专利名称：一种靶向纳米钻石载体和靶向药物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物载体，具体涉及一种靶向纳米钻石载体和靶向药物及其制备方法和应用，更具体是以纳米钻石为原料，通过聚乙二醇做桥梁，用转铁蛋白共价偶联纳米钻石，制备纳米钻石-聚乙二醇-转铁蛋白(ND-PEG-Tf)靶向载体，采用物理吸附负载化疗药物阿霉素制备成靶向载药纳米药物ND-PEG-Tf-DOX，该纳米药物可在抗肿瘤药物中应用。
背景技术：
将纳米技术应用于癌症治疗和药物运输已引起广泛关注，它为具有潜在的纳米药物新兴领域开辟了道路。近年来，基于碳纳米材料，如富勒烯和碳纳米管在生物领域的应用尽管获得了进展，但这些纳米材料的生物相容性仍是期待解决的问题，因而限制了他们在临床上的应用。最近，由于纳米钻石具有低毒性、化学稳定性和高生物兼容性等优点，已对其在生物医药领域中的应用研究得到关注。多数传统化 疗抗肿瘤药物，由于缺乏对肿瘤细胞的选择性、即没有药物的导向作用，会不可避免地带来毒副作用。在杀伤肿瘤细胞的同时，正常细胞也被损伤，给患者造成很大伤害，很大程度上影响了患者的生活质量和治疗效果。因此在临床上，控制药物输送到达靶点和药物释放是化学疗法亟待解决的问题。针对这一课题，应用纳米材料为载体负载药物后能达到在体内的靶向输送目的成为当前研究的热点，如功能化纳米粒子的表面使其与癌细胞特异性结合。大量研究表明，纳米颗粒与蛋白或具有生物活性的配体偶联，能提高它们的稳定性和细胞吸收的有效性，适合偶联纳米颗粒的转铁蛋白是分子量约SOKDa的单肽链非血红素糖蛋白，是脊椎动物体内铁(III)的运输者，主要是转铁蛋白受体介导途径。转铁蛋白受体能在人体内广泛表达，但它的表达量有明显差别，肿瘤细胞具有高表达转铁蛋白受体，转铁蛋白-转铁蛋白受体专一性结合已成为一种有效的药物转运途径。因此转铁蛋白与纳米颗粒的偶联成为受体介导目标药物和基因运输的材料，包括量子点、碳纳米管、磁性纳米粒子、金纳米以及多孔硅纳米颗粒等。但是，这些纳米颗粒具有不同程度的毒副作用，因此在临床上的应用受到限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有主动靶向特性的靶向纳米钻石载体及其制备方法，以及以靶向纳米钻石为载体的靶向药物的制备和该靶向药物在抗肿瘤药物中的应用。本发明提供的一种靶向纳米钻石载体ND-PEG-Tf，是以纳米钻石为载体，聚乙二醇为桥梁，由转铁蛋白通过共价偶联形成靶向载体ND-PEG-Tf，其粒径大小为294.5 ±94.3nm。本发明提供的一种靶向纳米钻石载体ND-PEG-Tf的制备方法，包括如下步骤:(I)将羧基化的纳米钻石，在70_80°C真空干燥箱干燥过夜，按每毫克羧基化的纳米钻石加入0.05-0.2mL的无水N，N 二甲基甲酰胺(DMF)溶剂，超声分散形成悬浊液，再按每毫克羧基化的纳米钻石加入0.4-0.6mL的二氯亚砜(SOCl2),在65_70°C回流24h，在40-45°C下旋转蒸发掉过量的SOCl2，得到酰氯化的纳米钻石，按每毫克酰氯化的纳米钻石加入0.5-0.8mL的无水DMF溶剂得到酰氯化的纳米钻石悬浊液；(2)按酰氯化的纳米钻石与分子量为4000的PEG的质量比1:3_4，将PEG加入步骤(I)得到的酰氯化的纳米钻石悬浊液中，同时按每毫克酰氯化的纳米钻石加入0.1-0.2mL的三乙胺，在90°C回流24h, 15000rpm下离心5min,用重蒸水洗漆5次,除去上清液,得沉淀物纳米钻石-聚乙二醇ND-PEG-0H，真空干燥；(3)按每毫克ND-PEG-OH加入1.5_2mL的DMF溶剂，超声分散30min形成悬浊液，按ND-PEG-0H、琥珀酸酐(SA)和4-二甲胺基吡啶(DMAP)的质量比I '2-2.5 '2-2.5，分别加入SA和DMAP，在90°C回流24h ；15000rpm下离心，用重蒸水洗涤5次，除去上清液，获得ND-PEG-C00H沉淀物，真空干燥；(4)按每毫克ND-PEG-C00H加入0.3-0.5mL pH8.0的硼酸缓冲溶液，超声分散30min形成悬浊液，接着加入2倍ND-PEG-C00H质量的EDC，反应30min ；(5)然后，按ND-PEG-C00H与分子量为80KDa转铁蛋白(Tf)的质量比1:0.25_1，取Tf加入步骤(4)的反应液中，摇勻过夜；15000rpm离心5min,用重蒸水洗漆5次,除去上清液，得沉淀物纳米钻石-聚乙二醇-转铁蛋白(ND-PEG-Tf)冷藏即可。本发明提供的一种ND-PEG-Tf-DOX的制备方法，步骤如下:(I)按每毫克干燥的ND-PEG-Tf加入0.5-lmL蒸馏水，超声分散30min形成悬浊液，接着按ND-PEG-Tf与DOX质量比100:4_7加入D0X，室温下摇3h ；(2) 15000 rpm离心5min,用重蒸水洗漆3次,除去上清液,沉淀物纳米钻石-聚乙二醇-转铁蛋白-阿霉素(ND-PEG-Tf-DOX)冷藏即可。与现有技术相比，本发明选用的纳米钻石材料具有生物相容性好、无毒性、化学性质稳定、表面易修饰等诸多优点，通过ND-PEG-Tf与人肝癌细胞(HepG2，高表达转铁蛋白受体)作用(正常L-02细胞为对照，低表达转铁蛋白受体)，获得载体ND-PEG-Tf具有生物兼容性和靶向性；将靶向载体ND-PEG-Tf通过物理吸附传统化疗药物阿霉素，获得载药量为每毫克载体ND-PEG-Tf载阿霉素(10.1 ±2.5) μ g，制备成ND-PEG-Tf-DOX纳米药物，经体外MTT细胞活性试验证实(与上述两种细胞作用)，表明其具有靶向抗肿瘤效应和药物缓释特性。因此制备的靶向纳米药物ND-PEG-Tf-DOX，既能降低化疗药物对正常细胞的毒副作用，又能提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力。ND-PEG-Tf-DOX可在制备抗肿瘤药物中应用。
图1以H印G2和L-02细胞吸收FND-PEG-Tf的荧光强度为纵坐标做的柱状图。图2为FND-PEG-Tf作用于H印G2和L-02细胞的激光共聚焦成像3为载体FND-PEG-Tf进入细胞的吸收机理图。图4为MTT技术检测纳米药物的靶向抗肿瘤效应图。
具体实施例方式本发明提供的载体为纳米钻石(元素六，直径大约140nm，Ireland)。红色荧光纳米钻石材料为(United States Patent8168413)。所述的阿霉素是盐酸多柔比星，分子式为C27H29NO11.HCl,分子量为579.99,深圳万乐药业有限公司，规格按C27H29NO11 -HCl计算为10mg。聚乙二醇(PEG-4000)为Solarbio公司。人转铁蛋白(Tf，分子量80000)为Sigma公司。实施例1:(I)载体纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-OH)的制备将50.26mg羧基化的纳米钻石，在70°C真空干燥箱干燥一夜，置于3mL无水DMF溶液，超声分散形成悬浊液，接着悬浊液立即加入到25mL SOCl2，在70°C回流24h。反应完毕，上述混合液在40°C用旋转蒸发仪蒸发掉过量的SOCl2。接着，在(2)得到的产物中加入30mL无水DMF溶液，150.78mg PEG和6mL三乙胺，在90°C回流24h。最后，产物15000rpm离心5min，用重蒸水洗涤5次，除去上清液，获得纳米钻石_聚乙二醇真空干燥。(2)靶向载体纳米钻石-聚乙二醇-转铁蛋白(ND-PEG-Tf)的制备将10.8mg干燥的ND-PEG-OH在20mL DMF溶液中分散，超声分散30min形成悬浊液，接着加入25.6mg SA和24.4mg DMAP，在90°C回流24h。反应完毕，15000rpm离心，用重蒸水洗涤5次，除去上清液，获得ND-PEG-C00H沉淀物。将1.0mg干燥的ND-PEG-C00H在1.0mL硼酸(pH8.0)缓冲溶液中分散，超声分散30min形成悬浊液，2.0mg EDC接着加入此悬浊液，反应30min。然后，250 μ g Tf置于悬浊液中，在摇匀仪上摇匀过夜。最后，产物15000rpm离心5min,用重蒸水洗漆5次,除去上清液,沉淀物纳米钻石-聚乙二醇-转铁蛋白(ND-PEG-Tf)冷藏即可。使用考马斯亮蓝G250试剂(Bradford)测定偶联反应的上清液中Tf的含量来计算纳米钻石-聚乙二醇载体上Tf的偶联量，然后用偶联前的Tf量减去上清液的Tf量，即为纳米钻石-聚乙二醇偶联转铁蛋白含量，经计算获得每毫克纳米钻石-聚乙二醇载体偶联转铁蛋白约210微克。
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纳米钻石一聚乙二醇-转铁蛋白-阿霉素复合物(ND-PEG-Tf-DOX)的制备:(I)取2mg干燥的ND-PEG-Tf加入ImL蒸馏水，超声分散30min形成悬浊液，接着加入D0X80y g，室温下摇3h ；(2) 15000rpm离心5min,用重蒸水洗漆3次,除去上清液,沉淀物纳米钻石-聚乙二醇-转铁蛋白-阿霉素(ND-PEG-Tf-DOX)冷藏即可。用紫外可见光谱等手段检测阿霉素490nm峰位处的吸光度，计算DOX的吸附量，经计算获得每毫克ND-PEG-Tf吸附阿霉素约10微克。实施例2:(I)载体纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-OH)的制备同实施例1 ;(2)靶向载体纳米钻石一聚乙二醇-转铁蛋白(ND-PEG-Tf)的制备将10.8mg干燥的ND-PEG-OH在20mL DMF溶液中分散，超声分散30min形成悬浊液，接着加入25.6mg SA和24.4mg DMAP，在90°C回流24h。反应完毕，15000rpm离心，用重蒸水洗涤5次，除去上清液，获得ND-PEG-C00H沉淀物。将1.0mg干燥的ND-PEG-C00H在1.0mL硼酸(pH8.0)缓冲溶液中分散，超声分散30min形成悬浊液，2.0mg EDC接着加入此悬浊液，反应30min。然后，SOOyg Tf置于悬浊液中，在摇匀仪上摇匀过夜。最后，产物15000rpm离心5min,用重蒸水洗漆5次,除去上清液,沉淀物纳米钻石-聚乙二醇-转铁蛋白(ND-PEG-Tf)冷藏即可。使用考马斯亮蓝G250试剂(radford)测定偶联反应的上清液中Tf的含量来计算纳米钻石-聚乙二醇载体上Tf的量，然后用偶联前的Tf量减去上清液的Tf量，即为纳米钻石-聚乙二醇偶联转铁蛋白含量，经计算获得每毫克纳米钻石-聚乙二醇载体偶联转铁蛋白251微克。ND-PEG-Tf-DOX 的制备:(I)取2mg干燥的ND-PEG-Tf加入ImL蒸馏水，超声分散30min形成悬浊液，接着加入D0X100 μ g，室温下摇3h ；(2) 15000rpm离心5min,用重蒸水洗漆3次,除去上清液,沉淀物纳米钻石-聚乙二醇-转铁蛋白-阿霉素(ND-PEG-Tf-DOX)冷藏即可。用紫外可见光谱等手段检测阿霉素490nm峰位处的吸光度，计算DOX的吸附量，经计算获得每毫克ND-PEG-Tf吸附阿霉素约
10.1微克。实施例3:(I)载体纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-OH)的制备同实施例1 ;(2)靶向载体纳米钻石一聚乙二醇-转铁蛋白(ND-PEG-Tf)的制备将10.8mg干燥的ND-PEG-OH在20mL DMF溶液中分散，超声分散30min形成悬浊液，接着加入25.6mg SA和24.4mg DMAP，在90°C回流24h。反应完毕，15000rpm离心，用重蒸水洗涤5次，除去上清液，获得ND-PEG-C00H沉淀物。将1.0mg干燥的ND-PEG-C00H在1.0mL硼酸(PH8.0)缓冲溶液中分散，超声分散30min形成悬浊液，2mg EDC接着加入此悬浊液，反应30min。然后，1.0mg Tf置于悬浊液中，在摇匀仪上摇匀过夜。最后，产物15000rpm离心5min，用重蒸水洗涤5次，除去上清液，沉淀物纳米钻石-聚乙二醇_转铁蛋白(ND-PEG-Tf)冷藏即可。
使用考马斯亮蓝G250试剂(radford)测定偶联反应的上清液中Tf的含量来计算纳米钻石-聚乙二醇载体上Tf的量，然后用偶联前的Tf量减去上清液的Tf量，即为纳米钻石-聚乙二醇偶联转铁蛋白含量，经计算获得每毫克纳米钻石-聚乙二醇载体偶联转铁蛋白261微克。ND-PEG-Tf-DOX 的制备:(I)取2mg干燥的ND-PEG-Tf加入ImL蒸懼水,超声分散30min形成悬池液,接着加入DOX140 μ g，室温下摇3h ；(2) 15000rpm离心5min,用重蒸水洗漆3次,除去上清液,沉淀物纳米钻石-聚乙二醇-转铁蛋白-阿霉素(ND-PEG-Tf-DOX)冷藏即可。用紫外可见光谱等手段检测阿霉素490nm峰位处的吸光度，计算DOX的吸附量，经计算获得每毫克ND-PEG-Tf吸附阿霉素约
11.2微克。实施例4:靶向载体纳米钻石一聚乙二醇-转铁蛋白(ND-PEG-Tf)进入体外培养HepG2和L-02细胞量的差异取对数生长期的!fepG2和L-02细胞以2.0X 105/dish的密度接种于35_培养皿中，培养16h后，弃液，PBS洗涤，为了用流式细胞仪定量检测纳米颗粒进入细胞的量，本实验中用同样大小的红色荧光纳米钻石代替实施例3制得的FND-PEG-Tf，在上述两种细胞中分别加入FND-PEG-Tf (100 μ g/mL)于37°C孵育4h，孵育完毕，冷PBS洗涤，上流式细胞仪测定其红色突光强度(635nm激发波长,接受波长>650nm)。图1为FND-PEG-Tf作用于H印G2细胞和L_02细胞的流式细胞柱状图，纵坐标反映FND-PEG-Tf进入细胞的荧光强度。从图中可以看到，FND-PEG-Tf与细胞作用4h后，荧光强度均比细胞自发荧光强度大，且FND-PEG-Tf进入H印G2细胞的量是进入L-02细胞的量的2倍，而H印G2细胞表面的转铁蛋白受体高于L-02细胞表面的转铁蛋白受体，试验表明FND-PEG-Tf载体具有靶向特性。实施例5:定量检测体外培养H印G2细胞对纳米钻石一聚乙二醇一转铁蛋白(ND-PEG-Tf)摄取的靶向分析取对数生长期的H印G2细胞以2.0X 105/dish的密度接种于35mm培养皿中，培养16h后，弃液，PBS洗涤，为了用流式细胞仪定量检测纳米颗粒进入细胞的量，本实验中用同样大小的红色荧光纳米钻石代替实施例3制得FND-PEG-Tf。为进一步定量确定载体ND-PEG-Tf具有靶向特性，用游离转铁蛋白(Tf)做竞争剂。可以用此方法确定载体ND-PEG-Tf是否通过转铁蛋白受体介导进入细胞。由于含Fe3+形式的转铁蛋白与转铁蛋白受体结合能力大于空蛋白形式(apoTf)与转铁蛋白受体结合能力，而含Fe3+形式的转铁蛋白进入细胞后，将Fe3+释放，本身以不含Fe3+的空蛋白形式(apoTf)从细胞出来，而载体ND-PEG-Tf与单独转铁蛋白相比，进入细胞时间明显变慢，因此为使细胞外有足够的含Fe3+形式的转铁蛋白与转铁蛋白受体结合，占据转铁蛋白受体位点，达到与载体ND-PEG-Tf竞争转铁蛋白受体，所以本实验中首先加入不同浓度的游离转铁蛋白(100 μ g/mL, 300 μ g/mL, lmg/mL)于HepG2细胞，并同时加入
0.21 μ mol/mL Fe3+ 于 37°C孵育(λ 5h，接着加入 FND-PEG-Tf (100 μ g/mL)继续孵育 4h，仅加Λ FND-PEG-Tf (100 μ g/mL)于细胞中孵育4h，做为对照组。孵育完毕，冷PBS洗涤，上流式细胞仪测定其红色荧光强度(635nm激发波长，接受波长>650nm)。图2为考察载体FND-PEG-Tf进入细胞是否为转铁蛋白受体介导机制。由图可见，如果溶液中未加Fe3+，即使游离 转铁蛋白浓度提高，不能抑制载体FND-PEG-Tf进入细胞，而当溶液中加有Fe3+时，随着加入游离转铁蛋白浓度的提高，HepG2细胞对载体ND-PEG-Tf的吸收抑制程度越大，当游离转铁蛋白浓度达到lmg/mL时，细胞吸收抑制率达到80%，试验充分表明载体ND-PEG-Tf进入细胞主要为转铁蛋白受体介导机制。实施例6:体外培养H印G2和L_02细胞对纳米钻石一聚乙二醇一转铁蛋白(ND-PEG-Tf)摄取的定性观察取对数生长期的H印G2和L-02细胞以1.5X 105/dish的密度接种于含有盖玻片的35mm培养皿中，培养16h后，弃液，PBS洗涤，为了用激光共聚焦显微镜观察，本实验中用同样大小的红色荧光纳米钻石代替实施例3的不发光纳米钻石ND，制备得的FND-PEG-Tf。取制得的FND-PEG-Tf(100 μ g/mL)加入上述两种细胞于37°C孵育4h后，冷PBS洗涤，4%多聚甲醛室温固定8min，冷PBS冲洗细胞三次，取出盖玻片置于载玻片上，激光共聚焦显微镜下观察。为进一步确定载体ND-PEG-Tf具有靶向特性，采用激光共聚焦显微镜技术获得影像直观观察。本实验中首先加入游离转铁蛋白(lmg/mL)和0.21 μ mol/mL Fe3+于!fepG2细胞37 °C共同孵育0.5h，接着加入FND-PEG-Tf (100 μ g/mL)于!fepG2细胞在37 °C继续孵育4h。反应完毕，冷PBS洗涤，4%多聚甲醛室温固定8min，冷PBS冲洗细胞三次，取出盖玻片置于载玻片上，激光共聚焦显微镜下观察(见图3。激发波长为543nm,接受波长630-700nm)。图3为FND-PEG-Tf作用于H印G2和L-02细胞的激光共聚焦成像图。从图中可以看到，FND-PEG-Tf与H印G2细胞作用4h，在细胞质可见明亮的红色荧光信号，表明FND-PEG-Tf主要位于细胞质；而在L-02细胞内也可见红色荧光信号，但明显少于前者，表明FND-PEG-Tf载体被转铁蛋白受体表达多的HepG2细胞摄取多，进入转铁蛋白受体表达少的L-02细胞少。此外，游离转铁蛋白(Tf)做竞争剂试验，由图3可见，在游离转铁蛋白预饱和H印G2细胞转铁蛋白受体条件下，FND-PEG-Tf载体明显进入细胞的量减少，充分表明FND-PEG-Tf载体进入细胞主要为转铁蛋白受体介导机制。实施例7:ND-PEG-Tf-DOX对体外培养H印G2和L-02细胞活性的影响将对数生长期的H印G2细胞和L-02细胞(10%FBS/DMEM培养基，5%C02，37°C )按每孔5 X IO3个/200 μ L接种于96孔培养板培养24h后，换200 μ L10%FBS/DMEM培养基配制的各药物组(A:ND-PEG-Tf 组，200 μ g/mL ；B:ND-PEG_Tf-D0X组，200 μ g/mL ND-PEG-Tf+2 μ g/mLDOX ；C:D0X, 2 μ g/mLDOX), HepG2细胞和L_02细胞组为对照组，每组平行6孔，分别培养培养24、48和72h，再换新鲜培养基和MTT溶液，继续培养4h，然后弃去孔内培养液，每孔加入200yLDMS0，振荡lOmin，进行MTT检测，结果见图4。图4为各药物组对体外培养IfepG2细胞和L-02细胞增殖的影响。A药物组在选定浓度条件下，对细胞的影响基本没有变化(相对细胞对照组)，表明ND-PEG-Tf载体具有生物兼容性。在24h，B组对两种细胞活性的影响与对照组相比均没有明显差异，但随着时间的延长，B组对两种细胞活性的抑制明显大于对照组，且B组对H印G2细胞的杀伤力明显高于对L-02细胞的杀伤力，表明ND-PEG-Tf-DOX组药物能够有效杀死肿瘤细胞。在相同时间相同阿霉素浓度条件，C组药物对细胞的杀伤力均大于B组药物对两种细胞的杀伤力，表明ND-PEG-Tf-DOX药物具有缓释药物特性。因此表明ND-PEG-Tf-DOX药物既具有靶向抗肿瘤效应又具有缓释药物特性。
该方法制得的载体ND-PEG-Tf具有靶向载体特性，经体外细胞试验证实，该纳米载体主要是转铁蛋白受体介导进入细胞，因此制得的载体具有主动靶向性。以靶向载体通过物理吸附化疗药物阿霉素而制备成靶向纳米药物ND-PEG-Tf-DOX，用MTT测试ND-PEG-Tf-DOX与两种细胞作用，表明该纳米药物对癌细胞具有靶向抗肿瘤效应，其与单独阿霉素对细胞杀伤力相比，ND-PEG-Tf-DOX具有缓释药物特性。因此ND-PEG-Tf-DOX既能降低化疗药物对正常细胞的毒副作用，又能提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力。可在制备靶向抗肿瘤药物中应用。
权利要求
1.一种靶向纳米钻石载体ND-PEG-Tf，其特征在于，它是以纳米钻石为载体，聚乙二醇为桥梁，由转铁蛋白通过共价偶联形成靶向载体ND-PEG-Tf，其粒径大小为294.5 ±94.3nm。
2.如权利要求1所述的一种靶向纳米钻石载体ND-PEG-Tf的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将羧基化的纳米钻石，在70-80°C真空干燥箱干燥过夜，按每毫克羧基化的纳米钻石加入0.05-0.2mL的无水N，N 二甲基甲酰胺(DMF)溶剂，超声分散形成悬浊液，再按每毫克羧基化的纳米钻石加入0.4-0.6mL的二氯亚砜(SOCl2)，在65-70°C回流24h，在40_45°C下旋转蒸发掉过量的S OCl2，得到酰氯化的纳米钻石，按每毫克酰氯化的纳米钻石加入0.5-0.8mL的无水DMF溶剂得到酰氯化的纳米钻石悬浊液； (2)按酰氯化的纳米钻石与分子量为4000的PEG的质量比1:3-4，将PEG加入步骤(I)得到的酰氯化的纳米钻石悬浊液中，同时按每毫克酰氯化的纳米钻石加入0.1-0.2mL的三乙胺，在90°C回流24h, 15000rpm下离心5min,用重蒸水洗漆5次,除去上清液,得沉淀物纳米钻石-聚乙二醇ND-PEG-0H，真空干燥； (3)按每毫克ND-PEG-OH加入1.5_2mL的DMF溶剂，超声分散30min形成悬浊液，按ND-PEG-0H、琥珀酸酐(SA)和4-二甲胺基吡啶(DMAP)的质量比1:2_2.5 '2-2.5，分别加入SA和DMAP，在90°C回流24h ；15000rpm下离心，用重蒸水洗涤5次，除去上清液，获得ND-PEG-C00H沉淀物，真空干燥； (4)按每毫克ND-PEG-C00H加入0.3-0.5mL pH8.0的硼酸缓冲溶液，超声分散30min形成悬浊液，接着加入2倍ND-PEG-C00H质量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)，反应30min ； (5)然后，按ND-PEG-C00H与分子量为80KDa转铁蛋白(Tf)的质量比1:0.25_1，取Tf加入步骤(4)的反应液中，摇勻过夜；15000rpm离心5min,用重蒸水洗漆5次,除去上清液，得沉淀物纳米钻石-聚乙二醇-转铁蛋白(ND-PEG-Tf)冷藏即可。
3.一种靶向药物ND-PEG-Tf-DOX的制备方法，其特征在于，步骤如下: (1)按每毫克干燥的ND-PEG-Tf加入0.5-lmL蒸馏水，超声分散30min形成悬浊液，接着按ND-PEG-Tf与阿霉素(DOX)质量比100:4_7加入D0X，室温下摇3h ； (2)15000rpm离心5min,用重蒸水洗漆3次，除去上清液,沉淀物纳米钻石-聚乙二醇-转铁蛋白-阿霉素(ND-PEG-Tf-DOX)冷藏即可。
全文摘要
本发明提供了一种靶向纳米钻石载体ND-PEG-Tf及其制备方法，以及采用物理吸附负载化疗药物阿霉素制备而成的靶向纳米药物ND-PEG-Tf-DOX。该载体通过与人肝癌细胞(HepG2)和正常肝细胞(L-02)作用，且用游离转铁蛋白做竞争剂，结果显示ND-PEG-Tf载体是转铁蛋白受体介导进入细胞；用MTT测试ND-PEG-Tf-DOX与两种细胞作用，表明该纳米药物对癌细胞具有靶向抗肿瘤效应，其与单独阿霉素对细胞杀伤力相比，ND-PEG-Tf-DOX具有缓释药物特性。因此ND-PEG-Tf-DOX既能降低化疗药物对正常细胞的毒副作用，又能提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力。可在制备靶向抗肿瘤药物中应用。
文档编号A61K47/42GK103203024SQ20131012491
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者李英奇, 王东新, 杨斌盛 申请人:山西大学