专利名称：HBx修饰的抗肝癌全细胞疫苗及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞免疫治疗技术领域，具体涉及乙肝病毒X蛋白(HBx)基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗。
背景技术：
全球每年新增肝癌患者62.6万，其死亡率排在恶性肿瘤死亡率的第三位；我国属肝癌高发区域，近年来其发病率呈逐年上升的趋势，我国肝癌发病率占全球的45%，居我国癌症发病率的第二位。肝癌恶性程度高，其患者自确诊后的平均6个月存活率不到50%，I年存活率为24%，5年存活率大约为10%。肝癌对放化疗不敏感，手术切除是肝癌首选的治疗方法，通过完整的清除肿瘤组织，达到治愈的目的。早期肝癌手术切除后一年生存率达80%以上，五年生存率达50%以上。但是中晚期肝癌的手术切除疗效除了与肿瘤大小和数目有关，还与肝脏功能、肝硬化程度、肿瘤部位、肿瘤界限、有无完整包膜、静脉癌栓和血管侵润及淋巴结转移等有非常密切的关系。从临床实践来看，包括进行术前化、放疗后能够施行完全肝癌切除手术患者比例不到肝癌总例数的10%。中晚期肝癌手术切术五年生存率依然很低。其他治疗方法包括射频消融、微波消融、高强度聚焦超声、动脉化疗栓塞、酒精注射、冷冻治疗、放疗、然而这些疗法不仅毒性严重，且通常也无明显疾病缓解或延长生存期效果。最近几年问世的索拉非尼等新型小分子靶向药物也仅只延长患者生存2 3个月，同时该药物价格较为昂贵，同时可能会伴有腹泻、皮疹、高血压、手足综合征等较严重不良反应，效果还需进一步评价。因此肝癌迄今尚还处于一种严重缺乏有效治疗药物的尴尬境地。近年来，随着分子生物学、免疫学和细胞生物学等学科的快速发展，以肿瘤免疫治疗、基因治疗为代表的肿瘤生物治疗有望成为继手术治疗、化疗和放疗后肝癌治疗的新手段。流行病学统计显示,慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染与肝癌的发生密切相关。HBV是嗜肝病毒家族的一员，其基因组为松散的部分双链环状DNA，编码四个开放阅读框。其中乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein, HBx)是由HBV基因组中最小的一个开放读码框编码，是一种多功能蛋白，广泛地参与病毒复制、转录调控、细胞转化、细胞凋亡和周期调控。临床研究表明，在80%HBV相关性肝癌组织中HBx表达呈阳性，而且HBx的长期表达在细胞的癌变转化中发挥着关键的作用。有研究证实，HBx序列上存在着能激活特异性CTL反应的抗原表位。因此，HBx作为免疫治疗有效的靶点，去激活特异性的CTL反应，加强机体的免疫来对抗肿瘤。利用HBx的多表位肽段构建的类病毒颗粒免疫小鼠，研究表明这种疫苗能够激发特异性的CTL对抗HBV相关性肝癌。用含HBx抗原的口服疫苗免疫小鼠，也能够激发强烈抗肿瘤免疫反应。之前的研究表明，腺病毒载体介导的HBx表达的DNA疫苗在动物体内激活CD8+T细胞介导的特异性的抗肿瘤免疫反应，能够有效的抑制肿瘤的生长。
由于肿瘤发病机理十分复杂，筛选到特异的肿瘤抗原极其困难，以肿瘤细胞为基础的全细胞疫苗的开发得以积极进行。肿瘤全细胞疫苗是将自身的肿瘤细胞或体外培养的异体同种的肿瘤细胞，经过物理因素(照射、高温)、化学因素(酶解)等灭活处理，改变或消除其致瘤性，保留其免疫原性，导入患者体内，诱导特异性的抗肿瘤免疫应答。虽然肿瘤细胞带有肿瘤的全部抗原，但是由于肿瘤细胞疫苗的免疫原性弱，难以引起较强的免疫反应。弗氏完全佐剂、卡介苗等免疫佐剂的使用极大地改善了这种情况。目前美国有多个肿瘤全细胞治疗性疫苗正处于各级临床试验阶段，FDA有望在近期完成对该类产品的审核批准。近年来，随着基因工程的进展，人们开始对肿瘤细胞进行基因修饰。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供能够治疗HBV相关性肝癌的新型基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗。本发明的技术方案是一种抗肝癌全细胞疫苗，该疫苗的活性成分包括经过肝癌抗原修饰的肝癌细胞，所述的肝癌抗原基因是HBx。进一步的，所述的肝癌细胞还有免疫调节基因与HBx共同修饰。其中，所述的免疫调节基因为人IL-2、人IL-12、人IL-15或人IFN-Y。其中，所述的肝癌细胞为体外传代的人肝癌细胞系。其中，所述的肝癌细胞为灭活的细胞。其中，所述的HBx编码基因具有Seq ID N0.1所示的核苷酸序列。其中，所述的人IL-12编码基因具有Seq ID N0.2所示的核苷酸序列。本发明还提供了上述的抗肝癌全细胞疫苗的制备方法，包括如下步骤:用表达HBx或HBx/免疫调节基因的真核表达 载体感染肝癌细胞，灭活，即得。其中，所述的灭活方式优选为辐照灭活。具体的，上述的抗肝癌全细胞疫苗的制备方法包括如下步骤:将肝癌细胞培养至密度达70 80%时，用表达HBx或同时表达人HBx和免疫调节基因的真核表达载体感染肝癌细胞，感染复数MOI为20 50，培养I 2天后收集收集细胞置于辐照仪中进行辐照灭活，离心收集细胞，细胞沉淀用细胞冻存液重悬，置于_80°C或液氮备用。其中，所述的真核表达载体为复制缺陷型重组腺病毒载体。本发明还提供了上述疫苗在制备治疗肝癌的药物中的用途。其中，所述的肝癌为HBV相关性肝癌。进一步的，所述的HBV相关性肝癌为HBx阳性的HBV相关性肝癌。本发明还提供了上述抗肝癌全细胞疫苗的制备方法在制备治疗HBV相关性肝癌药物中的用途。本发明还提供了上述抗肝癌全细胞疫苗的制备方法在在HBV相关性肝癌靶向细胞免疫治疗中的用途。本发明中，HBx基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗能靶向杀伤HBx阳性的肝癌细胞，表现出良好的抗肝癌效应。同时本发明首次将肝癌抗原HBx或联合人IL-12等具有免疫调节作用的细胞因子基因导入肝癌细胞制备成基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗，用于HBV相关性肝癌的靶向细胞免疫治疗。利用病毒感染或质粒转染等方法使肝癌细胞表达HBx，然后用X射线进行辐照灭活，作为治疗性肿瘤疫苗来治疗肝癌。辐照的表达HBx肿瘤细胞可明显诱导体内的抗肿瘤免疫反应，而未经基因修饰的肿瘤细胞疫苗在一定程度也能诱导免疫反应。本发明为HBV相关性肝癌的靶向细胞免疫治疗提供了新的选择，具有良好的应用前景。
图1.HBx修饰抗肝癌全细胞疫苗抗小鼠肝癌实验，小鼠肿瘤体积生长曲线；PBS代表空白对照组小鼠；Hepal-6代表未经任何修饰的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠；Hepal-6/AdNull代表感染了空病毒的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠；H epal-6/AdHBx代表感染了携带HBx基因的重组腺病毒的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠。图2.HBx修饰抗肝癌全细胞疫苗免疫小鼠脾T淋巴细胞亚群分析，为三次免疫治疗后分离淋巴细胞，并用荧光染料标记CD4、CD8，流式检测。PBS代表来源空白对照组小鼠的脾淋巴细胞；Hepal-6代表来源未经任何修饰的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞；Hepal-6/AdNull代表感染了空病毒的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞；Hepal-6/AdHBx代表感染了携带HBx基因的重组腺病毒的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞。横坐标代表⑶8阳性T淋巴细胞的数量；纵坐标代表⑶4阳性T淋巴细胞的数量。图3.HBx修饰抗肝癌全细胞疫苗免疫小鼠淋巴细胞增殖活性分析，分离后的淋巴细胞被CFSE标记后，和刺激物共同孵育5天，流式检测并用FlowJo7.6.1进行分析。PBS代表来源空白对照组小鼠的脾淋巴细胞；Hepal-6代表来源未经任何修饰的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞；Hepal-6/AdNull代表感染了空病毒的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞；Hepal-6/AdHBx代表感染了携带HBx基因的重组腺病毒的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞；横坐标代表CFSE荧光强度；纵坐标代表细胞的数量。图4.HBx修饰抗肝癌全细胞疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞的特异性杀伤率；PBS代表来源空白对照组小鼠的脾淋巴细胞；Hepal-6代表来源未经任何修饰的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞；Hepal-6/AdNull代表感染了空病毒的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞；Hepal-6/AdHBx代表感染了携带HBx基因的重组腺病毒的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞；横坐标代表效应细胞(脾淋巴细胞)和靶细胞(HBx阳性肿瘤细胞)的比列；纵坐标代表效应细胞的杀伤活力。图5.HBx和IL-12双基因修饰抗肝癌全细胞疫苗抗小鼠肝癌实验，小鼠肿瘤体积生长曲线；(A)第一次免疫治疗后6天(肿瘤接种14天)各组肿瘤体积；(B)第二次免疫治疗后5天(肿瘤接种20天)各组肿瘤体积。
具体实施方式
实施例一 HBx基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗的制备将H印al-6 (小鼠肝癌细胞，购自ATCC)接种于培养皿中，密度达70 80%处于对数生长期时，用携带HBx基因的非复制型重组腺病毒载体(结构及构建过程AdHBx的构建过程见参考文献I和参考文献2，其表达框的核苷酸序列如Seq ID N0.3所示)感染细胞，感染复数(MOI)为20，病毒感染2小时后，弃病毒，换新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养24小时，0.25%胰酶消化，离心收集细胞，无血清DMEM培养基洗涤3次，用适量细胞培养基重悬细胞沉淀，细胞密度调成I X IO7个/mL。将处理好的细胞置于辐照仪中进行辐照，剂量为50Gy，离心收集细胞，用细胞冻存液重悬，分装于细胞冻存管中置-80°C或液氮中备用。使用时按常规细胞复苏方法进行，离心洗涤后，无血清DMEM培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度为I X IO7个/mL。实施例二本发明HBx基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗的体内抗肿瘤实验将2.5 X IO6个H印al-6/HBx小鼠肝癌细胞接种于6 8周龄C57小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)右侧胁皮下，当肿瘤直径达3mm时，将小鼠随机分成4组，每组6只，在小鼠背部左侧进行I X IO6个细胞/只疫苗注射(记为第O天)，在第14天、21天各加强一次。免疫后用游标卡尺每隔两天测量瘤体长径(a)和宽径(b)，以(aXb2) X0.52计算瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。结果见图1。图1显示:各组小鼠肿瘤体积 存在显著差异(图1，P〈0.001)。接种34天后，Hepal-6/AdHBx疫苗治疗组只剩一只荷瘤小鼠,瘤体积为18.1mm3,其余五只小鼠肿瘤完全消退，对照组小鼠肿瘤体积没有明显的消退，而且存在继续生长的趋势。实施例三本发明HBx基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗的抗肿瘤机理1.T淋巴细胞分型实施例二中最后一次加强免疫后一周颈椎脱白法处死小鼠，无菌取脾，于200目金属筛网上研磨过滤，收集悬液，加红细胞裂解液裂解，PBS洗涤三次。每个样品取IO5个细胞加荧光染料标记的ant1-⑶4 (购自Biolegend，H129.19)、ant1-⑶8抗体(购自Biolegend, 53-6.7), 4°C标记 30min, PBS 洗漆三次,用流式细胞仪(购自 BD Biosciences,FACSVerse)检测。结果见图2。图2中为三次免疫治疗后分离淋巴细胞，并用荧光染料标记⑶4、⑶8，流式检测。结果显示:!fepal-6/AdHBx疫苗组⑶+4、⑶+8淋巴细胞都明显增多，分别为41.7%和24.9%，显著高于其他三组(图2，P〈0.05和P〈0.01)。这表明⑶+4、⑶+8T淋巴细胞都参与了抗肿瘤免疫活动。2.细胞增殖活性检测为了验证免疫小鼠的T细胞的增殖能力，实施例二中最后一次加强免疫(第一次疫苗注射后第21天)一周分离脾淋巴细胞，0.5 μ M的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)(购自Life Technology，C34557)在37°C孵育10分钟。加入等体积胎牛血清(FCS)终止反应，400 X g离心5min，洗涤三次去除游离的CFSE。用含10%FCS的RPMI培养基重悬，调整浓度为2X105/mL。按100: I的比例加入刺激物(辐照处理的H印al-6/HBx细胞)在24孔板中37°C培养5天。收集细胞,流式检测。在flowjo软件版本7.6.1 (treestar)上对结果进行分析，增殖指数通过分裂细胞的平均百分比和分裂代数的平均值表示，结果见图3。
图3显示:分离后的淋巴细胞被CFSE标记后，和刺激物共同孵育5天，流式检测并用FlowJo7.6.1进行分析。结果显示，Ifepal-6/AdHBx处理组小鼠脾淋巴细胞具有较强的增殖活性，其分裂细胞的平均百分比和分裂代数的平均值分别为80.4%和1.73，明显高于其他三组(PBS 组为 16.4% 和 0.32，Hepal-6 组为 25.3% 和 0.48，H印al-6/AdNull 组为 30.9%和 0.48)。3.细胞毒性试验将分离出的小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞，按100: I的比列加入刺激物(同上)，37°C孵育72h，收集上清中的细胞，洗涤三次，调整浓度为IOVml。将对数生长期的H印al-6/HBx细胞作为靶细胞，用2.5μ M CFSE标记靶细胞(同上)，浓度调整为105/mL。按E(效应细胞):T (靶细胞)比为100、50、25、12.5、6.25在圆底聚苯乙烯试管中混合效应细胞和靶细胞，每管包含IO4个靶细胞，总体积为200 μ L，400 X g离心45 60s，并于37°C孵育4小时，不加效应细胞的靶细胞作为阴性对照。孵育后，将样品置于冰上，每管加入20 μ L的碘化丙啶(PI)(购自Sigma, Ρ2880)(浓度为100yg/mL)放置IOmin, Ih内完成流式检测。CFSE+/PI+细胞被认为是细胞毒杀死的靶细胞，结果统计，杀伤率=实验组靶细胞杀伤率(％ )-阴性组靶细胞杀伤率(％ ) /100-阴性组靶细胞杀伤率(％) X 100，记过见图4。图4显示:实验组的淋巴细胞能够特性行杀伤HBx表达阳性的靶细胞，其他三组没有明显的杀伤作用。当E: T彡6.25时，实验组和对照组比较有显著地统计差异(P〈0.01)。结果说明Hepal-6/AdHBx疫苗能够在小鼠体内诱导HBx特异性的CTL反应。综上可知，Hepal-6/AdHBx疫苗能够在小鼠体内诱导HBx特异性的CTL反应，未经基因修饰的肿瘤细胞疫苗在一定程度也能诱导免疫反应，但抗肿瘤免疫反应太弱，不能显著抑制肿瘤的生长。肿瘤抗原的免疫原性差，MHC分子和共刺激分子在肿瘤细胞中的表达缺失等，导致未修饰的肿瘤细胞疫苗不能诱导有效的特异性抗肿瘤免疫。实施例四本发明HBx/IL-12双基因修饰抗肝癌全细胞疫苗的制备将!fepal-6接种于培养皿中，密度达70 80%处于对数生长期时，用AdHBx/IL_12双基因重组腺病毒(结构及构建过程见参考文献3，其表达框的核苷酸序列如Seq ID N0.4所示)感染细胞，感染复数(MOI)为20，病毒感染2小时后，弃病毒，换新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养24小时，0.25%胰酶消化，离心，收集细胞，无血清DMEM培养基洗涤3次，用适量细胞培养基重悬细胞沉淀，细胞密度调成I X IO7个/mL。将处理好的细胞置于辐照仪中进行辐照灭活，剂量为50Gy，离心收集细胞，细胞沉淀用细胞冻存液重悬，分装于细胞冻存管中置_80°C或液氮中备用。使用时按常规细胞复苏方法进行，离心洗涤后，无血清DMEM培养基重悬细胞沉淀，细胞密度调成I X IO7个/mL。实施例五本发明HBx/IL-12双基因修饰抗肝癌全细胞疫苗的体内抗肿瘤实验将3.5 X IO6个H印al-6/HBx小鼠肝癌细胞接种于6 8周龄C57小鼠右侧胁皮下，接种肿瘤细胞后第8天，当肿瘤直径约5 6mm时，将荷瘤小鼠随机分为生理盐水、Adnull修饰的抗肝癌全细胞疫苗组和AdHBx/IL-12修饰的抗肝癌全细胞疫苗三组，每组8只。小鼠腿部皮下注射生理盐水100 μ L/次、Adnull修饰的抗肝癌全细胞疫苗、AdHBx/IL-12修饰的抗肝癌全细胞疫苗IO6个/100 μ L/次，每周I次，共3次，每3天用游标卡尺测量肿瘤的长与宽，按公式:肿瘤体积(mm3)=0.52X长X宽2计算肿瘤体积，结果见图5。图5Α显示:在第一次免疫治疗后6天(肿瘤接种14天)，较生理盐水组和空病毒组，HBx/IL-12修饰的抗肝癌全细胞疫苗组肿瘤生长开始减慢。图5B显示:在第二次免疫治疗后5天(肿瘤接种20天)，HBx/IL-12修饰的抗肝癌全细胞疫苗组肿瘤开始消退，其中有两只小鼠肿瘤完全消退。由此说明，本发明中经HBx基因或HBx/IL-12基因共修饰的肝癌全细胞疫苗能靶向杀伤HBx阳性的肝癌细胞，表现出良好的抗肝癌效应。本发明的疫苗可用于HBV相关性肝癌的靶向细胞免疫治疗。本发明为HBV相关性肝癌的靶向细胞免疫治疗提供了新的选择，具有良好的应用前景。参考文献1.Cheng P, Li Y, Yang L, Wen Y, Shi W，Mao Y, Chen P, Lv H, Tang Q, WeiY.Hepatitis B virus X protein (HBx) induces G2/M arrest and apoptosis throughsustained activation of cyclin Bl-CDKlkinase.0ncol Rep.2009Nov;22(5):1101-7。2.魏于全 ，李玉华，文艳君，杨莉，赵霞《乙肝病毒X蛋白及其编码基因在制备治疗肝癌的药物中的用途》专利申请号:200910300989.7。3.魏于全，程平，杨莉，李玉华，文艳君《HBx和人IL-12双基因重组载体及抗肝癌疫苗》专利申请号:201210134941.5。
权利要求
1.抗肝癌全细胞疫苗，其特征在于:该疫苗的活性成分包括经过肝癌抗原基因修饰的肝癌细胞，所述的肝癌抗原基因是HBx。
2.根据权利要求1所述的抗肝癌全细胞疫苗，其特征在于:所述的肝癌细胞还有免疫调节基因与HBx共同修饰。
3.根据权利要求2所述的抗肝癌全细胞疫苗，其特征在于:所述的免疫调节基因为人IL-2、人 IL-12、人 IL-15 或人 IFN- Y。
4.根据权利要求1 3任一项所述的抗肝癌全细胞疫苗，其特征在于:所述的肝癌细胞为体外传代的人肝癌细胞系。
5.根据权利要求1 4所述的抗肝癌全细胞疫苗，其特征在于:所述的肝癌细胞为灭活的细胞。
6.权利要求1 5任一项所述的抗肝癌全细胞疫苗的制备方法，其特征在于:包括如下步骤:用表达HBx或HBx/免疫调节基因的真核表达载体感染肝癌细胞，灭活，即得。
7.根据权利要求6所述的抗肝癌全细胞疫苗的制备方法，其特征在于:包括如下步骤:将肝癌细胞培养至密度达70 80%时，用表达HBx或同时表达人HBx和免疫调节基因的真核表达载体感染肝癌细胞，感染复数MOI为20 50，培养I 2天后收集细胞置于辐照仪中进行辐照灭活，离心收集细胞，细胞沉淀用细胞冻存液重悬，置于-80°C或液氮备用。
8.根据权利要求6或7所述的抗肝癌全细胞疫苗的制备方法，其特征在于:所述的真核表达载体为复制缺陷型重组腺病毒载体。
9.权利要求1 5任一项所`述的疫苗在制备治疗的肝癌药物中的用途。
全文摘要
本发明属于细胞免疫治疗技术领域，具体涉及乙肝病毒X蛋白(HBx)基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗。本发明所要解决的技术问题是提供能够治疗HBV相关性肝癌的新型基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗。本发明的技术方案是一种HBx修饰的抗肝癌全细胞疫苗，该疫苗的活性成分包括经过肝癌抗原基因修饰的肝癌细胞，所述的肝癌抗原基因是HBx。本发明还提供了抗肝癌全细胞疫苗的制备方法。本发明的抗肝癌全细胞疫苗能靶向杀伤HBx阳性的肝癌细胞，表现出良好的抗肝癌效应。
文档编号A61P1/16GK103230600SQ20131011870
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月8日 优先权日2013年4月8日
发明者程平, 魏于全, 杨莉, 李玉华, 文艳君 申请人:四川大学