一种由功能肽r11修饰的基因载体及其制备方法和应用
【专利说明】一种由功能肽R11修饰的基因载体及其制备方法和应用 【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因载体技术领域，具体地说，是一种由功能肽Rll修饰的基因载体 及其制备方法和应用。 【【背景技术】】
[0002] 基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞 以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学技术。基因治疗过 程中，外源性DNA首先在载体的保护下到达靶细胞，避免或减少被核酸酶降解；与靶细胞结 合后，通过内吞或胞饮作用进入细胞内体，并从细胞内体中释放进入细胞质；当DNA转运进 入细胞核内，经转录、翻译，最终在细胞质中表达得到相应的蛋白质后，才能真正的发挥治 疗作用。基因治疗的关键之一在于开发安全、高效的基因载体。
[0003] 聚乙稀亚胺（polyethylenimine，PEI)是近年来研宄最为广泛的阳离子多聚物非 病毒基因载体，富含阳离子，具有强大的缓冲能力，有较强结合DNA和黏附细胞的能力。然 而，由于聚乙烯亚胺是利用自身所带的正电荷，与细胞表面带负电荷的受体通过静电作用 相结合，所以细胞的选择特异性差。解决靶向性问题已成为非病毒载体中最为关注的问题。 因此，如何将PEI改造成靶向性强、转染效率高的基因载体材料是解决PEI应用难题的突破
[0004] 普朗尼克P123 (Pluronic P123)是一种由中部疏水的聚氧丙烯链侧面连接两段亲 水聚氧乙烯（EO)构成的非离子式三嵌段共聚物。该物质无毒、无刺激、无免疫原性，可通过 化学交联的方法连接PEI，尤其低分子量PEI (如PEI600/800/2000kDa)，以形成多分枝状或 网状结构的高分子量PEI衍生物，该衍生物可保证较高转染效率，转染进入体内细胞后，这 些交联的化学键又可以通过水解等反应断开，高分子量PEI衍生物断裂成易代谢的低分子 量低毒性的PEI，这就使得其在保证一定转染效率的前提下，大大降低了高分子PEI所带来 的细胞毒性；另一方面，P123的亲水亲油平衡值适中，同时具有亲水性的聚氧乙烯（EO)链 和疏水性的聚环氧乙烷（PO)链，它在水中可自发形成稳定的多分子球形胶束样结构，该胶 束尺寸可达纳米级，因此适宜基因药物在体内的传输。
[0005] 整合素在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用，有研宄表明，在肿瘤诱导的新生血管 中表达丰富的整合素 ανβ 3对肿瘤血管的生成起重要作用。利用整合素 ανβ 3在人肿 瘤细胞和肿瘤新生血管高表达的特点，可将其作为基因治疗的靶点，针对整合素亚基设计 一段特异的反义寡核苷酸，并通过转基因载体将其转染入肿瘤细胞中，从而调节整合素 ανβ 3介导的生物学作用。
[0006] RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp)的短肽，广泛存在于 生物体内，是整合素和其配体相互作用的识别位点，能以一定的亲和力结合整合素 α V β 3， 成为肿瘤治疗新的靶向策略，RGD肽在肿瘤治疗中的应用已成为研宄热点。
[0007] 核定位信号（nuclear localization signal，NLS)是一种存在于细胞内许多蛋白 质中、并介导蛋白质由细胞质向细胞核内转运的氨基酸序列。NLS是核内功能蛋白进入细胞 核的结构基础，是介导某些蛋白进入细胞核的一段充分而必要的信息片段；大分子物质可 通过NLS的介导经核孔复合物主动运转至细胞核内，其中研宄最多的NLS是来自SV40的T 抗原，其主要功能序列为 Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val (PKKKRKV) 〇
[0008] 因此，理论上可将R⑶短肽与核定位信号肽NLS(PKKKRKV)连接，合成具有靶向于 α V β 3和提高核递送能力的含RGD和NLS (PKKKRKV)双功能多肽，用于修饰PEI衍生物，提 高其肿瘤细胞选择性，又可促进载体穿膜，从而增加 DNA的转染效率。
[0009] 发明人还提交过专利申请CN201110372844. 5,公开日2012. 04. 04,该专利是将普 郎尼克Ρ123连接ΡΕΙ，得到多分枝状或网络状结构的高分子量PEI衍生物Ρ123-ΡΕΙ，选 择特异亲和整合素 α νβ 3的RGD短肽，与细胞穿膜肽Tat (49-57)连接，合成具有靶向于 α V β 3和促进载体穿膜的双功能肽，再利用交联技术将R13与PEI衍生物偶联，构建新型非 病毒基因载体系统，并检验了该系统的细胞毒性和体外转染效率。
[0010] 然而，上述非病毒基因载体系统虽然表现出细胞毒性明显降低、体外转染效率及 肿瘤靶向能力提高等一系列优点，但其转染效率仍然偏低，限制其进一步应用。因此提高基 因载体材料的转染率是解决PEI应用难题的突破口。 【
【发明内容】
】
[0011] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种双功能肽。
[0012] 本发明的再一的目的是，提供一种基因载体。
[0013] 本发明的另一的目的是，提供一种上述基因载体的制备方法。
[0014] 本发明的第四个目的是，提供一种复合物。
[0015] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0016] -种双功能肽，所述的双功能肽的氨基酸序列为：Arg-Gly-Asp-Pro-Lys-Lys-Lys -Arg-Lys-Val〇
[0017] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0018] -种基因载体，所述的基因载体由上述双功能肽和聚乙烯亚胺衍生物偶联而成， 所述的聚乙烯亚胺衍生物是普郎尼克修饰的聚乙烯亚胺即普郎尼克Ρ123-聚乙烯亚胺， 所述的普郎尼克与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-1:20,所述的聚乙烯亚胺的分子量范围为 600-70000Da〇
[0019] 所述的普郎尼克与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-1:10。
[0020] 所述的双功能肽与聚乙烯亚胺衍生物的摩尔比为2:1。
[0021] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0022] 如上任一所述的基因载体的制备方法，包括以下步骤：
[0023] (a)合成权利要求1所述的多肽；
[0024] (b)普郎尼克P123除水，加入两倍摩尔量的三光气，溶于无水甲苯和无水二氯甲 烷的混合液中，室温下