Fviii的位点定向修饰的制作方法

专利名称：Fviii的位点定向修饰的制作方法
技术领域：
本发明涉及因子VIII (FVIII)突变蛋白，其允许在确定的位点偶联一个或多个生物相容的聚合物如聚乙二醇。另外，提供了用于治疗目的的相关的制剂、其剂量及施用方法。这些修饰的FVIII变体和相关的组合物和方法用于给遭受血友病A的个体提供具有减少的注射频率和减少的免疫原性应答的治疗选择。
背景技术：
血友病A是最常见的遗传性凝结障碍，估计的发病率为1/5000男性。它的原因是FVIII的缺乏或结构缺陷，所述FVIII是血液凝结的固有途径中的关键组分。目前血友病A的治疗包含静脉内注射人FVIII。已经重组地生产了人FVIII，作为约300kD的单链分子。它由结构域 A1-A2-B-A3-C1-C2 组成(Thompson, 2003, Semin.Hematol.29，pp.11-22)。前体产物在高尔基体中被加工成200kD (重链)和80kD (轻链)的2条多肽链，这2条链通过金属离子结合到一起(Kaufman 等，1988, J.Biol.Chem.263, p.6352 ；Andersson 等，1986,Proc.Natl.Acad.Sc1.83, p.2979)。FVIII的B-结构域似乎是可有可无的，因为还已经显示B-结构域缺失的FVIII (BDD,90kD A1-A2重链+80kD轻链)可以有效地用作血友病A的替补疗法。B-结构域缺失的FVIII序列含有B-结构域的14个氨基酸以外的所有缺失。目前，通过根据需要静脉内施用FVIII来治疗血友病A患者，或者作为预防疗法每周施用几次。关于预防治疗，每周施用15-25IU/kg体重的因子VIII3次。患者总是需要它。因为它在人中的半衰期短，所以必须频繁地施用FVIII。尽管全长蛋白具有大于300kD的大尺寸，寸，但FVIII具有仅约11小时的人中的半衰期(Ewenstein等,2004, Semin.Hematol.41, pp.1-16) 0对频繁的静脉内注射的需要造成患者顺应性的巨大障碍。如果可以开发具有更长的半衰期且因而需要更低频率的施用的FVIII产物，则会更方便患者。另夕卜，如果提高了半衰期，那么由于需要更低的剂量，可以降低治疗费用。现有疗法的另一个缺点是，约25-30%患者发展抑制FVIII活性的抗体(Saenko等,2002, HaemophiIia8, pp.1-11) o抑制性抗体的主要表位定位于A2结构域中的残基484-508、A3结构域中的残基1811-1818和C2结构域。抗体发展阻止FVIII作为替补疗法的应用，迫使该组患者寻求使用高剂量重组因子VIIa的甚至更昂贵的治疗和免疫耐受疗法。下面的研究鉴别出了抑制性抗体的FVIII表位。在25份抑制性血浆样品的研究中，发现11份结合凝血酶产生的73kD轻链片段A3C1C2，4份结合A2结构域，且10份结合二者(Fulcher, C.等，1985，Proc.Natl.Acad.Sc1.2(22), pp.7728-32)。在另一项研究中，重组A2多肽中和了 8种来自患者的A2结构域抑制剂中的6种(Scandella，D.等，1993，Blood82(6)，pp.1767-75)。将9种来自患者的抑制剂中的6种的表位作图到A2残基 379-538 (Scandella, D.等，1988，Proc.Natl.Acad.Sc1.85 (16)，pp.6152-6)。18 种重链抑制剂的表位定位于相同的A2结构域N-末端18.3kD区域(Scandella, D.等，1989,Blood74(5)，pp.1618-26)。通过用同源猪序列替代人A2结构域残基387-604产生的有活性的重组杂种人/ 猪 FVIII 分子，对患者 A2 抑制剂是抗性的(Lubin, 1.等，1994，J.Biol.Chem.269(12),pp.8639-41)，且对与患者A2抑制剂竞争结合A2的鼠单克隆抗体mAB413IgG是抗性的(Scandella, D.等，1992, Thromb Haemost.67 (6), pp.665-71)。当实验表明 mAB413IgG和4种患者抑制剂不抑制其中用猪序列替代A2结构域残基484-508的杂种人/猪FVIII时，该A2结构域表位进一步定位于A2结构域残基484-508 (Healey, J.等，1995，J.Biol.Chem.270 (24)，pp.14505-9)。该杂种FVIII还对筛选的23份患者血浆的至少一半是更高抗性的(Barrow，R.等，2000, Blood95 (2)，pp.564-8)。丙氨酸扫描诱变鉴别的残基487对结合测试的所有5种患者抑制剂都是关键的，而残基484、487、489和492对于与mAB413IgG的相互作用都是重要的(Lubin, 1.，J.Biol.Chem.272(48)，pp.30191-5)。在接受 R484A/R489A/P492A突变体(而不是R484A/R489A突变体)的小鼠中的抑制性抗体效价，显著低于接受对照人 BDD FVIII 的小鼠(Pa rker, E.等，2004，Bloodl04(3)，pp.704-10)。总之，A2结构域的484-508区域似乎是FVIII活性的抑制剂的结合位点。除了发展对FVIII的免疫应答以外，常规疗法的另一个问题是，其需要频繁的给药，因为FVIII的体内半衰期短。已经研究了从循环清除FVIII的机理。从循环清除FVIII，已部分地归因于向低密度脂蛋白受体-相关蛋白(LRP)的特异性结合，所述LRP是具有广泛配体特异性的肝清除受体(Oldenburg等,2004,HaemophilialOSuppl4, pp.133-139)。最近，还表明低密度脂蛋白(LDL)受体在FVIII清除中起作用，如通过与LRP协同调节FVIII的血衆水平(Bovenschen等,2005, Bloodl06,pp.906-910)。两种相互作用都被结合细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)所促进。当LRP被封闭时，可以使在小鼠中的血浆半衰期延长3.3倍，或者当LRP和细胞表面HSPG都被封闭时，可以延长 5.5 倍(Sarafanov 等，2001，J.Biol.Chem.276，pp.11970-11979)。推测HSPG将FVIII集中在细胞表面上，并将其呈递给LRP。FVIII上的LRP结合位点已经被定位在 A2 残基 484-509 (Saenko 等，1999，J.Biol.Chem.274，pp.37685-37692)、A3 残基1811-1818 (Bovenschen 等，2003, J.Biol.Chem.278，pp.9370-9377)和 C2 结构域中的表位(Lenting 等，1999，J.Biol.Chem.274，pp.23734-23739)。通过蛋白酶的作用，也可以将FVIII从循环中清除。为了理解该作用，人们必须理解FVIII参与血液凝结的机理。FVIII作为结合vWF的重链和轻链的异源二聚体而循环。VffF 结合包含 FVIII 残基 1649-1689 (Foster 等，1988，J.Biol.Chem.263，pp.5230-5234)和Cl (Jacquemin 等，2000，Blood96，pp.958-965)和 C2 结构城(Spiegel,P.等，2004，J.Biol.Chem.279(51)，pp.53691-8)的部分。FVIII被凝血酶激活，该凝血酶切割残基372、740和1689之后的肽键，以产生Al、A2和A3-C1-C2结构域的异源三聚体(Pittman等，2001，Proc.Natl.Acad.Sc1.276，pp.12434-12439)。激活后，FVIII 从 vWF 解离，并通过结合磷月旨，集中在血小板细胞表面。磷脂结合包含FVIII残基2199、2200、2251和2252 (Gilbert等，2002，J.Biol.Chem.277，pp.6374-6381)。在这里，它通过与 FVIII 残基 558-565 (Fay等，1994，J.Biol.Chem.269, pp.20522-20527)和 1811-1818 (Lenting 等，1996，J.Biol.Chem.271, pp.1935-1940)的相互作用，结合 FIX，并通过与 FVIII 残基 349-372 (Nogami 等，2004，J.Biol.Chem.279，pp.15763-15771)的相互作用，结合 FX,并作为 FX 的 FIX 激活的辅因子，所述FX是内源性凝结途径的基本组分。激活的FVIII (FVIIIa)受到蛋白酶激活的蛋白C(APC)的部分灭活，这通过在FVIII残基336和562后面的切割来实现(Regan等，1996，J.Biol.Chem.271，pp.3982-3987)。但是，灭活的主要决定因素是A2结构域从Al和A3-C1-C2 解离(Fay 等，1991，J.Biol.Chem.266，pp.8957-8962)。已经证实增加蛋白的体内半衰期的一种方法是PEG化(PEGylation)。PEG化是长链聚乙二醇(PEG)分子向蛋白或其它分子的共价附着。PEG可以是线性形式或分支形式，以产生具有不同特征的不同分子。除了增加肽或蛋白的半衰期以外，PEG化已经用于减少抗体发展，保护蛋白免受蛋白酶消化，和保持材料在肾滤液的外面(Harris等，2001，ClinicalPharmacokinetics40,pp.539-51)。另外,PEG化也可以增加蛋白的总稳定性和溶解度。最后，PEG化蛋白的持续的血浆浓度，可以通过减少药物的低谷至顶点水平降低不利的副作用的程度，从而消除对在早期时间点弓I入超生理水平的蛋白的需要。通过用大聚合物(如PEG和葡聚糖)靶向伯胺(N-末端和赖氨酸)来随机修饰FVIII的尝试，已经取得不同程度的成功(W094/15625、美国专利4970300、美国专利6048720)。在1994年专利申请(W094/15625)中公开的最显著的提高，显示了 4倍半衰期提高，但是代价是，在全长FVIII与50倍摩尔过量的PEG反应后，丧失2倍活性。W02004/075923公开了通过随机修饰生成的FVIII和聚乙二醇的缀合物。在过去，已经批准随机地PEG化的蛋白如干扰素a (Kozlowski等，2001，BioDrugsl5，pp.419-429)用作治疗剂。但是，对于异源二聚体的FVIII，该随机方案更容易出问题。FVIII具有数百个潜在的PEG化位点，包括158个赖氨酸，2个N-末端和多个组氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，它们都可能被主要靶向伯胺的试剂PEG化。例如，显示PEG化的干扰素a -2b的主要位置异构体是组氨酸(Wang 等,2000, Biochemistry39, pp.10634-10640)。此外,全长 FVIII 的不均匀加工，可以导致原材料的混合物，这导致PEG化的产物的进一步复杂性。不控制FVIII上的PEG化位点的另一个缺点是，如果PEG附着在关键的活性位点处或附近，尤其是如果超过一个PEG或单个大PEG缀合到FVIII上，那么潜在的活性降低。因为随机的PEG化总是产生大量多重PEG化的产物，所以仅仅得到单-PEG化的产物的纯化会急剧降低总得率。最后，产物概况的巨大异质性使每批的一致合成和表征几乎不可能。因为良好生产需要一致的、充分表征的产品，所以产物异质性是商业化的屏障。鉴于所有这些原因，需要更特异性的PEG化FVIII的方法。
在近期的综述中(Kochendoerfer, G., Curr.0pin.Chem.Biol.2005,可在线以Oct.15, 2005, direct object identifier doi: 10.1016/ 1.cbpa.2005.10.007得至丨丨)，已经
总结了各种位点定向蛋白PEG化策略。一种方法包含，通过化学合成或重组表达，将非天然氨基酸掺入蛋白，随后添加将与非天然氨基酸特异性地反应的PEG衍生物。例如，非天然氨基酸可以是含有不存在于天然蛋白中的酮基的氨基酸。但是，蛋白的化学合成对于如FVIII这样大的蛋白不可行。目前肽合成的界限是约50个残基。可以连接几个肽，以形成更大的多肽片，但是生产甚至B-结构域缺失的FVIII，会需要超过20次连接，这会导致小于I %回收，甚至在理想的反应条件下。迄今为止，含有非天然氨基酸的蛋白的重组表达主要限于非哺乳动物表达系统。对于需要在哺乳动物系统中表达的大且复杂的蛋白如FVIII，预期该方法有问题。蛋白的位点特异性的PEG化的另一种方法是，用PEG-醛靶向N-末端主链胺。在该方法中需要低PH来实现超过其它胺基团的特异性。但是，这与FVIII的稳定性所需的狭窄的接近中性的 pH 范围不相容(Wang 等,2003, International J.Pharmaceutics259,pp.1-15)。此外，FVIII的N-末端PEG化不会导致提高的血浆半衰期，如果该区域不参与血浆清除的话。实际上，FVIII轻链的N-末端区域已经参与结合von Willebrand因子(vWF)，后者是对FVIII在循环中的存活至关重要的载体蛋白。通过因子VIII的N-末端修饰，可以破坏或减弱与vWF的至关重要的结合。因而，FVIII的N-末端PEG化可能具有降低FVIII的血浆半衰期的相反作用。W090/12874公开了人IL_3、粒细胞集落刺激因子和促红细胞生成素多肽的位点特异性的修饰，这如下实现:插入半胱氨酸，或用半胱氨酸替代另一种氨基酸，然后加入具有巯基反应基团的配体。该配体选择 性地偶联半胱氨酸残基。没有公开FVIII或其任何变体的修饰。鉴于上述原因，仍然需要具有更大的体内作用持续时间和降低的免疫原性、同时保持功能活性的改良的FVIII变体。此外，希望以一致的方式将这样的蛋白生产为均质产物。发明概述本发明的一个目的是，提供生物相容的聚合物-缀合的功能性FVIII多肽，其具有提高的药物代谢动力学特性和治疗特性。本发明的另一个目的是，提供生物相容的聚合物-缀合的B结构域缺失的FVIII蛋白，其具有提高的药物代谢动力学特性。本发明的另一个目的是，提供生物相容的聚合物-缀合的功能性FVIII多肽，其具有降低的与低密度脂蛋白受体-相关蛋白(LRP)、低密度脂蛋白(LDL)受体、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)和/或针对FVIII的抑制性抗体的结合。本发明的另一个目的是，提供改良的FVIII变体，其具有更大的体内作用持续时间和降低的免疫原性，其能以一致的方式生产为均质产物。在本发明的一个方面，提供了具有因子VIII前凝血剂活性的缀合物，其包含在多肽上的一个或多个预定位点共价附着到一个或多个生物相容的聚合物的功能因子VIII多肽，其中所述预定位点不是N-末端胺。本发明也包括制备该缀合物的方法，该方法包含:突变编码功能因子VIII多肽的核苷酸序列，以在预定位点用半胱氨酸残基的编码序列替代；表达突变的核苷酸序列，以产生半胱氨酸增强的突变蛋白；纯化该突变蛋白；使突变蛋白与生物相容的聚合物反应，所述聚合物已经被激活，以基本上仅在导入的半胱氨酸残基处与多肽反应，从而形成缀合物；和纯化该缀合物。本发明也涉及包含所述缀合物和可药用佐剂的药物组合物和治疗血友病的方法，所述方法通过施用治疗有效量的这些药物组合物给需要的哺乳动物来实现。本发明也涉及因子VIII突变蛋白的位点定向PEG化的方法，该方法包含:(a)表达位点定向因子VIII突变蛋白，其中所述突变蛋白具有在因子VIII突变蛋白的暴露表面上的氨基酸残基的半胱氨酸替代，且该半胱氨酸被加帽；(b)在温和地还原半胱氨酸突变蛋白和释放帽的条件下，使半胱氨酸突变蛋白接触还原剂；(C)从半胱氨酸突变蛋白去除帽和还原剂；和(d)去除还原剂后至少约5分钟，在产生PEG化的因子VIII突变蛋白的条件下，用包含巯基偶联部分的PEG处理半胱氨酸突变蛋白。附图简述

图1.PEG突变蛋白的载体图谱和诱变策略。图2.经单克隆FVIII抗体层析柱纯化的PEG2蛋白关于时间的280nm UV吸光度谱。使用来自Amersham Bioscience的AKTA ExplorerlOO层析系统,进行层析。图3三步位点定向PEG化方法。PEG代表着半胱氨酸-反应性PEG，如PEG-马来酰亚胺。封闭条代表着二硫键形成，而开口条代表着还原的半胱氨酸。图4.PEG2的位点定向PEG化。图5.PEG6的位点定向PEG化。图6a.BDD、PEG2、4、5和6的位点定向PEG化。上图用重⑶链抗体染色，而下图用轻(L)链抗体染色。“U”是未经加工的含有H和L两者的材料。图6b.PEG 15和PEG7的PEG化，用PEG2和PEG6作为对照。用TCEP还原起始纯化的PEG突变蛋白(“S”)，并在去除还原剂后，用12kD( “12”)或22kD( “22”) PEG进行PEG化(“R”)。在6% Tris-甘氨酸SDS PAGE上电泳样品，并用重链(“HC”)抗体(左图)或轻链(“LC”)抗体(右图)染色。“U”是未经加工的含有HC和LC两者的材料。用点突出显示PEG化的带。图6c.PEG2+6 的 PEG 化，用 PEG2 和 PEG6 作为对照。用 TCEP 还原 PEG2、PEG6 或PEG2+6，并在去除还原剂后，用5kD( “5”)或43kD( “43”)PEG进行PEG化(“R”)。还用12、22和33kD PEG将PEG2+6PEG化。在6% Tris-甘氨酸SDS PAGE上电泳样品，并在左图用针对蛋白的考马斯或用重链(H)或轻链(L)抗体进行染色。“U”是未经加工的含有H和L两者的材料。用点突出显示PEG化的带。图6d.野生型全长FVIII (KG-2)的PEG化，用PEG2作为对照。左凝胶用考马斯染料对蛋白进行染色，而右凝胶用碘对PEG进行染色。“BDD U”是未经加工的含有H和L两者的BDD材料。用点突出显示PEG化的带。图7.PEG化的PEG2的凝血酶切割。A2结构域的N-末端一半颜色为蓝色，而C-末端一半为绿色，R8B12抗体表位突出显示为深绿色(正确的FVIII模型)。用凝血酶处理PEG2 (泳道I)和22kD PEG化的PEG2 (泳道2)(分别是泳道3和4)，然后在7% Tris-乙酸盐凝胶(Invitrogen)上电泳,并用R8B12抗体染色。每个泳道含有约50ngFVIII。图8.PEG化的野生型全长FVIII (KG-2)的凝血酶切割。“S”=起始KG-2材料。“R”=还原的KG-2，且去除了还原剂。“P”=用43kD PEG进行PEG化的“R”。“Pure”=从过量PEG纯化出来的“P”。“L”=轻链。用点突出显示PEG化的带。
图9.PEG化的PEG2的碘染色。在6% Tris甘氨酸凝胶上电泳22或43kD PEG化的PEG2，并用R8B12FVIII抗体(泳道I和2)或碘(泳道3和4)染色。根据它们的分子量标记泳道，排列2种染色。泳道I和2各自含有约30ng FVII I,而泳道3和4含有约2 iig。图10.PEG化的和未PEG化的PEG2的MALDI质谱法分析。在PEG2 (图1Oa)或22kDPEG化的PEG2(图10b)上进行MALDI质谱法。PEG化后，PEG2的重⑶链峰显著减少，且出现新峰(H+PEG)，其集中在lllkD(22kD PEG+89kD重链)。没有检测到PEG化的轻(L)链峰，预期它集中在IOOkD (22kD PEG+83kD轻链)。图11.凝血酶切割后PEG化的和未PEG化的PEG2的MALDI质谱法。图12.凝血酶切割之前和之后PEG化的PEG6的MALDI质谱法。图13.在尺寸排阻柱上纯化的PEG化的PEG2的280nm UV吸收谱。图14.在阳离子交换柱上纯化的PEG化的和未PEG化的PEG6的280nm UV吸收谱。

图15.在尺寸排阻柱上纯化的PEG化的和未PEG化的PEG6的280nm UV吸收谱。图16.通过生色测定和凝结测定测得的与未PEG化的蛋白活性相比PEG化的蛋白活性。纯化的全长FVIII表示为KG-2。通过用还原和去除还原剂之后PEG处理的样品的值除以缓冲对照处理的样品的值，其中考虑PEG化得率，确定报告的百分比活性。图17.与PEG2相比，PEG化的PEG2的兔PK研究。图18.与BDD和PEG2相比，PEG化的PEG2的兔PK研究。在PEG化的PEG2和BDD之间对比P-值。图19.与BDD和PEG6相比，PEG化的PEG6的兔PK研究。图20.与未修饰的fl FVIII相比，PEG化的野生型全长(“fl”) FVIII的兔PK研究。图21.与PEG6和BDD相比，PEG化的PEG6的血友病小鼠PK研究。图22.与BDD相比，22和43kD PEG化的PEG2的正常小鼠PK研究。图23.与BDD相比，22kD PEG化的PEG2的全时程正常小鼠PK研究。图24.血友病小鼠(BDD)因子VIII回收柱状图，它描绘了在血友病小鼠测定中两种BDD因子VIII的半衰期的药物代谢动力学(PK)评价。图25.与BDD相比，22kD PEG化的PEG2的血友病小鼠肾撕裂伤研究。载体处理的小鼠具有25uL/g体重的失血。图26.在有递增量的FVIII抗体存在下，PEG化的PEG2和BDD的生色活性。抗体表位在括号中指明。图27.在有递增量的FVIII mAB413抗体存在下，PEG化的PEG2的生色活性。图28.在有源自已经发展对FVIII的抑制剂的患者的人血浆存在下，BDD、43kDPEG 化的 PEG2、33kD PEG 化的 PEG6 和 33kD 双 PEG 化(diPEGylation)的 PEG2+6 的生色活性。在上面记录了抑制剂效价和血液收集日期。上面的2个图包括从5-405倍患者血浆稀度收集的数据。左下图集中在患者HRF-828血浆的1: 15倍稀度。右下图证实，为上面的2个图中的每个FVIII样品使用的0.064IU/mL不是饱和剂量。图29.PEG化筛选方法和验证。上图显示了瞬时表达的PEG突变蛋白的PEG化筛选示意图。下图显示了使用重链(“H”)-特异性的抗体(左)或轻链(“L”)特异性的抗体(右)对PEG化的产物的蛋白印迹分析。用点突出显示PEG化的带。“U”是未经加工的含有H和L两者的材料。图30.PEG15-17的PEG化筛选。使用重链(“H”)-特异性的抗体(R8B12和58.12)或轻链(“L”)特异性的抗体(C7F7和GM)，对PEG化的产物进行蛋白印迹分析。所有3种突变蛋白都是对重链选择性的，相对PEG化效率是PEG15 PEG16 > PEG17。用点突出显示PEG化的带。“U”是未经加工的含有H和L两者的材料。图31.该凝胶显示了作为还原剂浓度函数的PEG2+14的PEG化。在4 °C，用67-670uM的TCEP处理PEG2+1430分钟。通过旋转柱去除还原剂，随后用12kD PEG进行PEG化。FVIII的重链和轻链分别突出显示为“H”和“L”。2个印迹指出了 PEG化的重链和轻链。图32.用67-670uM TCEP处理、随后去除还原剂的PEG2+14的解卷积质谱。发明详述本发明是基于下述发现，即具有FVIII活性的多肽可以在非N-末端胺的预定位点共价附着到生物相容的聚合物上，且这样的多肽基本上保留它们的凝血剂活性。此外，这些多肽缀合物具有提高的循环时间和降低的抗原性。本发明的缀合物胜过现有技术的具有随机附着到FVIII或附着在N-末端的聚合物的缀合物。位点定向附着允许人们设计避过生物学活性所需区域并从而维持相当大的FVIII活性的修饰。它也允许设计成附着聚合物，来阻断在参与FVIII清除的位点的结合。位点定向结合也允许通过随机的聚合物偶联，生成均匀的产物，而不是现有技术生成的异质缀合物。通过避免在轻链N-末端胺处的附着，本发明的缀合物避免了因为将配体附着在FVIII多肽的活性位点可能产生的活性损失。认为轻链N-末端区域参与vWF因子与FVIII的结合，这是循环中的稳定结合。定义生物相容的聚合物。生物相容的聚合物包括聚环氧烷，例如但不限于聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、多聚乙酰神经氨酸或其它基于碳水化合物的聚合物、氨基酸聚合物、生物素衍生物、聚乙烯醇(PVA)、聚羧 酸酯、聚乙烯吡略烷酮、乙烯-马来酸酐共聚物、苯乙烯-苹果酸酐共聚物、聚〃恶唑啉、聚丙烯酰吗啉、肝素、清蛋白、纤维素、壳聚糖水解产物、淀粉如羟乙基-淀粉和羟丙基-淀粉、糖原、琼脂糖和其衍生物、瓜耳胶、支链淀粉、菊粉、黄原胶、角叉藻聚糖、果胶、藻酸水解产物、其它生物聚合物和其任意等同物。优选的是聚乙二醇，且更优选的是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。其它有用的聚(亚烷基)二醇化合物是聚丙二醇(PPG)、聚丁二醇(PBG)、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CD1-PEG)、分支的聚乙二醇、线性的聚乙二醇、分叉的聚乙二醇和多臂的或“超分支的”聚乙二醇(星形-PEG)。聚乙二醇(PEG)。“PEG”和“聚乙二醇”在本文中可互换地使用，且包括任意的水溶性的聚环氧乙烷。一般地，根据本发明使用的PEG包含下面的结构“一(0CH2CH2)n-”，其中⑷是2-4000。如本文所使用的，根据末端氧是否已经被置换，PEG也包括“ 一CH2CH2-O (CH2CH2O) n—CH2CH2—” 和“一(OCH2CH2) n0—”。在说明书和权利要求全文中，应当牢记，术语“PEG”包括具有各种末端或“封端”基团的结构，例如但不限于羟基或C1J烷氧基。术语“PEG”也指含有大多数(即大于50%)的-OCH2CH2-重复亚基的聚合物。关于具体形式，PEG可以具有任意数目的许多分子量，以及结构或几何形状，如分支的、线性的、分叉的、和多功能的。PEG化。PEG化是聚乙二醇(PEG)共价附着到诸如蛋白的分子上的过程。激活的或有活性的官能团。当将诸如生物相容的聚合物的官能团描述为激活的时，该官能团可以容易地与其它分子上的亲电子试剂或亲核试剂反应。
B结构域缺失的FVIII(BDD)。如本文所使用的，BDD的特征在于，具有含有FVIII的B-结构域的14个氨基酸以外的所有缺失的氨基酸序列。B-结构域的前4个氨基酸(SFSQ，SEQ ID NO:1)连接至IJ B-结构域的最后 10 个残基上(NPPVLKRHQR, SEQ ID NO:2) (Lind,P.等，1995，Eur.J.Biochem.232，pp.19-27)。本文使用的 BDD 具有 SEQ ID NO:3 的氨基酸序列。FVII1.凝血因子VIII (FVIII)是在由肝合成并释放进血流中的糖蛋白。在循环血液中，它结合vonWiIIebrand因子(vWF，也称作因子VII1-相关抗原)，以形成稳定的复合物。被凝血酶激活后，它从复合物解离，以与凝结级联中的其它凝血因子相互作用，这最终导致血栓的形成。人全长FVIII具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，尽管等位基因变体是可能的。功能因子VIII多肽。如本文所使用的，功能因子VIII多肽表示功能多肽或多肽的组合，其能体内或体外地改正人因子VIII缺陷，所述缺陷的特征在于例如血友病A。因子VIII具有许多种自然状态的降解或加工形式。它们蛋白水解地源自前体，即一种链蛋白，如本文所证实的。功能因子VIII多肽包括这样的单链蛋白，且还提供了这些具有改正人因子VIII缺陷的生物学活性的各种降解产物。可能存在等位基因变体。功能因子VIII多肽包括所有这样的等位基因变体、糖基化的形式、导致因子VIII的衍生物的修饰和片段，只要它们含有人因子VIII的功能片段，且同样基本的特征性人因子VIII功能活性保持未受影响。通过本文所述的简单的体外测试，可以容易地鉴别出具有必需的功能活性的那些因子VIII衍生物。此外，功能因子VIII多肽能在因子IXa、钙和磷脂存在下，催化因子X向Xa的转化，以及改正源自患血友病A个体的血浆中的凝结缺陷。从本文的人因子VIII氨基酸序列和功能区域的序列公开内容，本领域技术人员会明白可以通过DNA的限制酶切割或人因子VIII蛋白的蛋白水解或其它降解衍生的片段。FIX。如本文所使用的，FIX指凝结因子IX，它也称作人凝血因子IX，或血浆促凝血酶原激酶组分。FX。如本文所使用的,FX指凝结因子X,它也称作人凝血因子X和Stuart-Prower因子。药物代谢动力学。“药物代谢动力学”(“PK”)是用于描述药物在身体中的吸收、分布、代谢和消除的性质的术语。药物的药物代谢动力学的提高，指使药物在体内更有效地作为治疗剂的这些特征(尤其是它在身体中的有效持续时间)的提高。突变蛋白。突变蛋白是一种基因工程改造的蛋白，其源自实验室诱导的蛋白或多肽的突变。蛋白。如本文所使用的，蛋白和多肽是同义词。FVIII清除受体。本文所使用的FVIII清除受体指功能性FVIII多肽上的受体区域，其结合或联合一个或多个其它分子，以导致从循环清除FVIII。因子VIII清除受体包括但不限于FVIII分子的结合LRP、LDL受体和/或HSPG的区域。
讨论根据本发明的方法预见到，可以在预定位点突变任何功能因子VIII多肽，然后在该位点共价附着生物相容的聚合物。有用的多肽包括但不限于，具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的全长因子VIII，和具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的BDD FVII10优选的是 BDD FVIII。在本发明的缀合物中使用的生物相容的聚合物可以是上面讨论的任意聚合物。选择生物相容的聚合物，以提供所需的药物代谢动力学的提高。例如，选择聚合物的特性、大小和结构，从而提高具有FVIII活性的多肽的循环半衰期，或降低多肽的抗原性，而没有不可接受的活性降低。优选地，聚合物包含PEG，且更优选地其至少50%的分子量是PEG。在一个实施方案中，聚合物是在末端用封端部分(如羟基、烷氧基、取代的烷氧基、链烯氧基、取代的链稀氧基、块氧基(alkynoxy)、取代的块氧基、芳基氧和取代的芳基氧)封端的聚乙二醇。更优选的是包含甲氧基聚乙二醇的聚合物。更优选的是包含甲氧基聚乙二醇的聚合物，其大小范围为3kD-100kD，且更优选地5kD-64kD或5kD_43kD。优选地,聚合物具有活性部分。例如,在一个实施方案中,聚合物具有巯基活性部分，其可以与功能因子VIII多肽上的游离半胱氨酸反应，以形成共价键。这样的巯基活性部分包括硫轻、三氟甲磺酸(triflate)、2，2, 2-三氟乙磺酸(tresylate)、氮丙唳、环氧乙烷、S-吡啶基或马来酰亚胺部分。优选的是马来酰亚胺部分。在一个实施方案中，聚合物是线性的，且在与巯基不强烈反应的一个末端具有“帽”(如甲氧基)，而在另一个末端具有巯基活性部分。在一个优选的实施方案中，缀合物包含PEG-马来酰亚胺，且大小范围为5kD-64kD。在下面的实施例中，提供了选择有用的生物相容的聚合物的其它指导。通过本领域已知的任意方法，可以发生编码具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列的位点定向突变。优选的方法包括在选择的用于共价附着聚合物的位点处导入半胱氨酸密码子的诱变。这可以如下实现:使用可商业得到的位点定向诱变试剂盒，如StratagenecQuickChange II位点定向诱变试剂盒、Clontech Transformer位点定向诱变试剂盒号K1600-1、Invitrogen GenTaylor 位点定向诱变系统号 12397014、Promega Altered SitesII体外诱变系统试剂盒号Q621 0或Takara Mirus Bio LA PCR诱变试剂盒号TAK RR016。本发明的缀合物可以如下制备:首先用半胱氨酸密码子替代功能性FVIII多肽表面上的一个或多个氨基酸的密码子，在重组表达系统中生产半胱氨酸突变蛋白，使突变蛋白与半胱氨酸-特异性的聚合物试剂反应，和纯化突变蛋白。在该系统中，在半胱氨酸位点添加聚合物，可以通过聚合物上的马来酰亚胺活性的官能度来实现。在下文提供了该技术的实例。使用的巯基活性聚合物的量应当至少与要衍生的半胱氨酸的摩尔量等摩尔，且优选地过量存在。优选地，使用至少5倍摩尔过量的巯基反应性聚合物，且更优选地，使用至少10倍过量的这种聚合物。用于共价附着的其它条件属于本领域技术人员的技术。在下面的实施例中，以本领域常规方式命名突变蛋白。命名突变体的惯例是基于SEQ ID NO:4提供的成熟的全长因子VIII的氨基酸序列的。作为一种分泌蛋白，FVIII含有在翻译过程中被蛋白水解地切割的信号序列。去除19氨基酸信号序列后，分泌的FVIII产物的第一个氨基酸是丙氨酸。正如常规的和本文使用的，当提及BDD FVIII中的突变氨基酸时，通过其在全长FVIII序列中的位置命名突变氨基酸。例如，下面讨论的PEG6突变蛋白命名为K1808C，因为它将在类似于全长序列的1808位置处的赖氨酸(K)改变成半胱氨酸(C)。用于共价结合聚合物的预定位点最好地选自暴露于多肽表面、不参与FVIII活性或不参与体内稳定化FVIII的其它机理(如结合vWF)的位点。这样的位点还最好地选自已知参与灭活FVIII或从循环中清除FVIII的机理的那些位点。下面详细讨论了这些位点的选择。优选位点包括在下述对象的结合位点处或附近的氨基酸残基:(a)低密度脂蛋白受体相关蛋白，(b)硫酸肝素蛋白聚糖，(c)低密度脂蛋白受体和/或(d)因子VIII抑制性抗体。“在结合位点处或附近”指残基与结合位点足够接近，从而使得生物相容的聚合物与该位点的共价附着导致结合位点的位阻。例如，预期这样的位点是在结合位点的20 A内。在本发明的一个实施方案中，生物相容的聚合物共价附着在功能因子VIII多肽的下述位置处或附近的氨基酸残基上:(a)上面定义的因子VIII清除受体，(b)能降解因子VIII的蛋白酶的结合位点，和/或(C)因子VIII抑制性抗体的结合位点。蛋白酶可以为激活的C蛋白(APC)。在另一个实施方案中，生物相容的聚合物共价附着在功能因子VIII多肽的预定位点，从而使得低密度脂蛋白受体相关蛋白与多肽的结合小于与未缀合时的多肽的结合，且优选地，不到1/2。在一个实施方案中，生物相容的聚合物共价附着在功能因子VIII多肽的预定位点，从而使得硫酸肝素蛋白聚糖与多肽的结合小于与未缀合时的多肽的结合，且优选地，不到1/2。在另一个实施方案中，生物相容的聚合物共价附着在功能因子VIII多肽的预定位点，从而使得因子VIII抑制性抗体与多肽的结合小于与未缀合时的多肽的结合，优选地，不到与未缀合时的多肽的结合的1/2。在另一个实施方案中，生物相容的聚合物共价附着在功能因子VIII多肽的预定位点，从而使得低密度脂蛋白受体与多肽的结合小于与未缀合时的多肽的结合，优选地，不到1/2。在另一个实施方案中，生物相容的聚合物共价附着在功能因子VIII多肽的预定位点，从而使得血浆蛋白酶对多肽的降解小于对未级合时的多肽的降低。在另一个实施方案中，血浆蛋白酶对多肽的降解不到当多肽未缀合时在相同条件下经相同时间段测得的对多肽的降解的1/2。使用表面等离子体共振技术(Biacore)，可以确定LRP、LDL受体或HSPG对FVIII的结合亲和力。例如，可以将FV III直接地或通过FVIII抗体间接地涂布在Biacore 芯片上，并可以将各种浓度的LRP传递到芯片上，来测量相互作用的启动速率和关闭速率(Bovenschen N.等，2003, J.Biol.Chem.278(11), pp.9370-7)。两个速率的比给出亲和力的度量。需要PEG化后亲和力的2倍，优选地5倍，更优选地10倍，和更优选地30倍的降低。通过本领域技术人员已知的任意方法，可以测量蛋白酶APC对FVIII的降解。在一个实施方案中，生物相容的聚合物共价附着在多肽的一个或多个因子VIII氨基酸位置 81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118 和 2284。在另一个实施方案中，生物相容的聚合物共价附着在多肽的一个或多个因子VIII氨基酸位置377、378、468、491、504、556、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911 和 2284，且(I)缀合物与低密度脂蛋白受体相关蛋白的结合小于未缀合的多肽与低密度脂蛋白受体相关蛋白的结合；(2)缀合物与低密度脂蛋白受体的结合小于未缀合的多肽与低密度脂蛋白受体的结合；或(3)缀合物与低密度脂蛋白受体相关蛋白和低密度脂蛋白受体的结合小于未缀合的多肽与低密度脂蛋白受体相关蛋白和低密度脂蛋白受体的结合。在另一个实施方案中，生物相容的聚合物共价附着在多肽的一个或多个因子VIII氨基酸位置377、378、468、491、504、556和711，且该缀合物与硫酸肝素蛋白聚糖的结合小于未缀合的多肽与硫酸肝素蛋白聚糖的结合。在另一个实施方案中，生物相容的聚合物共价附着在多肽的一个或多个因子VIII氨基酸位置81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118 和2284，且该缀合物具有比未缀合的多肽更小的与因子VIII抑制性抗体的结合。在另一个实施方案中，生物相容的聚合物共价附着在多肽的一个或多个因子VIII氨基酸位置81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118 和 2284，且优选地在一个或多个位置 377、378、468、491、504、556 和711，且该缀合物具有比未缀合的多肽更少的来自能降解因子VIII的血浆蛋白酶的降解。更优选的，血浆蛋白酶是激活的C蛋白。在另一个实施方案中，生物相容的聚合物共价附着在B-结构域缺失的因子VIII的氨基酸位置129、491、1804和/或1808，更优选地，491或1808。在另一个实施方案中，生物相容的聚合物附着在多肽的因子VIII氨基酸位置1804，且包含聚乙二醇。优选地，生物相容的聚合物附着的一个或多个预定位点由位点特异性的半胱氨酸突变控制。功能因子VIII多肽上的一个或多个(优选地，一个或两个)位点，可以是聚合物附着的预定位点。在具体的实施方案中，多肽是单-PEG化的或双PEG化的。本发明也涉及制备缀合物的方法，其包含:突变编码功能因子VIII多肽的核苷酸序列，以在预定位点用半胱氨酸残基的编码序列替代；表达突变的核苷酸序列，以产生半胱氨酸增强的突变蛋白；纯化该突变蛋白；使突变蛋白与生物相容的聚合物反应，所述聚合物已经被激活，以与多肽在基本上仅还原的半胱氨酸残基处反应，从而形成缀合物；和纯化该缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供了位点定向PEG化因子VIII突变蛋白的方法，其包含:(a)表达位点定向因子VIII突变蛋白，其中所述突变蛋白在因子VIII突变蛋白的暴露表面上用半胱氨酸替代氨基酸残基，且该半胱氨酸被加帽；(b)在温和地还原半胱氨酸突变蛋白和释放帽的条件下，使半胱氨酸突变蛋白接触还原剂；(C)从半胱氨酸突变蛋白去除帽和还原剂；和(d)去除还原剂后至少约5分钟，且优选地，至少15分钟，更优选地，至少30分钟，在产生PEG化的因子VIII突变蛋白的条件下，用包含巯基偶联部分的PEG处理半胱氨酸突变蛋白。PEG的巯基偶联部分选自:硫羟、三氟甲磺酸、2，2，2_三氟乙磺酸、氮丙啶、环氧乙烷、S-吡啶基和马来酰亚胺部分，优选地，马来酰亚胺。本发明还涉及肠胃外施用的药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的缀合物和可药用佐剂。可药用佐剂是可以加入活性成分中来辅助配制或稳定化制剂且不会对患者造成显著的有害毒理学作用的物质。这样的佐剂的实例是本领域技术人员熟知的，且包括水、糖如麦芽糖或鹿糖、清蛋白、盐等。其它佐剂记载在例如E.W.Martin的Remington' sPharmaceutical Sciences中。这样的组合物将含有有效量的缀合物以及适宜量的载体，以制备适合有效地施用给宿主的可药用组合物。例如，缀合物可以肠胃外地施用给遭受血友病A的受试者，其剂量可以随出血发作的严重性而变化。静脉内施用的平均剂量范围是，对于手术前适应症是40单位/kg，对于微量出血是15-20单位/kg，且对于维持剂量是在8小时时间段内施用的20-40单位/kg。
在一个实施方案中，本发明的方法包含，用半胱氨酸替代一个或多个表面BDD氨基酸，在哺乳动物表达系统中生产半胱氨酸突变蛋白，还原在表达过程中已经被生长培养基中的半胱氨酸加帽的半胱氨酸，去除还原剂，以允许BDD 二硫键重新形成，和与半胱氨酸-特异性的生物相容的聚合物试剂(如PEG-马来酰亚胺)反应。这样的试剂的实例是PEG-马来酰亚胺，其中PEG大小为如5、22或43kD，可以从Nektar Therapeutics of SanCarlos, CA 得到，Nektar 目录号分别是 2D2M0H01mPEG_MAL MW5, OOODa,2D2M0P0ImPEG-MALMW20kD,2D3X0P0lmPEG2-MAL MW40kD，或 PEG 大小为 12 或 33kD，可以从 NOF Corporation,Tokyo,日本得到，NOF 目录号分别是 Sunbright ME-120MA 和 Sunbright ME-300MA。使用离子交换层析，纯化PEG化的产物，以去除未反应的PEG，并使用尺寸排阻层析来去除未反应的BDD。该方法可以用于鉴别和选择性地屏蔽任何与FVIII的不利反应，如受体-介导的清除、抑制性抗体结合和蛋白水解酶的降解。我们注意到，Nektar或NOF提供的5kD PEG试剂在我们实验室测得为6kD，且类似地，作为线性20kD提供的PEG试剂在我们实验室测得为22kD，作为40kD提供的测得为43kD，且作为60kD提供的测得为64kD。为了避免混乱，在本文的讨论中，我们使用在我们实验室测得的分子量，例外是5kD PEG，我们将它记录为与生产商的鉴别相同的5kD。除了在BDD的位置491和1808处的半胱氨酸突变(上面公开的)外，将位置487、496、504、468、1810、1812、1813、1815、1795、1796、1803 和 1804 突变成半胱氨酸，以潜在地允许在PEG化之后阻断LRP结合。同样，将位置377、378和556突变成半胱氨酸，以允许在 PEG 化之后阻断 LRP 和 HSPG 结合。选择位置 81、129、422、523、570、1864、1911、2091 和2284以使其在BDD上相等地间隔开，从而使得在这些位置用大PEG ( > 40kD)进行的位点定向PEG化以及在天然糖基化位点(41、239和2118)和LRP结合位点的PEG化完全覆盖BDD的表面，并鉴别BDD的新清除机理。在一个实施方案中，细胞培养基含有半胱氨酸，其通过形成二硫键，“加帽”突变蛋白上的半胱氨酸残基。在缀合物的制备中，在重组系统中生产的半胱氨酸突变蛋白被培养基中的半胱氨酸加帽，且该帽被释 放帽的温和还原去除，然后添加半胱氨酸-特异性的聚合物试剂。如本领域技术人员会明白的，也可以使用本领域已知的FVIII位点特异性突变的其它方法。
实施例FVIII的结构活性关系分析。FVIII和BDD FVIII是非常大的复杂分子，具有许多不同的参与生物学反应的位点。以前共价修饰它们以提高药物代谢动力学性质的尝试具有混合的结果。令人惊奇的是，该分子可以被特异性地突变，然后以位点特异性的方式添加聚合物。此外，已知过去的聚合缀合物造成非特异性添加和降低的活性的问题，提高的药物代谢动力学性质和保留的活性的结果也令人惊奇。在一个实施方案中，本发明涉及使用半胱氨酸-特异性的配体(如PEG-马来酰亚胺)的位点定向诱变。未突变的BDD不具有任何可利用的与PEG-马来酰亚胺反应的半胱氨酸，所以仅仅突变的半胱氨酸位置将是PEG化位点。更具体地，BDD FVIII具有19个半胱氨酸，其中16个形成二硫键，且另外3个是游离的半胱氨酸(McMullen等，1995，Protein Sc1.4，pp.740-746)。BDD的结构模型表明，所有3个游离半胱氨酸都是隐蔽的(Stoliova-McPhie 等，2002，Blood99，pp.1215-1223)。因为氧化的半胱氨酸不能被PEG-马来酰亚胺PEG化，所以如果不首先还原，BDD中形成二硫键的16个半胱氨酸就不能被PEG化。基于BDD的结构模型，如果不首先使蛋白变性，以将BDD中的3个游离的半胱氨酸暴露于PEG试剂，这些半胱氨酸就不能被PEG化。因而，似乎不可能通过在天然半胱氨酸残基处PEG化来实现BDD的特异性的PEG化，而不显著改变BDD结构，这最可能破坏它的功能。不清楚全长FVIII的B结构域中的4个半胱氨酸的氧化还原状态。B结构域中的4个半胱氨酸如果不形成二硫键且暴露于表面，它们就可能被PEG化。但是，因为全长FVIII和BDD具有类似的药物代谢动力学(PK)特征和类似的体内半衰期(Gruppo等，2003，HaemophiIia9, pp.251-260)，B结构域PEG化不太可能导致提高的血浆半衰期，除非PEG的发生也保护非-B结构域区域。为了确定具有FVIII活性的多肽上用于聚合物附着的预定位点，所述附着将保留因子VIII活性和提高药物代谢动力学，基于BDD FVIII提出了下面的指导。修饰应当靶向清除、灭活和免疫原性机理，如LRP、HSPG、APC和抑制性抗体结合位点。Stoilova-McPhie.S.等，2002，Blood99(4)，pp.1215-23显示了 BDD的结构。例如，为了延长半衰期，可以将单个PEG导入在A2残基484-509和A3残基1811-1818中的LRP结合位点处或附近的特异性位点。在这些位点导入大体积的PEG，会破坏FVIII结合LRP的能力，并减少FVIII从循环中的清除。还认为，为了延长半衰期而不显著影响活性，可以将PEG导入残基1648，它位于全长分子中的B结构域和A3结构域的接点和A2和A3结构域之间的BDD的14-氨基酸接头中。通过使用重组DNA诱变技术，将单个半胱氨酸残基工程改造进A2或A3结构域，随后用半胱氨酸-特异性的PEG试剂(如PEG-马来酰亚胺)位点特异性地PEG化导入的半胱氨酸，可以实现PEG化的特异性。在484-509和1811 -1818处PEG化的另一个优点是，这两个表位代表着患者的2/3大类抑制性抗原位点。为了达到提高的循环半衰期和免疫原性反应的减少的最大效果，可以将A 2和A3LRP结合位点两者PEG化，以产生双PEG化的产物。应当指出，在1811-1818区域内PEG化，可导致活性的显著损失，因为该区域也参与FIX结合。558-565内的位点定向PEG化应当废除HSPG结合，但是也可减少活性，因为该区域也结合 FIX。可以PEG化其它表面位点，以鉴别新的FVIII清除机理。A2结构域的PEG化可以提供另外的优点，因为A2结构域在激活后会从FVIII解离，且推测由于它更小的大小，它可以比FVIII分子剩余部分更快地从循环中去除。另一方面，PEG化的A2可以大得足以逃避肾清除，且具有与FVIII剩余部分相当的血浆半衰期，从而可以体内重建激活的FVIII。A2和A3区域中的PEG化位点的鉴别。基于高表面暴露和它们的Ca向Ci3轨迹的向外方向，选择在推定的A2LRP结合区域处或附近的5个位置(与PEG1-5位置相对应的Y487、L491、K496、L504和Q468)，作为位点定向PEG化的实例。此外，这些残基在分子的三维结构中彼此大致等距，从而它们一起可以代表该整个区域。选择在推定的A3LRP结合区域处或附近的8个位置(与PEG6-14相对应的1808、1810、1812、1813、1815、1795、1796、1803、1804)，作为位点定向PEG化的实例。PEG6 (K1808)邻近1811-1818和在1810处的天然N-连接的糖基化位点。在位置1810处的PEG化(PEG7)将用PEG替代糖。在PEG8位置T1812处的突变，也将废除糖基化位点。尽管预测PEG9位置(K1813)指向内侧，但在结构模型不正确的情况下选择它。PEG10(Y1815)是在LRP结合环内的大体积的疏水氨基酸，且可以是关键的相互作用残基，因为疏水氨基酸通常存在于蛋白-蛋白相互作用的中心。因为已经报道1811-1818区域会参与LRP和FIX结合两者，所以认为该环内的PEG化可能导致降低的活性。因而，PEG11-PEG14(1795、1796、1803、1804)被设计成在1811-1818环附近，但是不在环内，从而人们可以用不同的PEG大小解离LRP和FIX结合。为了同时阻断两个LRP结合位点，可以生成双PEG化，例如，在PEG2和PEG6位置。因为已经显示558-565区域结合HSPG和FIX两者，在该区域内没有设计位点。相反地，将PEG15-PEG17 (377,378和556)设计在A2LRP和HSPG结合区域之间，从而使得附着的PEG可以干扰它们之间的相互作用并破坏可能的相互作用。也可以选择在LRP和HPSG结合区域内或附近的表面暴露的且指向外侧的其它位点。为了鉴别新的清除机理，可以将FVIII系统地PEG化。除了 PEG1-17以外，3个其它的天然糖基化位点，即与PEG18-20相对应的N41、N239和N2118，可以用作PEG化的限定点(tethering point)，因为它们应当是表面暴露的。除了 vWF、FIX、FX、磷脂和凝血酶的功能性相互作用位点以外，将在离PEG2、PEG6的Cβ原子20埃半径内的表面积和4个糖基化位点作图到BDD模型上。然后，基于它们覆盖 离它们每个C β原子20埃半径的几乎整个剩余BDD表面的能力，选择与 Y81、F129、K422、K523、K570、N1864、T1911、Q2091 和 Q2284 相对应的 PEG21-29。还选择这些位置，因为它们是完全暴露的，指向外侧的，且远离天然半胱氨酸，以使可能的不正确的二硫键形成最小化。选择20埃半径，因为预期大PEG (如64kD分支的PEG)具有覆盖约20埃半径的球的潜力。一起PEG化PEG21-29以及PEG2和PEG6和糖基化位点PEG18、19和20，可能保护几乎整个无功能的FVIII表面。可以组合导致增强的性质(如提高的PK特征、更大的稳定性或减少的免疫原性)的PEG化位置，以生成具有最大增强性质的多-PEG化产物。通过分别去除A2和A3结构域中暴露的二硫键，设计PEG30和PEG31。PEG30或C630A应释放它的二硫键配偶体C711用于PEG化。同样地，PEG31, C1899A应允许C1903被PEG化。诱变。通过在选择用于PEG化的位点导入半胱氨酸密码子，可以生成FVIII的位点定向PEG化的底物。Stratagene cQuickChange II位点定向诱变试剂盒用于制备所有的 PEG 突变体(Stratagene 试剂盒 200523,购自 Stratagene Corporation, La JoIIalCA)。使用PfuTurbo DNA聚合酶和温度循环仪，进行cQuikChange 位点定向诱变方法。使用不置换引物的PfuTurbo延伸两种互补的寡核苷酸引物(其中含有所需的突变)。使用含有野生型FVIII基因的dsDNA作为模板。在多个延伸循环后，用对甲基化的DNA特异性的DpnI内切核酸酶消化产物。新合成的含有突变的DNA是未甲基化的，而亲本野生型DNA是甲基化的。然后，将消化的DNA用于转化XL-1Blue超感受态细胞。诱变效率是几乎80 %。在pSK207+BDD C2.6或pSK207+BDD中进行诱变反应(图1)。通过DNA测序证实成功的诱变，并将含有突变的适当片段转入哺乳动物表达载体PSS207+BDD的FVIII主链中。转移后，将所有突变再次确认序列。对于A3突变蛋白PEG6、7、8、9和10，在载体pSK207+BDD C2.6中进行诱变。通过测序证实后，将突变体片段KpnI/Pme亚克隆进PSK207+BDD中。然后，将BDD突变蛋白亚克隆进pSS207+BDD表达载体中。对于A3突变蛋白PEGl1、12、13、14，直接在载体pSK207+BDD中进行诱变，且然后将确认序列的突变体 BDD 亚克隆进 pSS207+BDD 中。对于 A2 突变蛋白 PEG1、2、3、4、5，在 pSK207+BDD C2.6 载体中进行诱变。将确认序列的突变体亚克隆进PSK207+BDD中，且然后亚克隆进pSS207+BDD中。列出了每个反应的诱变所使用的引物(仅有义链):
权利要求
1.分离的多肽缀合物，其包含全长因子VIII和一个或多个生物相容的聚合物，其中所述生物相容的聚合物在B结构域共价附着到所述全长因子VIII。
2.权利要求1的分离的多肽缀合物，其中所述全长因子VIII包含SEQID N0:4的氨基酸序列或其等位基因变体。
3.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1的分离的多肽缀合物和可药用佐剂。
4.权利要求1的分离的多肽缀合物在制备用于治疗血友病的药物组合物中的用途。
5.具有因子VIII前凝血剂活性的缀合物，其包含共价附着到一个或多个生物相容的聚合物的功能因子VIII多肽，用于在具有因子VIII抑制抗体的患者中治疗血友病。
6.药物组合物，用于在具有因子VIII抑制抗体的患者中治疗血友病，所述组合物包含治疗有效量的权利要求5的缀合物。
7.具有因子VIII前凝血剂活性的分离的多肽缀合物，由具有重链和轻链的功能因子VI11多肽构成，所述功能因子VI11多肽在重链共价附着到一个或多个生物相容的聚合物。
8.药物组合物，用于治疗血友病A，所述组合物包含治疗有效量的权利要求7的分离的多肽缀合物。
9.具有因子VIII前凝血剂活性的分离的多肽缀合物，由具有重链和轻链的功能因子VIII多肽构成，所述功能因子VIII多肽在轻链共价附着到一个或多个生物相容的聚合物。
10.药物组合物，用于治疗血友病，所述组合物包含治疗有效量的权利要求9的分离的多肽缀合物。
全文摘要
一种FVIII的位点定向修饰。本发明涉及因子VIII突变蛋白，其在非N-末端胺的预定位点共价结合到一个或多个生物相容的聚合物，如聚乙二醇上。突变蛋白缀合物保留了FVIII前凝血剂活性，且具有提高的药物代谢动力学性质。
文档编号A61K38/37GK103214569SQ201310125428
公开日2013年7月24日 申请日期2005年11月14日 优先权日2004年11月12日
发明者潘小群, J·E·墨菲, 梅柏松, J·S·斯特劳斯, H·坦德拉, 陈建敏, T·巴内特, 唐亮, 汪德潜 申请人:拜尔健康护理有限责任公司