KGPD/EC(SEQIDNO:300)。具体而言，已经鉴定了3种选择性靶向新血管的肽CRGDKGPDC(称为iRGDl，SEQIDNO:1)、CRGDRGPDC(称为iRGD2，SEQIDNO2)和CRGDKGPEC(称为iRGD3，SEQIDNO:3)。该类肽的另一实例包括CRGDRGPEC(SEQIDNO290)。在一些形式中，所述肽可具有序列RGDR/K/H(SEQIDNO:325)。例如，所述肽可具有序列CRGDR/K/HGPD/HC(SEQIDNO326)。另外例如，所述肽可具有序列CRGDR/K/HGPD/E/HC(SEQIDNO:327)。另外例如，所述肽可具有序列CRGDR/K/HGP/VD/E/HC(SEQIDNO:328)。因此，例如，所述肽可具有序列CRGDHGPDC(SEQIDNO313)、CR⑶HGPEC(SEQIDNO314)、CRGDHGPHC(SEQIDNO315)、CRGDHGVDC(SEQIDNO316)、CRGDHGVEC(SEQIDNO317)、CRGDHGVHC(SEQIDNO318)、CRGDKGPDC(SEQIDNO1),CRGDKGPEC(SEQIDNO:3)、CRGDKGPHC(SEQIDNO302)、CRGDKGVDC(SEQIDNO:319)、CRGDKGVEC(SEQIDNO320)、CRGDKGVHC(SEQIDNO321)、CRGDRGPDC(SEQIDNO2)、CRGDRGPEC(SEQIDNO:290)、CR⑶RGPHC(SEQIDNO:303)、CRGDRGVDC(SEQIDNO:322)、CRGDRGVEC(SEQIDNO:323)或CRGDRGVHC(SEQIDNO:324)。这些归巢肽可证明将全身靶向肿瘤送递抗癌症剂是可行的。B.定义除非上下文中另外明确指出，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式的“一”、“一种”和“该”包括复数指代对象。因此，例如，提及“一种药物载体”包括两种或多种该载体，等等。本文中范围可以表示为从“约”一个具体的数值，和/或至“约”另一个具体的数值。当表示为这类范围时，另一实施方案可包含从一个具体数值和/或至另一个具体数值。类似地，当通过在前面使用“约”将数值表示为近似值时，应当理解，该具体的数值形成另一实施方案。应当进一步理解，每个区间的端点在与另一个端点相关和独立于另一个端点时都是有意义的。还应当理解，本文中公开了许多值，并且每个值除该值本身外在本文中还被公开为“约”该具体值。例如，如果值“10”被公开，那么“约10”也被公开。还应理解，如本领域技术人员适当理解的，如果一个值被公开，那么“小于或等于”该值、“大于或等于该值”以及这些值之间可能的区间也被公开。例如，如果值“10”被公开，那么“小于或等于10”以及“大于或等于10”也被公开。还应理解，在本申请通篇中，数据以多种不同形式提供，并且该数据表示终点和起点以及这些数据点的任意组合的区间。例如，如果具体数据点“10”和具体数据点15被公开，那么应理解，除10和15之间以外，大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15认为被公开。还应理解，两个具体单元之间任一单元也被公开。例如，如果10和15被公开，那么11、12、13和14也被公开。在本说明书和随附的权利要求书中，将涉及多个术语，这些术语将被定于具有如下含义“任选的”或“任选地”是指后面描述的事件或情况可能发生，也可能不发生，且该描述包括所述事件或情况发生以及不发生的情形。本申请全文中，参引了多份出版物。这些出版物的公开内容通过引证的方式全文纳入本申请，以更全面地描述本发明所属
技术领域：
的状态。基于倚赖参考文献的句子中所论述的包含在所述参考文献中的素材，所公开的参考文献还单独地并具体地通过引用的方式纳入本文。应理解，除非另外指出，所公开的方法和组合物不限于具体合成方法、具体分析技术或具体试剂，因此可以有变化。还应理解，用于本文中的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，不是意欲进行限制。材料本文除公开了可用于本文公开的方法中组合物本身外，还公开了可用于制备所公开的组合物的组分。本文公开了这些和其他材料，应理解当公开这些材料的组合、子集、相互作用、分组等时，虽然可能没有明确公开提及这些化合物的各个组合和总的组合以及排列，但每种都在本文中明确地考虑和描述。例如，如果公开和讨论了具体肽并且讨论了可以对包括所述肽的若干分子作出的若干修饰，那么除非明确作出相反的说明，否则所述肽以及可能的修饰的每种组合和排列都会被明确考虑。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，还公开了一个组合分子的实例A-D，那么即使没有单独提到每种组合，每种组合也都被独立和综合地考虑为有意义的组合，A-E、A-F、B-D、B-E、B_F、C_D、C-E和C-F应认为被公开。类似地，它们的任何子集或组合也被特别考虑和公开。因此，例如，所述子集A-E、B-F和C-E应认为被公开。此概念适用于本申请所有方面，包括但不限于制备和使用所公开组合物的方法的步骤。因此，如果有多个可实施的其他步骤，应理解每个这些其他步骤都可与所公开方法的任何具体实施方案或实施方案组合一起实施。公开了涉及包含这样一个氨基酸片段的分离肽的方法和组合物，即所述氨基酸片段包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列，或者相关的氨基酸序列。公开了包含这样一个氨基酸片段的分离肽，即所述氨基酸片段例如包含SEQIDNO=USEQIDN0:2、SEQIDNO:3,SEQIDNO:290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列，或者具有一个或多个保守氨基酸置换的SEQIDNO1,SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列。本领域技术人员能够容易地评估哪些氨基酸可被置换，并保持所述肽的功能。所述肽例如可具有小于100个残基的长度。所述肽例如可具有小于50个残基的长度。所述肽例如可具有小于20个残基的长度。所公开的氨基酸片段例如可包含所述SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO:330)之一的氨基酸序列。所公开的氨基酸片段例如可包含具有一个或多个保守氨基酸置换的SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO:330)之一的氨基酸序列。例如，所公开的肽可以是环形或环状。例如，所公开的肽可以是经二硫键成环或环化的。例如，所公开的肽可以是非环状或线性的。例如，所公开的氨基酸片段可以是环形或环状。例如，所公开的氨基酸片段可以是经二硫键环化的或环状化的。例如，所公开的氨基酸片段可以是非环状或线性。例如，所公开的肽可以由所述氨基酸片段组成。例如，所公开的肽可以选择性归巢于血管发生部位，例如伤口部位或肿瘤。还公开了缀合物，其中所述缀合物包含连接于一条公开的肽的一个部分，所述肽例如为包含例如如下氨基酸片段的肽，所述氨基酸片段例如包含SEQIDNO=USEQIDN02、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO:330)之一的氨基酸序列，或者具有一个或多个保守氨基酸置换的SEQIDNO1,SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列13CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO:329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列。例如，所述部分可以为抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化学治疗剂、细胞毒剂、抗炎剂、抗关节炎剂、多肽、核酸分子、小分子、荧光团、荧光素、罗丹明、放射性核素、铟-111、锝-99、碳-11、碳-13或它们的结合物。例如，所述部分可以为治疗剂。例如，所述部分可以为可检测试剂。例如，所述缀合物可包含病毒。例如，所述缀合物可包含噬菌体。例如，所述缀合物还可包含第二肽，其中所述第二肽可包含例如这样一个氨基酸片段，即该氨基酸片段包含SEQIDNO1,SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO:329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO:330)之一的氨基酸序列，或者具有一个或多个保守氨基酸置换的SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDN0:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列。所述缀合物可定向至、靶向于或归巢于受试者的血管生成组织，由此可将所述部分定向至血管生成组织。如果所治疗的是肿瘤，那么所述部分就可定向至与所述肿瘤相关的血管生成组织。所述缀合物例如可用于治疗癌症。所述缀合物对癌症可具有治疗效果。例如，肿瘤大小可减小，并且/或者肿瘤的生长可减少、停止或逆转。所述部分可用于检测癌症以及/或者使一种或多种肿瘤显现。所述受试者可有正在新生血管的伤口。所述伤口例如可以是慢性的，或者可以是急性的。所述伤口可以是任何愈合阶段，从炎症阶段，至肉芽形成，至收缩，至上皮化，至重塑阶段，其包括胶原化和瘢痕组织形成。例如，所述伤口可来自于车、船或飞机事故；枪击、刺伤或刀伤；坠落；工业事故；或者刺穿。例如，所述伤口还可以在手术中形成。例如，所述伤口还可以是治疗的结果，例如植入口。例如，所述缀合物可用于治疗至少一个损伤部位。所述缀合物对至少一个损伤部位可具有治疗作用。例如，所述部分可用于检测、显现或成像至少一个损伤部位，或者上述的组合。例如，所述缀合物还可用于治疗例如糖尿病失明、年龄相关性黄斑变性、类风湿关节炎或银屑病。例如，所述缀合物可用于将所述部分定向至表达一种或多种αν整联蛋白以及/或者神经毡蛋白-1的细胞或组织。例如，所述细胞或组织可表达一种或多种αν整联蛋白，或者所述细胞或组织可表达一种或多种αν整联蛋白和神经毡蛋白-1。例如，所述整联蛋白可以为ανβ3整联蛋白、ανβ5整联蛋白、α5β1整联蛋白或它们的结合物。Α.归巢分子公开了选择性归巢于血管发生部位的归巢分子。多种归巢分子可用于本文公开的组合物、缀合物和方法中。这类归巢分子包括，但不限于本文公开的肽。具体而言，本文中对归巢分子及其用途的提及以及描述还被具体地考虑应用以及适用于所公开的肽。所公开的化合物、组合物、缀合物和方法可以以多种形式包含或使用所公开的归巢分子。为了方便表达，在本文处将描述肽的使用或包含内容。应理解的是，在这些情况下，应认为多种形式的归巢分子也可以与描述的肽相同或类似的方式使用或包含，并且这类使用和包含由此被具体地考虑和公开。本文使用的术语“分子”在广义上用于指多聚体或非多聚体有机化学物，例如小分子药物；核酸分子，例如RNA、DNA(如cDNA)或寡核苷酸；肽；或者蛋白，例如，生长因子受体或抗体或其片段如Fv、Fd或Fab片段，或包含所述抗原结合域的另一抗体片段。本文使用的术语“归巢分子”是指体内优先于正常组织地选择性归巢于血管发生部位或肿瘤(具体是肿瘤血管)。类似地，术语“归巢肽”是指体内选择性归巢于血管发生部位的肽。应理解，体内选择性归巢于血管发生部位的归巢分子可表现出优先归巢于这类部位。“选择性归巢”是指，与非靶相比，所述归巢分子在体内优先结合于所述靶。例如，这类归巢分子可选择性归巢于血管发生部位。选择性归巢于例如血管发生部位的特征一般在于，与无血管发生组织的多种组织类型相比，在血管发生中的局部化高出至少2倍。归巢分子的分子的特征可在于，与几种或许多种非再生组织类型相比或者与大多数或所有非再生组织相比，在再生组织中的局部化优先5倍、10倍、20倍或以上。因此，应理解的是，在一些情况下，除了归巢于再生组织、伤口组织或肿瘤，归巢分子会部分地归巢于一种或多种正常器官。选择性归巢还可称作靶向。术语“血管发生(angiogenesis)”的定义是涉及从已有血管生长出新血管的生理过程。术语血管生成(vasulogeneisis)用于自发的血管形成，术语内增(intussusception)用于通过使已有血管分裂的新血管形成。血管发生不仅是伤口愈合的正常过程，而且是生长和发育的正常过程。它也是肿瘤从休眠状态转变成恶性状态的基本步骤。在如下情况下认为在进行血管发生与血管发生前的同一组织或者与标准或对照相比，指定区域内的新血管的生长增加10%或更多。在一些实施方案中，归巢分子可以是这样一种分子，即该分子选择性地归巢于进行血管发生的组织例如伤口组织或者肿瘤，且不是抗体或其抗原结合片段。术语“抗体”是现有技术中公知的术语，是指包含一个或多个互补决定区(CDR)的肽或多肽。参见，例如Borrabaeck,AntibodyEngineering2ndEdition,OxfordUniversityPress,NewYork(1995)。归巢(包括优先和/或选择性归巢)不是指所述归巢分子不结合于任何正常区域和/或非靶区域(例如非肿瘤、非凝块和/或非伤口)。在一些实施方案中，就相对Ki而言，归巢选择性可以为，对相应靶的选择比其他非靶部分高例如至少约20倍，至少约30倍，至少约50倍，至少约75倍，至少约100倍，至少约150倍或至少约200倍。在一些实施方案中，所述归巢分子对于相应靶可具有至少约50倍的选择性，至少约100倍的选择性，至少约200倍的选择性，至少约300倍的选择性，至少约400倍的选择性，至少约500倍的选择性，至少约600倍的选择性，至少约700倍的选择性，至少约800倍的选择性，至少约1000倍的选择性或至少约1500倍的选择性。例如，在一些优选的实施方案中，所述归巢分子抗靶的Ki值可以为小于约200nM，小于约150nM，小于约IOOnM或小于约75nM。在一些优选的实施方案中，所述归巢分子抗靶的Ki值可以为大于约50nM，大于约25nM，大于约20nM，大于约15nM，大于约10nM，大于约5nM，大于约3nM或大于约InM。在一些优选的实施方案中，所述靶向部分结合其靶的Kd小于约10_8M，小于约10_9M，小于约10_~，小于约10_"M，小于约1(Γ12Μ，小于约10_13Μ或小于约IO-14M0在归巢分子识别和/或结合其靶的情形下，结合可以指共价和非共价结合，例如其中归巢分子可通过共价和/或非共价结合连接、附着或偶联于其靶。结合可以是高亲和性或低亲和性，优选高亲和性。可以使用的结合力的实例包括，但不限于共价键、偶极作用、静电力、氢键、疏水作用、离子键和/或范德华力。1.肽和拟肽公开了涉及包含这样一个氨基酸片段的分离肽的方法和组合物，即所述氨基酸片段包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列，或者相关的氨基酸序列。所述分离肽可包含例如这样一个氨基酸片段，即该氨基酸片段包含例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列，或者具有一个或多个保守氨基酸置换的SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDN0:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列。所述氨基酸片段可包含与以下序列至少有约90%、80%、70%或60%相同的氨基酸序歹Ij=SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列，或者其间表示一个或多个氨基酸改变(包括插入或缺失)的任何百分数。所述氨基酸片段可包含SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列。所述氨基酸片段可包含具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个保守氨基酸置换的SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDNO:290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列。所述氨基酸片段可包含SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列的嵌合体。这类嵌合体可以是加合型的，其中一序列的序列被添加至另一序列；置换型的，其中用一序列的序列置换另一序列的序列；或者它们的结合物。所公开的肽可由所述氨基酸片段组成。例如，所述氨基酸片段可以为非环形、线性、环形或环状。例如，所述氨基酸片段可以是经任何合适的键如二硫键成环或环化的。所述肽可以有任意合适的长度，例如小于100个残基的长度。例如，所述肽可具有小于50个残基的长度。例如，所述肽可具有小于20个残基的长度。所公开的肽可选择性地归巢于进行血管发生的组织例如伤口组织或肿瘤。所公开的肽可选择性地与这类组织或肿瘤作用。还公开了这样的分离肽，即所述分离肽具有小于100个残基的长度并包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列；或者其拟肽。例如，这类分离肽具有小于50个残基的长度，或者小于20个残基的长度。在具体的实施方案中，所公开的是这样一种肽，即该肽包含SEQIDNO1,SEQIDNO:2、SEQIDN0:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列，并具有小于20、50或100个残基的长度。所公开的肽可以为分离的形式。在本文提及所公开的肽时使用的术语“分离的”是指这样一种形式的肽，即该形式相对不含诸如如下物质污染多肽、脂质、核酸或者正常情况下在细胞中与所述肽关联或在文库或粗制品中与所述肽关联的其他细胞材料。所公开的肽可具有任意合适的长度。例如，所公开的肽可具有小于6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40个残基的相对较短长度。所公开的肽还可以以显著较长序列使用。因此，例如，所述肽可具有最多至50、100、150、200、250、300、400、500、1000或2000个残基的长度。在具体的实施方案中，肽可具有至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或200个残基的长度。在又一些实施方案中，肽可具有5-200个残基，5-100个残基，5_90个残基，5-80个残基，5-70个残基，5-60个残基，5-50个残基，5-40个残基，5-30个残基，5-20个残基，5-15个残基，5-10个残基，10-200个残基，10-100个残基，10-90个残基，10-80个残基，10-70个残基，10-60个残基，10-50个残基，10-40个残基，10-30个残基，10-20个残基，20-200个残基，20-100个残基，20-90个残基，20-80个残基，20-70个残基，20-60个残基，20-50个残基，20-40个残基或20-30个残基的长度。本文使用的术语“残基”是指氨基酸或氨基酸类似物。i.肽变体本文提及具体氨基酸序列时使用的“保守变体”是这样一个序列，即该序列中第一氨基酸被具有至少一种生物化学特性类似于所述第一氨基酸的另一氨基酸或氨基酸类似物替换；类似特性包括例如相似大小、电荷、疏水性或氢键结合能力。例如，保守变体可以是这样一个序列，即该序列中第一不带电荷的极性氨基酸被第二(非相同)不带电荷的极性氨基酸如半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或它们的类似物保守置换。保守变体还可以是这样一个序列，即该序列中第一碱性氨基酸被第二碱性氨基酸如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、5-羟赖氨酸、N-甲基赖氨酸或它们的类似物保守置换。类似地，保守变体可以是这样一个序列，即该序列中第一巯水氨基酸被第二疏水氨基酸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或它们的类似物保守置换。同样，保守变体可以为其中第一酸性氨基酸被第二酸性氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸或它们的类似物保守置换的序列；其中芳族氨基酸如苯丙氨酸被第二芳族氨基酸或氨基酸类似物例如酪氨酸保守置换的序列；或者其中第一相对小的氨基酸如丙氨酸被第二相对小的氨基酸或氨基酸类似物如甘氨酸、缬氨酸或它们的类似物替换的序列。例如，当一个氨基酸残基被生物学和/或化学性质类似的另一氨基酸残基替换，就被本领域技术人员认为是保守置换。例如，保守置换可为将用一个疏水残基替换另一个，或者用一个极性残基替换另一个。置换包括例如下列组合例如Gly，Ala；Val,Ile,Leu；Asp,Glu；Asn,Gin；Ser,Thr；Lys,Arg；以及Phe，Tyr。每个明确公开的序列的这类保守置换变体包括在本文提供的嵌合体多肽中。当本说明书详述多种蛋白和蛋白序列的时候，应理解可编码这些蛋白序列的核酸也被公开。这应包括与具体蛋白序列相关的所有简并序列，即具有编码一种具体蛋白序列的序列的所有核酸，以及编码所述蛋白序列的所公开的变体和衍生物的所有核酸，包括简并核酸。因此，虽然每个具体的核酸序列可能未在本文中列出，但应理解每个或每一序列通17过所公开的蛋白序列而实际上在本文中被公开和被描述。应理解，有多种氨基酸和肽类似物可引入至所公开的组合物中。例如，有多种D氨基酸或者具有不同于上文详述氨基酸的功能取代基的氨基酸。公开了天然存在的肽的相反立体异构体，以及肽类似物的立体异构体。通过以下方式可容易地将这些氨基酸引入多肽链中使tRNA分子负载选定的氨基酸，构建使用例如琥珀密码子的遗传构建体，以将氨基酸类似物以位点特异的方式插入至肽链中(Thorsonetal.，MethodsinMolec.Biol.7743-73(1991),Zoller,CurrentOpinioninBiotechnology,3348-354(1992)；Ibba,Biotechnology&GeneticEnginerringReviewsl3197-216(1995),Cahilletal.,TIBS,14(10)400-403(1989)；Benner,TIBTech,12158-163(1994)；IbbaandHennecke,Bio/technology,12:678_682(1994)，至少就与氨基酸类似物有关的内容，将所有这些参考文献通过引用的方式纳入本文)。还公开了包含融合于异源蛋白的所公开肽的嵌合蛋白。在一个实施方案中，所述异源蛋白可具有治疗活性，例如细胞因子活性、细胞毒活性或促凋亡活性。在又一实施方案中，所述异源蛋白可以为抗体或其抗原结合片段。在另一些实施方案中，所述嵌合蛋白包含融合于异源蛋白的包含如下氨基酸序列的肽或者其保守变体或拟肽SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDNO:290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO:329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO:330)之一的氨基酸序列。在言及融合于所公开的肽的蛋白时本文使用的术语“异源的”是指蛋白的来源不同于编码所述肽的基因，或者所述拟肽来自的基因。所公开的嵌合蛋白可具有不同的长度，包括但不限于小于100个残基的长度，小于200个残基的长度，小于300个残基的长度，小于400个残基的长度，小于500个残基的长度，小于800个残基的长度或小于1000个残基的长度。本文使用的“嵌合体”和“嵌合的”是指任何来自两种或更多种来源的序列的结合物。例如，这包括少则单个亚基部分(例如核苷酸、氨基酸)多则整个来源序列添加、插入以及/或者置换至其他序列中。例如，嵌合体可以是加合型的，其中一条序列的一个或多个部分被添加至一条或多条其他序列的一个或多个部分中；置换型的，其中用一条序列的一个或多个部分替换一条或多条其他序列的一个或多个部分；或者它们的组合。“保守置换嵌合体”可用于指这样的置换嵌合体，即其中用于所述嵌合体的来源序列具有一些结构的和/或功能的关系，并且其中具有相似或类似结构和/或功能的序列的部分可相互置换。典型的嵌合的人源化抗体是保守置换嵌合体的实例。还公开了包含融合于具有不同功能的第二肽的归巢肽的双功能肽。这类双功能肽具有由所述全长分子的不同部分赋予的至少两种功能，并且除显示选择性归巢活性外还可例如显示抗血管形成活性或促凋亡活性。还公开了分离的多价肽，所述多价肽包含至少两个各自独立包含归巢分子(例如，SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO:329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO:330)之一的氨基酸序列或者其保守变体或拟肽)的子序列。所述多价肽例如可包含至少3个，至少5个或至少10个这类各自独立包含归巢分子(例如，SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列或者其保守变体或拟肽)的子序列。在具体的实施方案中，所述多价肽可具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个相同或不同的子序列。在又一实施方案中，所述多价肽可包含由归巢分子(例如，SEQIDNO1、SEQIDN0:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO:330)之一的氨基酸序列或者其保守变体或拟肽)组成的相同子序列。在又一实施方案中，所述多价肽可包含连续的相同或不同子序列，所述子序列未由任何插入氨基酸分隔。在再一实施方案中，所述多价肽可以是环状的或者构象受限的。在一个实例中，所述肽可经二硫键成环或环化。根据需要，分离肽或在本文别处进一步详述的归巢分子可以是环状的或者构象受限的。本文使用的“构象受限的”分子(例如肽)中的三维结构随时间基本保持一种空间排布。构象受限的分子可具有改良的性质，例如，增加的亲和性、代谢稳定性、膜通透性或可溶性。构象限制的方法为本领域熟知并且包括本文他处进一步详述的环化。本文中在言及肽时使用的术语“环状的”是指在两个不相邻氨基酸或氨基酸类似物之间包括分子内键的结构。环化可通过共价键或非共价键实现。分子内键包括，但不限于主链与主链的键、侧链与主链的键以及侧链与侧链的键。优选的环化方法是通过在非相邻氨基酸或氨基酸类似物的侧链之间形成二硫键来环化。例如，能够形成二硫键的残基包括半胱氨酸(Cys)、青霉胺(Pen)、0，0-环戊烷半胱氨酸(Pmc)、0，0-环戊烷-0-巯基丙酸(Pmp)及其功能等价物。肽还可以例如经内酰胺键成环，内酰胺键可利用一个氨基酸或其类似物的侧链基团形成与氨基末端残基的N端胺的共价连接。能够形成内酰胺键的残基包括天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、a,0-二氨基丙酸、氨基己二酸(Adp)和M-(氨甲基)苯甲酸(Mamb)。环化另外可例如通过以下方式实现在赖氨酸(Lys)和亮氨酸(Leu)之间形成赖氨酸正亮氨酸键或者在两个酪氨酸(Tyr)残基之间形成二酪氨酸键。本领域技术人员可理解，这些键和其他键可包括在环状肽中。B.缀合物公开了包含一个部分和一个归巢分子(如本文中公开的肽)的缀合物。例如，公开了包含这样一种治疗剂的缀合物，即该治疗剂连接于选择性归巢于进行血管发生的组织的归巢分子。所公开的缀合物可包含例如下述的一个部分，所述部分连接于包含这样一个氨基酸片段的肽，即该氨基酸片段包含例如SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO:330)之一的氨基酸序列。本文公开的任何形式或类型的归巢分子可用于所公开的缀合物中。所述部分可以是任意分子。所述部分优选为可用于靶向所述归巢分子的靶标的分子。例如，可影响所述靶的部分，例如具有治疗作用的部分；或者有利于所述靶的检测、显现或成像的部分，例如荧光分子或放射性核素。所公开的归巢于进行血管发生的组织的肽例如可有利地与例如如下所述的部分结合，即所述部分例如可促进伤口愈合、治疗炎症或疼痛或者治疗癌症。多种治疗剂可用于所述缀合物中，包括但不限于如下这样的部分，即该部分为抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化学治疗剂、细胞毒剂、抗炎剂、抗关节炎剂、多肽、核酸分子、小分子、荧光团、荧光素、罗丹明、放射性核素、铟-111、锝-99、碳-11、碳-13或它们的结合物。例如，包含多个归巢分子的缀合物可包括不少于2个，不少于3个，不少于5个，不少于10个，不少于20个，不少于30个，不少于40个，不少于50个，不少于100个，不少于200个，不少于300个，不少于400个，不少于500个或不少于1000个归巢分子。在一个实施方案中，所述缀合物包含都具有相同氨基酸序列的归巢分子。在另一实施方案中，所述缀合物包含具有两个或更多个不同氨基酸序列的归巢分子。例如，可以分别或者同时使用SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO:329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO:330)之一的氨基酸序列。含多个归巢分子的缀合物中可用的部分非限制性地包括噬菌体、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和其他病毒、细胞、脂质体、聚合物基质、非聚合物基质、颗粒如金颗粒、微装置、纳米装置和纳米级半导体材料。例如，缀合物可包含连接于至少2个归巢分子的脂质体或其他聚合物基质。根据需要，所述脂质体或其他聚合物基质可连接于至少10个，至少100个或至少1000个归巢分子。脂质体可用于这类缀合物中；由磷脂或其他脂质组成的脂质体是制备和给药相对简单的生理上可接受且可代谢的无毒载体(Gregoriadis，LiposomeTechnology,Vol.1(CRCPress,BocaRaton,Fla.(1984))。脂质体和其他聚合物基质任选可包含另一组分，例如但不限于治疗剂、癌症化学治疗剂、细胞毒剂、抗血管生成剂、多肽或核酸分子。所公开的缀合物的组分可以以任何合适的方式结合、连接和/或偶联。例如，所述部分和归巢分子可以共价地或非共价地，直接地或间接地，或者有或无接头部分的情况下连接。C.部分公开了将部分定向至靶的组合物和方法。本文使用的术语“部分”广义上是指通常将生物有用的功能赋予连接的分子的物理材料、化学材料或生物材料。部分可以是任何天然的或非天然的材料，包括但不限于生物材料，例如细胞、噬菌体或其他病毒；有机化学物，例如小分子；放射性核素；核酸分子或寡核苷酸；多肽；或者肽。可用的部分包括但不限于抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化学治疗剂、细胞毒剂、抗炎剂、抗关节炎剂、多肽、核酸分子、小分子、荧光团、荧光素、罗丹明、放射性核素、铟-111、锝-99、碳-11、碳-13或它们的结合物。可用的部分还非限制性地包括噬菌体和其他病毒、细胞、脂质体、聚合物基质、非聚合物基质或颗粒如金颗粒、微装置、纳米装置和纳米级半导体材料。本领域中已知的这些部分或其他部分可以为缀合物的组分。1.治疗剂引入至缀合物中的部分可以是治疗剂。本文使用的术语“治疗剂”是指在正常或病理组织中有一种或多种生物活性的分子。多种治疗剂可包含在缀合物中。本文中公开的缀合物可用于归巢于伤口或组织损伤。可用于该目的的部分可包括属于数个基本类别的分子，所述基本类别包括阻止炎症的抗炎剂、阻止组织生长的防治再狭窄的药物、抑制或控制血栓形成的抗血栓形成药或者溶血栓药，以及调节组织生长并增强组织愈合的生物活性剂。所述缀合物还可包含癌症化学治疗剂。本文使用的“癌症化学治疗剂”为抑制癌细胞的增殖、生长、生存期或转移活性的化学剂。这类癌症化学治疗剂可为如下物质但不限于此紫杉烷如多西他赛(docetaxel)；蒽环类药物如多柔比星；烷化剂；长春花生物碱；抗代谢药；钼剂如顺钼或卡钼；类固醇如甲氨蝶呤；抗生素如阿霉素；异环磷酰胺；或者，选择性雌激素受体调节剂；抗体如曲妥珠单抗。用于缀合物中的治疗剂可为抗体，例如人源化的单克隆抗体。例如，抗表皮生长因子受体2(HER2)抗体、曲妥珠单抗(赫赛汀；Genentech，SouthSanFrancisco,Calif.)是可在缀合物中用于治疗HER2/neu过表达乳腺癌的治疗剂(Whiteetal.,Annu.Rev.Med.52:125-141(2001))。有用的治疗剂还可为细胞毒剂，本文中使用的细胞毒剂可以为任何直接或间接促进细胞死亡的分子。有用的细胞毒剂包括但不限于小分子、多肽、肽、拟肽、核酸分子、细胞和病毒。作为非限制的实例，有用的细胞毒剂包括细胞毒小分子如多柔比星、多西他赛或曲妥珠单抗；抗微生物肽，例如下文进一步描述的那些；促凋亡多肽例如胱天蛋白酶类(caspase)和毒素，例如caspase-8；白喉毒素A链、假单胞菌外毒素A、霍乱毒素、配体融合毒素例如DAB389EGF、蓖麻毒素(蓖麻毒蛋白)；以及，细胞毒细胞例如细胞毒T细胞。参见，例如Martinetal.，CancerRes.60:3218_3224(2000)；KreitmanandPastan,Blood90:252-259(1997)；Allametal.，CancerRes.57:2615_2618(1997)；禾口OsborneandCoronado-Heinsohn,CancerJ.Sci.Am.2:175(1996)。本领域技术人员可理解，本文描述的或本领域中已知的这些或其他细胞毒剂可用于所公开的缀合物和方法中。在一个实施方案中，治疗剂可以为治疗性多肽。本文使用的治疗性多肽可以是任何具有生物有用功能的多肽。可用的治疗性多肽包括但不限于细胞因子、抗体、细胞毒多肽；促凋亡多肽；以及，抗血管形成多肽。用于缀合物中的治疗剂还可以是抗血管生成剂。本文使用的术语“抗血管生成剂”是指减少或防止血管发生的分子，血管发生是血管的生长发育。所述缀合物可用于治疗或诊断任何与血管发生相关的疾病、病症或障碍。例如，黄斑变性和糖尿病血管并发症可被诊断以及/或者被治疗。多种抗血管生成剂可通过常规方法制备。这类抗血管生成剂包括但不限于小分子；蛋白，例如负显性形式的血管发生因子、转录因子和抗体；肽；以及核酸分子，包括核酶、反义寡核苷酸和编码例如负显性形式的血管发生因子和受体、转录因子和抗体及其抗原结合片段的核酸分子。参见，例如HagedornandBikfalvi,Crit.Rev.Oncol.Hematol.3489-110(2000)和Kirschetal.，J.Neurooncol.50149-163(2000)。2.可检测试剂所公开的缀合物中的部分还可以为可检测试剂。多种可检测试剂可用于所公开的方法中。本文中使用的术语“可检测试剂”是指任何可被检测的分子。有用的可检测试剂包括可被体内给予并且随后被检测的部分。用于所公开的缀合物和成像方法中的可检测试剂包括但不限于放射标记物和荧光分子。例如，所述可检测试剂可以为任何有利于直接或间接检测的部分，所述检测优选通过非侵入和/或体内可视化技术。在优选的实施方案中，所述可检测试剂与所述归巢分子的偶联方式不干扰所述归巢分子归巢于靶的能力。在一些实施方案中，所述可检测试剂可以以化学方式键合于所述归巢分子。在一些实施方案中，所述可检测试剂可以以化学方式键合于本身就化学键合于所述归巢分子的部分，由此间接地连接了成像部分和靶向部分。D.药物组合物和载体所公开的缀合物可以在可药用的载体中进行体内给药。“可药用的”是指一种材料不是生物学上或其他方面不利的，即所述材料可以与核酸或载体一起给予受试者，而不引21起任何不利的生物作用，或者不会与所述药物组合物中包含的任何其他成分以有害的方式相互作用。如本领域技术人员熟知的，可容易地选择所述载体以使所述活性成分的任何降解最小并且使所述受试者中的任何副作用最小。所述材料可以在溶液、悬液中(例如，引入至微粒、脂质体或细胞中)。方法本文公开了使用所公开的归巢分子如所公开的肽的方法。例如，公开了将一个部分定向至进行血管发生的组织的方法，包括向受试者给予本文公开的缀合物。如上所述，所述组织可以在肿瘤部位或伤口部位，所述伤口例如由损伤或手术引起。本文公开的缀合物可用于患有肿瘤的受试者，这是因为肿瘤与血管发生有关。公开了一种将部分定向至肿瘤的方法，包括向所述受试者给予任何本文公开的缀合物。例如，所述缀合物可具有治疗作用。所述受试者可具有一个或多个待靶向的部位，其中所述部分被定向至一个或多个待靶向的部位。例如，所述受试者可具有可以以本文公开的部分治疗的多个伤口或损伤。所述受试者还可患有癌症，并且所述部分可定向至所述受试者中的肿瘤血管发生处。在该情况下，所述缀合物对所述癌症可具有治疗作用。例如，所述肿瘤的大小可减小，或者所述肿瘤的生长可减少、停止或逆转。所述部分还可用于检测癌症以及/或者显现一种或多种肿瘤。所公开的组合物可用于治疗任何出现不受控制的细胞增殖的疾病，例如癌症。不同类型的癌症的非限制性列表可如下淋巴瘤(何杰金氏型和非何杰金氏型)、白血病、癌、实体组织癌、鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤、胶质瘤、高级胶质瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、黑色素瘤、腺瘤、缺氧肿瘤、骨髓瘤、AIDS相关淋巴瘤或肉瘤、转移性癌或普通癌症。可用所公开组合物治疗的癌症的代表性但非限制性列表如下淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；T细胞淋巴瘤；蕈样肉芽肿；何杰金氏病；髓样白血病；膀胱癌；脑癌；神经系统癌；头颈癌；头颈部鳞状细胞癌；肾癌；肺癌如小细胞肺癌和非小细胞肺癌；神经母细胞瘤/胶质母细胞瘤；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；皮肤癌；肝癌；黑色素瘤；口、咽、喉和肺的鳞状细胞癌；结肠癌；宫颈癌症；宫颈癌；乳腺癌；上皮癌；肾癌；泌尿生殖癌；肺癌；食管癌；头颈癌；大肠癌；造血癌症；睾丸癌；结肠直肠癌；前列腺癌；或者胰腺癌。具体用作所公开的组合物和方法的靶的癌症和肿瘤是表达一种或多种av整联蛋白和/或神经毡蛋白-1的癌症和肿瘤。例如，所述癌症和肿瘤可以表达一种或多种整联蛋白，或者所述癌症和肿瘤可以表达一种或多种av整联蛋白和神经毡蛋白-1。表达高于正常水平的神经毡蛋白-1的癌症和肿瘤是特别可用的靶。以下情况也足以满足上述目的肿瘤中或肿瘤附近的一些细胞表达一种或多种整联蛋白，并且肿瘤中的一些细胞表达神经毡蛋白-1。本文使用的基因或蛋白的正常表达水平是正常组织或细胞中的表达水平。可以使用任何合适的对照组织或细胞。例如，在癌细胞和肿瘤的情况下，非癌组织或非肿瘤组织中的水平可用于确定什么是正常表达水平。使用与所述癌症或肿瘤的来源类型相同的正常细胞或组织可能是有用的。公开了一种将一个部分定向至肿瘤的方法，包括确定受试者中的肿瘤是否表达一种或多种av整联蛋白和/或神经毡蛋白-1，以及，如果所述肿瘤表达一种或多种av整联蛋白和/或神经毡蛋白-1，则向所述受试者给予本文公开的任意缀合物。例如，所述肿瘤可以表达一种或多种av整联蛋白，或者所述肿瘤可以表达一种或多种av整联蛋白和神经毡蛋白-1。还公开了一种将一个部分定向至肿瘤的方法，包括确定受试者中的肿瘤是否以高于正常的水平表达神经毡蛋白-1，以及，如果所述肿瘤以高于正常的水平表达神经毡蛋白-1，则向所述受试者给予本文公开的任意缀合物。公开了一种将一个部分定向至肿瘤的方法，包括向所述受试者给予所述缀合物，其中所述缀合物包含一个连接于一个分离肽的部分，所述分离肽包含这样一个氨基酸片段，即该氨基酸片段包含SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO:329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO:330)之一的氨基酸序列，或者具有一个或多个保守氨基酸置换的SEQIDN0:1、SEQIDNO2、SEQIDN0:3、SEQIDNO:290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDN0329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列。所述方法还可包括，确定受试者中的肿瘤是否表达一种或多种av整联蛋白和/或神经毡蛋白-1，以及，如果所述肿瘤表达一种或多种av整联蛋白和/或神经毡蛋白-1，则向所述受试者给予所述缀合物。例如，所述肿瘤可以表达一种或多种av整联蛋白，或者所述肿瘤可以表达一种或多种av整联蛋白和神经毡蛋白-1。所述方法还包括，确定受试者中的肿瘤是否以高于正常的水平表达神经毡蛋白-1，以及，如果所述肿瘤以高于正常的水平表达神经毡蛋白-1，则将所述缀合物给予所述受试者。所述肿瘤中的细胞可表达av整联蛋白。所述肿瘤中的细胞可表达av整联蛋白和神经毡蛋白-1。所述肿瘤中的细胞可以以高于正常的水平表达神经毡蛋白-1。例如，所述整联蛋白可以为a3整联蛋白、a5整联蛋白、a531整联蛋白或它们的结合物。公开了其中治疗作用包含炎症减少的方法。“炎症减少”是指与炎症未被治疗时相比炎症减少。炎症的减少程度可增加约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更高。，与未治疗的伤口相比，伤口愈合速度也可增加。伤口愈合速度可增加约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更高。与未治疗的损伤部位或伤口部位相比，瘢痕组织的量也可减少。瘢痕组织的量的减少可以为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%。与未进行疼痛治疗时感觉到的疼痛程度相比，需要减轻疼痛的受试者感觉到的疼痛程度也可减少。这种疼痛减少可以为减少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%。还可以有肿胀的减少。肿胀减少可以与未治疗的肿胀相比较，并且肿胀减少可以为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%。与未治疗的组织相比，组织坏死也可减少。这种坏死的减少可以为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%。本文公开的缀合物还可以用于患有关节炎或其他炎性疾病的受试者中，因为这类损害经常与血管发生相关联。所述缀合物可用于任何与血管发生相关的疾病、病症、障碍的治疗或诊断。例如，黄斑变性和糖尿病血管并发症可被诊断以及/或者被治疗。除非另外明确地指出，本文公开的组合物和实施所公开的方法所需的组合物可使用任何本领域技术人员已知用于该具体试剂或化合物的方法制备。一种生产所公开的蛋白例如SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO:330)之一的方法是，通过蛋白质化学技术将两个或多个肽或多肽连接在一块。例如，肽或多肽可使用Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)化学法利用现有的实验室设备进行化学合成。(AppliedBiosystems,Inc.，FosterCity,CA)。本领域技术人员易于了解，对应于所公开蛋白的肽或多肽例如可以通过标准的化学反应合成。例如，一种肽或多肽可以被合成并且不从其合成树脂上切割下，而一种肽或蛋白的另一片段可以被合成并且随后从所述树脂上切割下，从而暴露出在所述另一片段上被功能阻断的末端基团。通过肽缩合反应，此两个片段可经分别在它们的羧基端和氨基端的肽键共价地连接，以形成抗体或其片段。(GrantGA(1992)SyntheticPeptides:AUserGuide,ff.H.FreemanandCo.,N.Y.(1992)；BodanskyMandTrostB.,Ed.(1993)PrinciplesofPeptideSynthesis.Springer-VerlagInc.，NY，其至少关于肽合成的内容通过引证的方式纳入本文)。或者，可如本文所述独立地体内合成所述肽或多肽。一旦分离后，这些独立的肽或多肽可通过类似的肽缩合反应连接形成肽或其片段。例如，克隆的或合成的肽片段的酶连接使得相对短的肽片段可连接产生更长的肽片段、多肽或全蛋白结构域(AbrahmsenLetal.,Biochemistry,304151(1991))或者，合成肽的天然化学连接可用于从较短肽合成构建长肽或多肽。该方法由两个化学反应步骤组成(Dawsonetal.SynthesisofProteinsbyNativeChemicalLigation.Science，266:776-779(1994))0第一个步骤是未保护的合成肽-硫代酸酯与包含氨基端Cys残基的另一未保护的肽片段的化学选择反应，以得到连接硫代酸酯的中间体，作为初始的共价产物。不改变反应条件，将该中间体进行自发的快速分子内反应以在连接位点形成的天然肽键(BaggioliniMetal.(1992)FEBSLett.30797-101；Clark-LewisIetal.，J.Biol.Chem.,26916075(1994)；CIark-LewisIetal.，Biochemistry，30:3128(1991)；RajarathnamKetal.,Biochemistry33:6623_30(1994))。或者，将未保护的肽片段化学连接，其中由于化学连接而在所述肽片段之间形成的键为非天然(非肽)键(Schnolzer，Metal.Science,256:221(1992))。该技术已经被用于蛋白结构域的类似物，以及大量具有完全生物活性的相对纯的蛋白(deLisleMiltonRCetal.,TechniquesinProteinChemistryIV.AcademicPress,NewYork,pp.257-267(1992))。实施例下面给出的实施例为本领域普通技术人员提供了关于如何制得和评估本申请所要求保护的化合物、组合物、物品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且这些实施例是纯粹示例性的而不意在限制所公开的内容。已努力确保数字(如数量和温度等)的准确性，但是应允许有某些误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，温度以。c计或者为环境温度，压力为大气压或者接近大气压。1.实施例1受损组织血管中的分子变化i.通过噬菌体展示识别归巢肽为了识别归巢于肿瘤中血管的候选肽，筛选了T7噬菌体中的肽文库。在该筛选中观察到的文库的富集的一个实例显示于图1中。通过将T7噬菌体文库(多样性大约109)24与从多种人前列腺癌细胞的骨异种移植物制备的细胞悬液一起孵育进行离体筛选，将结合于所述细胞的噬菌体回收用于滴定，并扩增用于下一轮。在转入体内噬菌体展示之前将所述离体过禾呈重复3轮。如Hoffmanetal.,“Invivoandexvivoselectionsusingphage-displayedlibraries,"inClarksonandLowman(Eds.)PhageDisplay:APracticalApproachOxford,U.K.OxfordUniversityPress(2004)巾禾口体内噬菌体选择。在体内筛选阶段，将离体选择的噬菌体库静脉注射至携带人前列腺癌细胞的骨异种移植物的裸(免疫缺陷)小鼠中。10分钟后通过以PBS灌流心脏处死小鼠，并收集肿瘤和其他组织用于噬菌体滴定和回收。将来自肿瘤组织的噬菌体扩增并用于进行最后一次的离体噬菌体展示。这里，将所述噬菌体库与靶肿瘤的结合与它们与正常骨的结合相比较。从所述靶肿瘤和正常骨随机挑取有限数量的个体噬菌体克隆，并进行测序。个体噬菌体克隆的测序显示出在所选库中出现多次的肽序列(表1)。选择每个都包含一个RGD基序的3条序列用于进一步分析。所选的肽为环状肽CRGDKGPDC(称为iRGDl,SEQIDNO:1)、CRGDRGPDC(称为iRGD2,SEQIDNO2)和CRGDKGPEC(称为iRGD3,SEQIDN03)。ii.iR⑶肽的肿瘤归巢在噬菌体展示中识别的iRGD序列的肿瘤归巢通过研究iRGDl肽归巢至肿瘤的能力进行确认。将大约200yg的荧胺标记的iRGDl肽(FAM-iRGDl)通过尾静脉注入至携带PPC1人前列腺癌、MIAPaCa-2人胰腺癌或MDA_MB_435人乳腺癌的异种移植物的免疫缺陷小鼠中，并使之循环4.5小时(图2)。在UV线下检查采获的器官表明，iRGD注射的小鼠的肿瘤是强荧光的，而正常组织不是。当FAM-iRGDl注入至携带自发性胰管腺癌(PDAC)肿瘤(BardeesyandDePinho,2002)的转基因小鼠时得到类似的结果(图3A)。共注射过量的未标记iRGDl肽抑制了FAM-iRGDl在所述PDAC肿瘤中的积聚，这证明了iRGDl归巢的特异性(图3B)。来自以FAM-iRGDl注射的动物的PDAC肿瘤切片的共聚焦显微镜表明了该肽具有时间依赖的体内归巢动力学。该肽最初积聚于肿瘤血管中(图4A，箭头)，然后在血管周围的细胞中(图4A，箭头)，并且在30分钟后转移至肿瘤腺中的肿瘤细胞(图4B)。此时在血管中仅观察到微量荧光(图4B，箭头)，并且在后来的研究时间点未观察到血管荧光(图4C和D)。与所述肿瘤细胞相关联的肽荧光积聚于肿瘤细胞的核周区域(图4C和4D，星号)。这些观察结果表明，iR⑶可靶向肿瘤血管和肿瘤细胞，并且它积聚于肿瘤细胞内。iii.iR⑶的肿瘤细胞内化iRGD肽内化至肿瘤细胞中的观点通过共聚焦显微镜得到确认。当在37°C下将多种类型的肿瘤细胞与FAM-iRGDl孵育2小时时，肽荧光在所述细胞内积聚(图5)。另外，iR⑶噬菌体也逐渐内化至肿瘤细胞中，并且该内化比展示其他R⑶肽如RGD-4C(CDCRGDCFC，SEQIDN010)或CG7C对照肽的噬菌体的内化作用广泛得多(图6)。因此，iRGD可导致简单化合物(荧光素)以及纳米颗粒(T7噬菌体是直径约50nm的纳米颗粒)的内化。iRGD的一些变体例如CRGDKGPDC、CRGDRGPDC或CRGDKGPEC(分别为SEQIDNO:1、2和3)显示出与CRGDKGPDC(图7，SEQIDNO1)相似的肿瘤细胞结合和内化，表明关键的iRGD基序存在于5个氨基酸RGDK/RG中。为了识别iRGD中的基序，进行了两项实验。第一，进行了iRGD的丙氨酸扫描。将R、G、D、K或G这5个残基的任一个突变成丙氨酸消除了或大大减少了所述iRGD噬菌体的内化(图8)。第二，构建展示CRGDKG、CRGDK、CRGD或CRG(SEQIDNO5-8)的噬菌体，并测试它们结合并内化至肿瘤细胞的能力(图9)。CRGDKG和CRGDK(SEQIDNO:5和6)噬菌体都结合并内化至肿瘤细胞中，而CRGD和CRG不是。总之，这些结果表明iRGD的关键基序由RGDK/R(SEQIDNO11和12)组成。iv.iRGD的受体iRGD噬菌体与PPC1人前列腺癌细胞的结合以及它在该癌细胞中的内化被UV失活的iRGD噬菌体以剂量依赖的方式显著地抑制，但不被UV失活的表达CG7C对照肽或KGG(CKGDKGPDC，SEQIDNO1)肽的噬菌体抑制，表明受体介导的机制参与iRGD与肿瘤细胞的结合以及在肿瘤细胞中的内化(图10)。R⑶基序是一种整联蛋白识别序列，并且R⑶定向的整联蛋白例如aV33、aV35和a501已知在血管生成内皮细胞和一些肿瘤细胞中是上调的(ElicieriandCheresh，2001；RuOslahti，2002)。因此，测试了抗R⑶定向的整联蛋白的抗体对iR⑶的肿瘤细胞结合和内化的影响。如图11中所示，抗aV35整联蛋白的抗体消除了iRGD噬菌体和肽对PPC1前列腺癌细胞的结合，以及随后这些细胞对所述噬菌体的内化。相反，抗体对iRGD内化仅有轻微的影响。因此，一种或多种av整联蛋白可作为iRGD的一个受体。然而，考虑到iRGD显著的内化效应，以及其他整联蛋白抗体如a2抗体和a501抗体显示出对iRGD内化的一些抑制效应这个事实，av整联蛋白结合不大可能完全解释iRGD在肿瘤归巢中的独特能力。iRGD序列包含弗林蛋白酶类的一致切割位点(RXXK/R;SEQIDNO13和14;Thomas，2002)。弗林蛋白酶是一大蛋白水解酶家族，其成员经常以细胞类型特异性方式表达。本发明人猜测，在iRGD结合于肿瘤中的整联蛋白后，选择性切割RGDK/R(SEQIDN011和12)序列的蛋白水解切割以某种机制促进肽的内化及其有效载荷。所述内化又导致iRGD在靶细胞中的积聚，从而iRGD可特别有效地用作一种归巢肽。表1示出来自于在人前列腺癌的骨异种移植物上进行的体内噬菌体展示(在图1中以星号标记)和第4轮离体噬菌体展示(在图1中以双星标记)的测序结果。无下划线的小写字母序列是骨肿瘤和正常骨共有的，其被删除。双下划线的大写字母序列显示iRGD及其变体，无下划线的大写字母序列具有与iRGD有关的基序。注意在独立筛选中出现的携带噬菌体的iR⑶的数目。4个或更多个氨基酸的氨基酸序列从左至右、从上至下为SEQIDNO15-289。表12权利要求一种包含一个氨基酸片段的分离肽，所述氨基酸片段包含SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列，或者具有一个或多个保守氨基酸置换的SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列。2.权利要求1的分离肽，其中所述氨基酸片段包含SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO290、氨基酸序列CRGDR/K/HGVD/E/HC(SEQIDNO329)之一或氨基酸序列CRGDHGPD/E/HC(SEQIDNO330)之一的氨基酸序列。3.权利要求1的分离肽，其中所述肽的长度小于100个残基。4.权利要求1的分离肽，其中所述肽的长度小于50个残基。5.权利要求1的分离肽，其中所述肽的长度小于20个残基。6.权利要求1的分离肽，其中所述氨基酸片段是环状的。7.权利要求6的分离肽，其中所述氨基酸片段是经二硫键环化的。8.权利要求1的分离肽，其中所述肽选择性地归巢于血管发生部位。9.权利要求8的分离肽，其中所述血管发生在损伤部位。10.权利要求8的分离肽，其中所述血管发生在手术部位。11.权利要求1的分离肽，其中所述肽选择性地归巢于肿瘤。12.权利要求1的分离肽，其中所述肽选择性地归巢于关节炎部位。13.权利要求1的分离肽，其中所述肽选择性地归巢于表达一种或多种αν整联蛋白的细胞或组织。14.权利要求1的分离肽，其中所述肽选择性地归巢于表达一种或多种αν整联蛋白和神经毡蛋白-ι的细胞或组织。15.权利要求1的分离肽，其中所述肽由所述氨基酸片段组成。16.一种缀合物，其中所述缀合物包含权利要求1-15任一项的肽的一个部分。17.权利要求16的缀合物，其中所述部分为抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化学治疗剂、细胞毒剂、抗炎剂、抗关节炎剂、纳米颗粒、多肽、核酸分子、小分子、荧光团、荧光素、罗丹明、放射性核素、铟-111、锝-99、碳-11、碳-13或它们的结合物。18.权利要求17的缀合物，其中所述部分为治疗剂。19.权利要求18的缀合物，其中所述治疗剂为核心蛋白聚糖。20.权利要求17的缀合物，其中所述部分为可检测试剂。21.权利要求17的缀合物，其中所述缀合物包含病毒。22.权利要求21的缀合物，其中所述缀合物包含噬菌体。23.—种将一个部分定向至血管发生处的方法，包括向所述受试者给予权利要求17-22任一项的缀合物。24.权利要求23的方法，其中所述部分用于治疗癌症、糖尿病失明、年龄相关性黄斑变性、类风湿关节炎或银屑病，或者用于促进伤口愈合。25.权利要求23的方法，其中所述缀合物具有治疗效应。26.权利要求25的方法，其中所述治疗效应包括减少炎症、加快伤口愈合速度、减少瘢痕组织的量、减少疼痛、减少肿胀或减少坏死。27.权利要求23的方法，其中所述受试者具有一个或多个待靶向的部位，其中所述部分被定向至所述一个或多个待靶向的部位。28.权利要求24的方法，其中所述受试者患有癌症，其中所述部分被定向至所述受试者的肿瘤血管发生处。29.权利要求28的方法，其中所述缀合物对所述癌症具有治疗效应。30.权利要求28的方法，其中肿瘤大小被减小。31.权利要求28的方法，其中所述肿瘤生长被减少、终止或逆转。32.权利要求28的方法，其中所述部分用于检测癌症以及/或者使一种或多种肿瘤显现。33.一种将一个部分定向至肿瘤的方法，包括向所述受试者给予权利要求17-22任一项的缀合物。34.权利要求33的方法，其中所述肿瘤中的细胞表达αν整联蛋白。35.权利要求34的方法，其中所述肿瘤中的细胞表达神经毡蛋白-1。36.权利要求34的方法，其中所述肿瘤中的细胞表达神经毡蛋白_2。37.权利要求34的方法，其中所述肿瘤中的细胞表达神经毡蛋白-1和/或神经毡蛋白_2。38.权利要求33的方法，其中所述肿瘤中的细胞表达αν整联蛋白和神经毡蛋白-1。39.权利要求35-38任一项的方法，其中所述肿瘤中的细胞以高于正常的水平表达神经毡蛋白-1。40.权利要求33-39任一项的方法，还包括确定所述受试者中的肿瘤是否表达一种或多种αν整联蛋白，以及，如果所述肿瘤表达一种或多种αν整联蛋白，则将所述缀合物给予所述受试者。41.权利要求40的方法，还包括确定所述受试者中的肿瘤是否以高于正常的水平表达神经毡蛋白-1，以及，如果所述肿瘤以高于正常的水平表达神经毡蛋白-1，则将所述缀合物给予所述受试者。全文摘要公开了用于靶向进行血管发生的组织或者表达αv整联蛋白的细胞或组织的组合物和方法。所述组合物和方法是基于这样的肽序列，即该肽序列选择性结合于以及归巢于动物中进行血管发生的组织或者表达αv整联蛋白的细胞或组织。所公开的靶向可用于将治疗剂和可检测试剂送递至进行血管发生的组织或者表达αv整联蛋白的细胞或组织。文档编号C07K7/50GK101951938SQ200980102487公开日2011年1月19日申请日期2009年1月16日优先权日2008年1月18日发明者E·罗斯拉赫蒂,T·特萨鲁,菅原一树申请人:伯纳姆医学研究所