专利名称：藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法
技术领域：
本发明涉及动物克隆技术一手导式克隆技术(Handmade cloning)的细胞融合 技术环节，尤其涉及藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法。
背景技术：
动物克隆的研究对生物医药、治疗性克隆的探索、模式生物的建立以及畜牧业生 产等具有重要的意义，可实现动物克隆的技术手段包括传统的依赖于显微操作系统的核移 植技术和2004年最新发明的手导式克隆技术。相对于显微操作系统，手导式克隆技术的优 点在于其仅用一个刀片就能完成卵母细胞的去核，且去核效率高，整个克隆程序耗时少，成 为一种可能代替显微操作技术的新方法。该方法主要技术环节包括供体细胞培养、卵母细 胞体外成熟、卵母细胞去核、细胞融合、种间克隆胚的激活与体外培养。其中细胞融合技术 为手导式克隆技术的难点，通常手导式克隆技术中细胞融合时的技术要求特别高，耗时长， 电场对融合细胞的作用时间长。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提高融合效率的藏羚羊成纤维细胞与受 体卵母细胞的化学辅助融合方法。为解决上述问题，本发明所述的一种藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅 助融合方法，包括以下步骤(1)供体细胞和受体细胞的选择供体细胞选择藏羚羊成纤维细胞，并将其培养 在24孔板中；受体卵母细胞选择山羊、牦牛、黄牛或奶牛卵母细胞中的任意一种；(2)制作体积为25 μ L的融合微滴； (3)供体细胞与受体卵母细胞的融合依次将受体卵母细胞移至Τ20、植物血凝 素、Τ2Β、融合液微滴内进行操作，形成两个卵母细胞夹杂一个供体细胞的复合体；将复合体 移至融合液内平衡2 3min后，再至融合槽内进行电融合即可。所述步骤(3)中的T20是由占总溶液体积的20%的胎牛血清(FBS)和80%的含 IOmM羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置后加入双抗，然后用NaOH调节 PH值至7. 2 7. 4的溶液；其中双抗是指75 μ g/mL的青霉素和100 μ g/mL的链霉素。所述步骤(3)中的植物血凝素是由5mg植物血凝素溶于5mL TCM199基础培养液 中所得的溶液。所述步骤(3)中的T2B是指在TCM199基础培养液中加入总溶液体积的2%的胎牛 血清(FBS)和8mg/mL牛血清白蛋白(BSA)所得的溶液。所述步骤(3)中的融合液是指先用20mL蒸馏水溶解0. 025g MgSO4,过滤保存； 再用20mL蒸馏水溶解0.0147g CaCl2 · 2H20，过滤保存；将10. 93g甘露醇和0. 2g聚乙 烯醇(PVA)充分溶解于196mL蒸馏水中，然后向其分别加入2mL预先配制好的MgSO4和 CaCl2 · 2H20溶液，过滤后即得。
所述步骤(3)中的电融合的条件是交流电场7V，脉冲电场70V，持续时间20μ s，持 续两次，每次间隔0. Is。本发明与现有技术相比具有以下优点1、由于本发明以化学试剂——植物血凝素为辅助试剂，因此，改进了以往手导式 克隆技术中低效率的细胞融合方式，使得藏羚羊成纤维细胞与山羊、牦牛、黄牛和奶牛卵 母细胞在植物血凝素的辅助下高效融合，其融合率分别达到98. 25%,99. 00%,97. 71%和 93. 17%，从而提高了克隆动物的整体效率。2、由于本发明采用融合前先用植物血凝素处理使两个卵母细胞和一个体细胞粘 附形成三元复合体，然后再进行融合，因此，有效地降低了操作难度，缩减了操作时间。3、由于本发明采用上覆石蜡油的微滴进行操作，因此，防止了蒸发和潜在的污染， 提高了体外操作溶液的稳定性。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细的说明。图1为本发明中用两个去核卵母细胞和一个藏羚羊成纤维细胞在植物血凝素的 辅助下在电场的作用下正在进行融合。图2为采用本发明方法融合的两个去核卵母细胞与一个藏羚羊成纤维细胞，经过 细胞核荧光染色证实已经完全融合。
具体实施例方式一种藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，包括以下步骤(1)供体细胞和受体细胞的选择供体细胞选择藏羚羊成纤维细胞，并将其培养在24孔板中；核移植时选择培养孔 内底部全部长满的细胞作为供体细胞。每次消化1孔细胞，然后将少量细胞移入到T2B的 微滴中。受体卵母细胞选择山羊、牦牛、黄牛或奶牛卵母细胞中的任意一种。(2)在60mm培养皿内按常规方法制作体积为25 μ L的融合微滴。(3)供体细胞与受体卵母细胞的融合依次将受体卵母细胞移至Τ20、植物血凝 素、Τ2Β、融合液微滴内进行操作，微滴上覆石蜡油，避免微滴蒸发和位置移动。先将受体卵母细胞移至Τ20微滴内，再移一个受体卵母细胞至植物血凝素微滴 内，然后转移到Τ2Β微滴中粘取一个供体细胞，再重新转移至植物血凝素微滴中，再从Τ20 微滴中移一个受体卵母细胞至植物血凝素微滴中，由于植物血凝素可使细胞表面具有粘 性，所以通过调整供体细胞与受体卵母细胞复合体和另一卵母细胞的位置，可形成两个卵 母细胞夹杂一个供体细胞的复合体；将复合体移至融合液内平衡2 3min后，再至融合槽 内以交流电场7V，脉冲电场70V，持续时间20 μ s，持续两次，每次间隔0. Is进行电融合即可 (参见图1、图2)。其中Τ20是由占总溶液体积的20%的胎牛血清和80%的含IOmM羟乙基哌嗪乙 磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置后加入双抗，然后用NaOH调节ρΗ值至7. 2 7. 4 的溶液；其中双抗是指75 μ g/mL的青霉素和100 μ g/mL的链霉素。
植物血凝素是由5mg植物血凝素溶于5mL TCM199基础培养液中所得的溶液。该 植物血凝素以50 μ L分装于离心管中，并在-20°c保存、待用。T2B是指在TCM199基础培养液中加入总溶液体积的2 %的胎牛血清(FBS)和8mg/ mL牛血清蛋白(BSA)所得的溶液。融合液是指先用20mL蒸馏水溶解0. 025g MgSO4,过滤保存；再用20mL蒸馏水溶 解0. 0147g CaCl2 · 2H20,过滤保存；将10. 93g甘露醇和0. 2g PVA充分溶解于196mL蒸馏 水中，然后向其分别加入2mL预先配制好的MgSO4和CaCl2 · 2H20溶液，过滤后即得。该融 合液以IOmL分装于离心管中，并在-20°C保存、待用。
权利要求
一种藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，包括以下步骤(1)供体细胞和受体细胞的选择供体细胞选择藏羚羊成纤维细胞，并将其培养在24孔板中；受体卵母细胞选择山羊、牦牛、黄牛或奶牛卵母细胞中的任意一种；(2)制作体积为25μL的融合微滴；(3)供体细胞与受体卵母细胞的融合依次将受体卵母细胞移至T20、植物血凝素、T2B、融合液微滴内进行操作，形成两个卵母细胞夹杂一个供体细胞的复合体；将复合体移至融合液内平衡2～3min后，再至融合槽内进行电融合即可。
2.如权利要求1所述的藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，其特 征在于所述步骤(3)中的T20是由占总溶液体积的20%的胎牛血清和80%的含IOmM羟 乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置后加入双抗，然后用NaOH调节pH值 至7. 2 7. 4的溶液；其中双抗是指75 μ g/mL的青霉素和100 μ g/mL的链霉素。
3.如权利要求1所述的藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，其特 征在于所述步骤(3)中的植物血凝素是由5mg植物血凝素溶于5mL TCM199基础培养液中 所得的溶液。
4.如权利要求1所述的藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，其特 征在于所述步骤(3)中的T2B是指在TCM199基础培养液中加入总溶液体积的2%的胎牛 血清和8mg/mL牛血清白蛋白所得的溶液。
5.如权利要求1所述的藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，其特 征在于所述步骤(3)中的融合液是指先用20mL蒸馏水溶解0.025g MgSO4，过滤保存；再用 20mL蒸馏水溶解0. 0147g CaCl2 · 2H20,过滤保存；将10. 93g甘露醇和0. 2g聚乙烯醇充分 溶解于196mL蒸馏水中，然后向其分别加入2mL预先配制好的MgSO4和CaCl2 · 2H20溶液， 过滤后即得。
6.如权利要求1所述的藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，其特 征在于所述步骤(3)中的电融合的条件是交流电场7V，脉冲电场70V，持续时间20ys，持 续两次，每次间隔0. Is。
全文摘要
本发明涉及一种藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，该方法包括以下步骤(1)供体细胞和受体细胞的选择供体细胞选择藏羚羊成纤维细胞，并将其培养在24孔板中；受体卵母细胞选择山羊、牦牛、黄牛或奶牛卵母细胞中的任意一种；(2)制作体积为25μL的融合微滴；(3)供体细胞与受体卵母细胞的融合依次将受体卵母细胞移至T20、植物血凝素、T2B、融合液微滴内进行操作，形成两个卵母细胞夹杂一个供体细胞的复合体；将复合体移至融合液内平衡，再至融合槽内进行电融合即可。本发明有效地提高了细胞融合效率、降低了操作难度、缩减了操作时间，从而优化了手导式克隆技术细胞融合的技术环节。
文档编号C12N15/06GK101906412SQ20101020182
公开日2010年12月8日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者于鸿浩, 徐世晓, 曹俊虎, 赵新全, 郭志林, 郭松长 申请人:中国科学院西北高原生物研究所