专利名称：抗fgf23抗体和含有该抗体的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可以与FGF23抗原特异性结合的抗FGF23抗体。而且，本发明还涉及ー种可用于预防或治疗FGF23过量引起的或其他原因引起的矿物质代谢紊乱的药物，其包含抗FGF23抗体作为活性成分。尤其是，本发明涉及一种用于治疗低血磷症性佝偻病(hypophosphatemic ricket)和软骨病(osteomalachia)的药物。
背景技术：
作为ー种可以刺激成纤维细胞系NIH3T3细胞增长的物质，成纤维细胞生长因子 首次分离纯化自牛垂体。然后，从不同组织中分离出多种类似的蛋白质，这些蛋白质产物组成了一个多肽家族(FGF家族)。到目前为止，在脊椎动物中，得到分离纯化的FGF家族成员已有22种蛋白质。关于这些蛋白质的生物学活性，目前已知，其不仅具有成纤维细胞生长活性，还具有多种其它不同功能如中胚层和神经外胚层生长活性，血管生成活性，特定发育阶段肢芽形成活性等。FGF的基因表达也具有位置和时间差异性。它通常仅仅表达于特定发育阶段或成人的某些位点。目前已知，至少有四个编码FGF受体的基因，FGFRl, FGFR2，FGFR3，和FGFR4。另外，关于FGFR1，FGFR2，FGFR3，已知的是，对于每ー种受体，由于不同的剪切方式，产生的受体蛋白具有不同的胞外结构域。另外，目前已知，肝素和硫酸こ酰肝素蛋白聚糖通过与FGF和FGF受体的相互作用而控制其活性。另外，还有很多虽因具有与FGF相似的结构，而属于FGF家族，但其生物学活性和受体结合特性等几乎不明。有ー篇综述(详情请看文献Ornitz, D.等,Genome biology, 2 :3005. 1-3005. 12,2001)总结了这些FGF家族成员的特性。FGF23 ( 一般来讲，有时候也被记作FGF-23)的首次克隆是利用FGF15同源性的数据库搜索和PCR方法自小鼠获得的。随后，利用小鼠FGF23同源序列，人FGF23也得到克隆。人FGF23是一条由251个氨基酸残基组成的多肽。另外，预计，作为分泌信号序列，在蛋白质分泌时，多肽N-末端由多达24个氨基酸组成的氨基酸序列被剪切(详情请看文献Yamashita, T.等，Biochem. Biophy. Res. Commun. , 277 :494-498, 2000)。然后，对常染色体显性型低血磷症性佝偻病/软骨病(以下称作ADHR)的研究发现，ADHR病人的基因突变区域变窄(narrow down)，随着相关基因鉴定的进展，发现ADHR病人的FGF23基因发生了一个导致此现象的特有的错义突变(详情请看文献White, K. E.等，Nature Genet. ,26 345-348, 2000) 0这些发现强烈表明，FGF23在体内具有重要的生理学意义。另ー方面，是什么在决定FGF23的生物学活性，这通过低血磷症性佝偻病和软骨病的一种类型-肿瘤性软骨病(neoplastic osteomalachia)得到了研究。在这些疾病中，恶性肿瘤产生和分泌一种液态疾病起始因子，正如所想的那样，像低血磷症性佝偻病和软骨病等疾病是由此疾病起始因子导致的。
在对所述由恶性肿瘤产生的疾病起始因子的研究中，FGF23作为ー种在肿瘤中过量表达的基因被克隆。此外，通过给予这种因子，低血磷症性佝偻病/软骨病被重现(详情请看文献 Shimada, T.等，Proc. Natl. Acad. Sci.，98 :6500-6505, 2001 以及 InternationalPublication Number W002/14504 pamphlet)。基于以上研究表明，在体内，FGF23表现出与磷和钙元素相关的的代谢控制有关的生物学功能。另外，由此表明，作为系统性因子，FGF23通过体内循环来实现自己功能。此外，最近的研究显示与健康人相比，肿瘤性软骨病患者血管中 FGF23 浓度更高(详情请看文献 Yamazaki, Y.等，J. Clin. Endocrinol. Metab. ,87 4957-4960，2002 以及 Jonsson, K. B.，等，N. Engl. J. Med.，348 1656-1663，2003)。此外，已知X染色体-连锁遗传的低血磷症性佝偻病(以下称为XLH)是ー种在临床上与ADHR和肿瘤性软骨病患者具有相似表现的疾病。患有这种疾病的患者血液中也含有高水平的 FGF23 (详情请看文献 Yamazaki, Y.等，J. Clin. Endocrinol. Metab. ,87 4957-4960，2002 以及 Jonsson, K. B.，等，N. Engl. J. Med.，348 1656-1663，2003)。换句话说，在肿瘤性软骨病和XLH等疾病中发现的维生素D耐受性佝偻病和软骨病的病因先前并不清楚，但而今表明此分泌性致病因子正是FGF23。此外，在关 于其它类型的矿物质代谢性疾病如骨纤维性结构不良、麦-奥ニ氏综合征、常染色体隐性低血磷症性佝偻病等疾病的研究中，也有过有关血液中高浓度的FGF23与低血磷症(hypophosphatemia)、拘偻病和软骨病的相关性报道(详情请看文献Riminucci,M.等，J. Clin. Invest. , 112 :683-692, 2003 ；Yamamoto, T.等，J. Bone Miner. Metab. ,23 231-237, 2005 ；Lorenz-Depiereux, B.等，Nat. Genet.，38 :1248-1250,2006)。以上报道表明，体内过量表达FGF23会导致低血磷症、低血磷症伴随性佝偻病和软骨病等疾病。此外，有报道表明，慢性肾功能不全性高血磷症患者的血清中出现反常高水平FGF23。有证据证明FGF23的过量表达可能与慢性肾功能不全时发生的部分矿物质代谢疾病有关(详情请看文献 Gupta, A.等，J. Clin. Endocrinol. Metab. ,89 :4489-4492,2004,Larsson, T.等，Kidney Int. , 64 :2272-2279, 2003)。由于引起这些疾病的原因是FGF23的过量表达，那么抑制FGF23的活性或消除FGF23就可能成为治疗这些疾病的办法。到目前为止，已见有抗-FGF23小鼠单克隆抗体用于抑制FGF23活性的研究报道(详情请看文献Yamashita, T.等，Biochem. Biophy. Res.Commun.，277 :494_498，2000)。在这篇报道中，当将抗-FGF23鼠单克隆抗体2C3B和3C1E给予正常小鼠时，小鼠内源性FGF23功能被抑制，通过肾完成的磷排泄也被抑制。通过干扰肾中维生素D代谢酶的表达，干扰结果表明血清中磷和Ia，25_ ニ羟维生素D(以下记作1，25D)的浓度升高。此外，将抗-FGF23鼠单克隆抗体重复给予Hyp小鼠，所述Hyp小鼠是ー种具有高水平FGF23血清，低血磷症，骨延长机能障碍和钙化机能障碍的XLH疾病的模型小鼠，其结果，可以看到小鼠血液中磷浓度升高，而且，骨延长机能障碍和钙化机能障碍症状得到改善。通过这些结果可以看到，FGF23活性抑制性抗体作为ー种用于FGF23过量表达型疾病的治疗药物是可行的。然而，在文献报道中所用到的2C3B和3C1E抗体是鼠源抗体。鼠源抗体会被人宿主当做异物从而导致人宿主产生ー种所谓的“人抗鼠抗体”(也即是HAMA)反应,这可能会导致严重的副作用(详情请看文献Van Kroonenbergh7M. J.等,Nucl.Med. Commun. 9 :919-930,1988)。为避免产生这种问题，一种解决方法是研制嵌合型抗体(详情请看欧洲专利申请公告号120694说明书和欧洲专利申请公告号125023说明书)。嵌合型抗体包含来源于两个或两个以上物种的抗体片段(如鼠源抗体可变区和人源抗体恒定区等)。这种类型的嵌合型抗体的优势是原鼠源抗体的对抗原的结合特性得到保留。但是，另一方面，嵌合型抗体仍然会诱导人宿主产生“人抗嵌合型抗体”(也即是“HACA”)反应(详情请看文献Bruggemann, M.等，J. Exp. Med.，170 :2153-2157,1989)。此外，已经有重组型抗体被研制出来，其中，只有取代型抗体的一部分是互补决定区(complementarity determining region, CDR)(详情请看英国专利号 GB2188638A 专利说明书和美国专利号5585089专利说明书)。应用CDR移植技术，制成一种由鼠CDR、人可变构架区和恒定区组成的抗体(也即是人源化抗体)(详情请看文献Riechmann, L.等，Nature, 332 :323_327，1988)。目前已经知道，使用上述方法，抗-FGF23鼠源抗体(如2C3B抗体等)可通过人抗体序列取代鼠源抗体而被人源化。然而，在发生人源化时，有可能导致对抗原的亲和性降低。、
另外，目前对由XLH等类似疾病引起的低血症性佝偻病的主要治疗方法是定期ロ服给药维生素D制剂和磷酸。但是，这种治疗手段会导致ー个问题，也即是这会导致患者及其家庭要承受由每天用药次数和剂量決定的相当大的负担。因此，为减轻患者及其家庭承受的这种负担，需要对血清磷酸盐浓度和血清1，25D浓度有长时间持续性增长作用的(sustained raising action)低血磷症治疗性药物,从而延长给药之间的间_时间。
发明内容
本发明的目的是提供人抗FGF23抗体及其药物组合物，所述药物组合物例如用于预防或治疗等作用并且几乎没有副作用的药物，其通过利用所述抗体抑制FGF23作用并由此预防和治疗疾病。此外，本发明的目的是提供ー种抗体，所述抗体是能用作低血磷症治疗药物的抗-FGF23抗体，与现有的抗-FGF23抗体相比，它仅使用单ー剂量即可产生对血清磷酸盐(phosphate)浓度和血清1，2 浓度的更长时间的持续增长作用。本发明的另ー个目的是提供ー种药物组合物，例如使用所述抗体用于预防和治疗FGF23相关性疾病的药物。目前，低血磷症性佝偻病的主流治疗手段是每天数次定期ロ服维生素D和磷酸盐的给药方式。然而，每天数次的大剂量ロ服药物，产生ー个问题，也即病人被迫承受ー个大的负担。本发明获得的抗-FGF23人单克隆抗体，ClO抗体，被证实具有对血清磷酸盐浓度和血清1，2 浓度的更长时间持续增长作用。这些表明，与目前已有的低血磷症治疗性药物相比，ClO抗体可望在治疗上具有明显的优越性。本发明如下[I] 一种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其含有杂交瘤细胞ClO (索取号FERM BP-10772)产生的抗体的重链可变区和/或轻链可变区。[2] 一种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其含有SEQ ID NO 12的从第20位Q到第136位S的氨基酸序列所示的重链氨基酸序列和/或SEQ ID NO 14的从第23位A到第128位K的氨基酸序列所示的轻链氨基酸序列。[3] 一种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其中，所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段含有重链可变区和/或轻链可变区氨基酸序列；且此重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :12的从第20位Q到第136位S的氨基酸序列所示，此轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO 14的从第23位A到第128位K的氨基酸序列所示。[4]由杂交瘤细胞ClO (索取号FERM BP-10772)产生的抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段。[5] ー种抗体或此抗体的功能性片段，其结合于人FGF23上的全部或部分表位，所述人FGF23上的全部或部分表位结合由杂交瘤细胞ClO (索取号FERM BP-10772)产生的抗体。[6] 一种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其含有在上述[3]中所述的重链可变区，该重链可变区具有任何ー个或所有以下互补决定区(OTR):由SEQ ID N0:40的氨基酸序列所示的互补决定区(⑶幻1，由SEQ ID NO 41的氨基酸序列所示的⑶R2，以及由SEQ ID NO 42的氨基酸序列所示的CDR3。 [7] 一种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其含有在上述[3]中所述的轻链可变区，该轻链可变区具有任何ー个或所有以下互补决定区(CDR):由SEQ ID N0:43的氨基酸序列所示的互补决定区(⑶幻1，由SEQ ID NO 44的氨基酸序列所示的⑶R2，以及由SEQ ID NO 45的氨基酸序列所示的CDR3。[8] 一种抗人FGF23抗体或该抗体的功能性片段，所述抗人FGF23抗体或该抗体的功能性片段含有重链可变区，该重链可变区具有任何ー个或所有以下互补决定区(CDR)由SEQ ID NO 40的氨基酸序列所示的互补决定区(CDR) 1，由SEQ ID NO 41的氨基酸序列所示的⑶R2，以及由SEQ ID NO 42的氨基酸序列所示的⑶R3 ;所述抗人FGF23抗体或该抗体的功能性片段还含有轻链可变区，该轻链可变区具有任何ー个或所有以下互补决定区(CDR):由SEQ ID NO :43的氨基酸序列所示的互补决定区(CDR) 1，由SEQ ID NO :44的氨基酸序列所示的⑶R2，以及由SEQ ID NO 45的氨基酸序列所示的⑶R3。[9]如[1]-[8]中任何ー项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其中所述功能性片段是选自Fab、Fab'、F(ab' )2、ニ硫键稳定的Fv(dsFv)、ニ聚化的V区域(双体)、单链Fv (scFv)和CDR的肽段。[10]如[1]-[8]中任何ー项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其包含重链和/或轻链，所述重链和/或轻链具有的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基被缺失、取代或添加。[11]如[I]-[10]中任何ー项所述抗人FGF23抗体，其中，所述抗体的种类是IgG、IgA、IgE 或 IgM。[12]如[11]所述抗人？6 23抗体，其中，所述抗体的亚类是1861、1862、化63、或IgG4。[13] ー种药物组合物，其含有如[1]_[12]中任何ー项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段作为活性成分。[14] ー种药物组合物，其可通过FGF23控制磷代谢和/或维生素D代谢并含有如[1]-[12]中任何ー项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段作为活性成分。[15] ー种用于矿物质代谢紊乱相关性疾病的预防或治疗的药物组合物，其含有如[1]-[12]中任何ー项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段作为活性成分。[16]如[15]所述药物组合物，其中，所述矿物质代谢紊乱相关性疾病选自肿瘤性软骨病、ADHR、XLH、骨纤维性结构不良、麦-奥ニ氏综合征和常染色体隐性低血磷症。[17] ー种药物组合物，其用于预防或治疗选自骨质疏松症、佝偻病、高钙血症、低钙血症、异位钙化症、骨硬化、派杰病、甲状旁腺机能亢进症、甲状旁腺机能減退症和搔痒症的疾病，此药物组合物含有如[1]_[12]中任何一项所述的抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段作为活性成分，[18]杂交瘤细胞 ClO (索取号 FERM BP-10772)。[19] 一种编码重链可变区氨基酸序列的核酸，其中，此重链可变区氨基酸序列由SEQ ID NO : 11所示从第58位C到第408位A的碱基序列编码。[20] 一种编码轻链可变区氨基酸序列的核酸，其中，此轻链可变区氨基酸序列由
SEQ ID NO 13所示从第67位G到第384位A的碱基序列编码。[21] ー种载体，其含有如[19]或[20]中所述核酸。[22] ー种宿主细胞,其含有如[21]中所述载体。[23] 一种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段的制造方法，包括步骤培养如中所述的宿主细胞以表达抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段。
图I为ClO表达载体构建过程示意2显示的是N5KG1_C10_LH中抗体重链基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 30)和氨基酸序列(SEQ ID NO 31)。图中矩形框标记的氨基酸序列为分泌信号序列(前导序列)。图3显示的是N5KG1_C10_LH中抗体轻链基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 32)和氨基酸序列(SEQ ID NO 33)。图中矩形框标记的氨基酸序列为分泌信号序列(前导序列)。图4显示的是ClO表达载体的结构。图5A显示的是用夹心酶联免疫分析法(ELISA法)对纯化得到的全长人FGF23蛋白进行检测所得到的測定结果，其中利用2C3B抗体或ClO抗体作为固定抗体，3C1E抗体为检测抗体。图5B显示的是用夹心酶联免疫分析法(ELISA法)对表达FGF23的猕猴(cynomolgus monkey)细胞培养物上清液检测后所得到的测定结果,其中利用2C3B抗体或ClO抗体作为固定抗体，3C1E抗体为检测抗体。图6中图表所显示的是对猕猴作2C3B抗体或ClO抗体给药时，随时间推移在不同时间点猕猴血清磷浓度的检测結果。測定值以平均值+/_标准误差表示。此外，用斯氏T检验法(Student-test)检验其与溶剂给药组的显著差异,对有显著差异(P <0.05)的测定值在图表中标上*号。图7中图表所示为以对猕猴溶剂给药5天后，猕猴血清磷浓度为基准，对猕猴作可溶性2C3B抗体或ClO抗体给药5天后，猕猴血清磷浓度的升高。图8中图表所示为对猕猴作溶剤、2C3B抗体或ClO抗体给药吋，随时间推移在不同时间点猕猴血清1，2 浓度的检测結果。測定值以平均值+/_标准误差表示。此外，用斯氏T检验法在同一天进行测试组与溶剂给药组之间的显著性差异测试吋，对有显著差异(P < O. 05)的测定值在图表中标上*号。图9中图片显示的是用C15抗体和蛋白质杂交(Western blotting)技术,检测非強制性表达的细胞培养物上清液(作为对照)、表达FGF23的人细胞培养物上清液和表达FGF23的猕猴细胞培养物上清液。图10显示的是pPSs FGF23载体的结构。图11显示的是pUS FGF23 KI载体的结构。图12所为3种等位基因结构一种等位基因结构为其中的药物抗性基因(loxp-pec/)被定向，ー种等位基因结构为其中的人FGF23(-SP)+药物抗性基因(loxp-peor)通过pUS hFGF23 KI载体被定向，ー种等位基因结构为其中的药物抗性基因(loxp-peor>loxpv-puror)被敲除，以及DNA印迹分析用探针的位置。对图中出现的专有名词的详细解释如下
hFGF23(_SP):缺少特定的信号肽编码区的人FGF23基因。Ck :小鼠IgK基因恒定区。loxpv-puro :其两端带有Ioxpv序列的嘌呤霉素抗性基因,所述Ioxpv序列是具有部分突变的Ioxp序列。loxp-nec/ :其两端带有Ioxp序列的新霉素磷酸转移酶抗性基因。Ck3 '探针DNA印迹(Southern blotting)分析探针，用于筛选hFGFZSdPHloxpv-purc/基因的转入和loxpv-puro1基因的敲除克隆。3' KO-探针DNA印迹分析探针，用于筛选loxp-nec/基因的转入和敲除克隆。E =EcoRI限制酶切位点。图13中图表显示的是对照抗体或ClO抗体给药处理前7天的血清FGF23浓度的检测結果。測定值以平均值+/_标准误差表示。此外，用斯氏T检验法(Student’s t-test)检验测试组与野生型小鼠组的显著差异，对有显著差异(P<0. 001)的组在图表中标上***号。图14中图表显示的是对照抗体或ClO抗体给药处理前7天和对照抗体或ClO抗体首次给药处理3天后的血清磷酸盐浓度检测結果。測定值以平均值+/_标准误差表示。此外，用斯氏T检验法检验测试组与野生型小鼠组的显著差异，对有显著差异(P < O. 001)的组在图表中标上号。另外，一天中检验hFGF23KI型小鼠对照抗体给药组与测试组之间的显著差异时，对有显著差异(P < O. 001)的hFGF23KI型小鼠ClO抗体给药组在图表中标上###号。图15中图表显示的是第五次对照抗体或ClO抗体给药处理I天后血清磷浓度检测結果。測定值以平均值+/-标准误差表示。此外，用斯氏T检验法检验测试组与野生型小鼠组的显著差异，对有显著差异(P <0.001)的组在图表中标上***号。另外，检验hFGF23KI型小鼠对照抗体给药组与测试组之间的显著差异时，对有显著差异(P < 0. 001)的hFGF23KI型小鼠ClO抗体给药组在图表中标上###号。图16中图表显示的是第四次对照抗体或ClO抗体给药处理I天后动物握力试验检测結果。測定值以平均值+/-标准误差表示。此外，用斯氏T检验法检验测试组与野生型小鼠组的显著差异，对有显著差异(p<0.001)的组在图表中标上***号。此外，检验hFGF23KI型小鼠对照抗体给药组与测试组之间的显著差异时，对有显著差异(P < 0. 001)的hFGF23KI型小鼠ClO抗体给药组在图表中标上###号。图17所示的是小鼠股骨组织染色图像，所用的股骨来自于第五次对照抗体或ClO抗体给药处理I天后的小鼠，其中使用的染色方法为Villanueva-Goldner染色法。图18中图表显示的是小鼠胫骨灰烬重量占胫骨干重的比值测定结果，其中所用的股骨来自于第五次对照抗体或ClO抗体给药处理I天后的小鼠。測定值以平均值+/-标准误差表示。此外，用斯氏T检验法检验测试组与野生型小鼠组的显著差异，对有显著差异(P < O. 001)的组在图表中标上号。另外，检验hFGF23KI型小鼠对照抗体给药组与测试组之间的显著差异时，对有显著差异(P < O. 001)的hFGF23KI型小鼠ClO抗体给药组在图表中标上###号。[序列表纯文本]SEQ ID NO : 1-3、5-27、30-33、44_50 合成
具体实施例方式下面，通过对本发明中所用到的专有名词定义的阐述，对本发明作详细说明。 I、本发明中的抗体I.抗-FGF23抗体和它的功能性片段本发明所述抗体是抗-FGF23抗体，其是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的成员。在本发明中，抗FGF23抗体与FGF23或其部分相结合，对FGF23或其部分具有反应活性，或识别FGF23或其部分。抗FGF23抗体也被称为抗-FGF23抗体。在本发明中，抗体是免疫球蛋白，其中，组成该免疫球蛋白的重链可变区、重链恒定区、轻链可变区、轻链恒定区的所有结构区域均来自于编码此免疫球蛋白的基因。此抗体优选单克隆抗体。在这里，FGF23的部分表示SEQ ID NO 4所示的FGF 23全长氨基酸序列的一部分氨基酸序列，且此部分是包括连续性氨基酸序列的FGF 23肽段。优选此抗体含有SEQ ID NO : 12中从第20位Q到第136位S的氨基酸序列和/或SEQ ID NO 14中从第23位A到第128位K的氨基酸序列。此抗体更优选是由杂交瘤细胞ClO产生的抗体。SEQ ID NO :12是包含前导序列在内的抗FGF 23抗体的重链可变区的氨基酸序列，SEQ ID NO 12中从第20位Q到第136位S的氨基酸序列是此氨基酸序列被剪去前导序列后形成的成熟氨基酸序列片段。另外，SEQ ID NO : 14是包含前导序列在内的抗FGF 23抗体的轻链可变区的氨基酸序列，SEQ IDNO 14中从第23位A到第128位K的氨基酸序列是此氨基酸序列被剪去前导序列后形成的成熟氨基酸序列片段。关于抗体类型，免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E(IgE)和免疫球蛋白M(IgM)均可被使用。优选免疫球蛋白G(IgG)，进ー步地，对于免疫球蛋白G(IgG)的亚类，1861、1862、1863、1864均可被使用，优选1861、化62和IgG4。更优选 IgGl。本发明所述抗体也包括抗FGF23抗体，此抗体含有新型互补决定区(OTR)氨基酸序列。CDR存在于抗体可变区，这部分结构提供抗原识别特异性。可变区的互补决定区之外的部分起到保持互补决定区结构的作用，被称为框架区(framework region, FR)。恒定区存在于重链和轻链的C-末端，且分别称为重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)。出现在重链可变区的互补决定区是互补决定区1(⑶R1)、互补决定区2(⑶R2)和互补决定区3(⑶R3)。在重链可变区的这3种互补决定区一起被称为重链互补决定区。同样地，出现在轻链可变区的的3种互补决定区是互补决定区I (⑶Rl)、互补决定区2(⑶R2)和互补决定区3(CDR3)。在轻链可变区中的这3种互补决定区一起被称为轻链互补决定区。这些互补决定区的序列可利用在美国公共卫生和人类服务部(1991)的“具有免疫学重要性的蛋白质序列，，(Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Healthand Human Services (1991))等中所描述的方法获得。本发明所述抗体优选具有SEQ ID NO 40中所示的CDR1、SEQ ID NO 41中所示的⑶R2和SEQ ID NO :42中所示的⑶R3中的至少任意ー种或所有互补决定区作为抗体的重链互补决定区。另外，本发明所述抗体优选具有SEQ ID NO :43中所示的CDR1、SEQ ID NO 44中所示的⑶R2和SEQ ID NO :45中所示的⑶R3中的至少任意ー种或所有互补决定区作为抗体的轻链互补决定区。本发明所述抗体优选是与FGF23结合的抗体，并具有SEQ ID NO:40中所示的⑶R1、SEQ ID NO 41中所示的⑶R2和SEQ ID NO 42中所示的⑶R3作为抗体的重链互补决定区，且具有SEQ ID NO :43中所示的CDR1、SEQ ID NO :44中所示的CDR2和SEQ ID NO 45中所示的⑶R3作为抗体的轻链互补决定区。本发明所述抗体的CDR序列没有特别限制。然而 ，本发明所述抗体优选包含SEQID NO 40-45所示的互补决定区序列中任ー种或多种互补决定区，更优选包含3种重链互补决定区，更进ー步优选包含所示6种互补决定区。对互补决定区以外的其他氨基酸序列没有特别限制。本发明所述抗体包括所谓的CDR移植型抗体，其中，所述移植型抗体中互补决定区以外的氨基酸序列来自于其它抗体，尤其是来源于其它物种的抗体。在这些CDR移植型抗体中，优选CDR以外的氨基酸序列来源于人的人源化抗体或人抗体。根据需要，可以对FR进行ー个或多个氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入。用于制造人源化抗体或人抗体的方法可用公知的方法。“功能性片段”指抗体的部分(部分片段)，具有此抗体对抗原的ー种或多种活性(action)。换句话说，指保留了与抗原的结合能力、对抗原的反应活性或者对抗原的识别能カ的片段。例如，Fv、ニ硫键稳定的Fv (dsFv)、单链Fv(scFv)、及其聚合物等。更具体的例子包括那些含有 Fab、Fab'、F(ab' )2、scFv、双体(diabody)、dsFv 和 Q)R 的肽[D. J. King,Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies.，1998T. J. Internationa丄Ltd] o利用木瓜蛋白酶处理与FGF23结合的抗体得到这些片段中，Fab片段为具有与抗原结合活性，分子量约为50，000的抗体片段。Fab片段中单条重链(H链)的氨基酸末端一侧将近一半区段和单条完整轻链(L链)通过ニ硫键连接在一起。本发明中的Fab片段可通过木瓜蛋白酶处理与FGF23结合的抗体而制得。或者通过将编码此抗体Fab片段的DNA序列插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将此载体转入原核生物和真核生物中后,表达此载体后获得。利用胃蛋白酶处理IgG得到的片段中，F(ab' )2片段为具有与抗原结合活性，分子量约为100，000的抗体片段。F(ab' )2片段比通过绞链区ニ硫键结合在一起的Fab片段还要大。本发明中的F(ab' )2片段可通过胃蛋白酶处理与FGF23结合的抗体而制得，或者通过以下所述的利用ニ硫键或硫醚键将Fab'连接一起而制得。Fab'是ー种分子量约为50，000，具有抗原结合活性的抗体片段。其中，所述Fiah1 )2铰链区的ニ硫键被切断。本发明中的Fab'可通过用还原剂ニ硫苏糖醇处理本发明中能与所述FGF23结合的F(ab' )2而得。或者通过将编码此抗体Fab'片段的DNA序列插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将此载体转入原核生物和真核生物中后，表达此载体后获得。
scFv是ー种具有抗原结合活性的抗体片段，它是由单条重链可变区(以下记作VH)和单条轻链可变区(以下记作VL)通过合适的肽段连接物(以下记作P)连接组成的VH-P-VL 或 VL-P-VH 型多肽。 本发明中的scFv片段可通过获取与FGF23结合的本发明所述抗体中编码VH和VL的cDNA，构建编码scFV的DNA序列，并将编码此抗体片段的DNA序列插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将此载体转入原核生物和真核生物中后，表达此载体后获得。双体是ー种由scFv ニ聚化形成的抗体片段，它具有双价抗原结合活性。双价抗原的结合活性可以相同也可以不同。本发明的双体的制备，可通过获取与本发明FGF23结合的所述抗体中编码VH和VL的cDNA，按照使肽段连接物的氨基酸序列的长度在8个残基以下的方式，构建编码scFV的 DNA序列，并将所述DNA序列插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将此载体转入原核生物和真核生物中后，表达此载体后获得。在dsFv中，组成sFv的VH和VL片段中各有一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，这两个多肽片段通过这些半胱氨酸残基之间形成的ニ硫键连接在一起。被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基的选择，可按照Reiter等(Protein Engineering, 7 :697-704,1994)所用方法，基于对抗体的三维结构预测来进行。本发明中的dsFv片段的制备，可通过获取与FGF23结合的本发明所述抗体中编码VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA序列，并将编码此抗体片段的DNA序列插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将此载体转入原核生物和真核生物中后，表达此载体后获得。构建的含有互补决定区的肽段至少含有ー种以上的VH或VL互补决定区。含有多个互补决定区的肽段可以直接连接或通过合适的肽段连接物连接。本发明中包含互补决定区的肽段的制备，可以通过构建编码与FGF23结合的本发明所述抗体VH和VL互补决定区(CDR)的DNA序列，并将所述DNA序列插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将此载体转入原核生物和真核生物中后，表达此载体后获得。此外，包含互补决定区的所述肽段的制备，也可通过诸如Fmoc法(芴甲氧羰基法，fluorenylmethyloxyc&rboriyl method)矛ロ tBoc (t—butyloxyc&rbony丄method)等化学合成法制得。此外，“功能性片段”是能与抗原(FGF23)结合的抗体的片段。这种“功能性片段”优选可与FGF23结合的片段并包含SEQ ID NO : 12中从第20位Q到136位S的氨基酸序列，和/或SEQ ID NO 14中从第23位A到第128位K的氨基酸序列。这种“功能性片段”优选是包含SEQ ID NO 40-45中所示至少ー种或全部互补决定区并可与FGF23结合的片段。这种“功能性片段”更优选衍生自ClO杂交瘤产生的抗体可变区并可与FGF23结合。本发明所述抗体包括抗体衍生物，其中，将放射性同位素、低分子量药物、大分子药物和蛋白等，通过化学方法或基因工程使之结合于本发明的抗FGF23抗体或此抗体的功能性片段上。本发明所述抗体衍生物的制备，可以通过化学等方法将放射性同位素、低分子量药物、大分子药物和蛋白等使之结合于本发明的抗FGF23抗体或此抗体的“功能性片段”的重链或轻链的N-末端或C-末端，此抗FGF23抗体或此抗体的“功能性片段”的合适的取代基团或侧链，此抗FGF23抗体或此抗体的“功能性片段”的糖链等而制得(Koutai KogakuNyuumon, Osamu Kanamitsu, Chijin shokan,1994)。此外，结合了蛋白的抗体衍生物的制备，可通过将编码本发明的抗FGF23抗体或此抗体的“功能性片段”的DNA序列与编码使之被结合蛋白的DNA序列相连后，将此DNA序列插入表达载体后，再将此表达载体转入合适的宿主细胞中并表达此载体的方法制得。对于放射性同位素，其实例包括1311、1251等。tヒ如，放射性同位素可通过氯胺T标记法等方法使之与所述抗体相连在一起。低分子量药物包括包括氮芥(nitrogen mustard)、环磷酰胺(cyclophosphamide)在内的烧基化药物(alkylating agents)；抗代谢药物(antimetabolites)如 5_ 氟尿卩密 P定(5-fIuorouracil)> 甲氨蝶呤(methotrexate)等；抗生素(antibiotics)如道诺霉素(daunomycin)、争光霉素(bleomycin)、丝裂 霉素 C (mitomycin C)、柔红霉素(daunorubicin)和阿霉素(doxorubicin)等；植物碱(plant alkaloids)类，如长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)和长春地辛(vindesine)等；抗癌药物如激素类药物三苯氧胺(tamoxifenand)和地塞米松(dexamethasone)(しIinica丄 oncology ;Japanese Clinical Oncology Research Meeting,Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Co. , 1996);留族化合物(steroids)如皮质醇(hydrocortisone)和强的松(prednisone)等；包括阿司匹林(aspirin)和消炎痛(indomethacin)在内的非留族化合物；免疫调节剂(immunomodulators)如硫代苹果酸金(gold thiomalate)和青霉胺(penicillamine)等；免疫抑制剂(immunosuppressors)如环磷酰胺(cyclophosphamide)和咪唑硫嘌呤(azathioprine)等；抗炎药(anti-inflammatories)如抗组月安类(anti-histamines)药物扑尔敏(chlorpheniraminemaieate)矛ロ氧马斯ネ丁、ciemastine)等(Inflammation and anti-inflammatory treatmentmethod, Ishiyaku Publishing Corp. Ltd. , 1982).可用公知的方法使所述这些低分子量药物和抗体结合，例如，用于道诺霉素和抗体结合的方法的实例包括通过戊ニ醛使道诺霉素和抗体的氨基基团间相结合的方法，通过水溶性碳化ニ亚胺使道诺霉素的氨基基团和抗体的羧基基团结合在一起的方法。通过将低分子量药物和抗体结合在一起，可制得具有该低分子量药物功能的抗体衍生物。对于大分子药物，其实例包括聚こニ醇(以下记作PEG)、白蛋白、右旋糖酐、聚环氧こ烷、苯こ烯-马来酸共聚物、聚こ烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羟丙基甲基丙烯酰胺等。通过将这些大分子化合物结合在抗体或抗体的“功能性片段”上，预期获得以下几种效果(I)提高其对各种化学、物理和生物因子的稳定性。(2)显著延长其在血液中的半衰期，
(3)免疫原性消失，抗体产生被抑制等(Bioconjugate Pharmaceutical,Hirokawa Shoten,1993)。用于结合PEG和抗体的ー种方法的实例是与PEG修饰性试剂反应的方法。PEG修饰性试剂的实例包括ε -氨基基团修饰剂赖氨酸(Laid-Open Patent Publication NumberS61-178926)、羧基基团修饰剂天冬氨酸和谷氨酸(Laid-Open Patent Publication NumberS56-23587)、狐基基团修饰剂精氨酸(Laid-Open Patent Publication Number H2-117920)
坐寸ο
结合了蛋白的所述抗体也可以作为ー种融合抗体被制得。换句话说，将编码所述抗体或此抗体的功能性片段的cDNA与编码特异性蛋白的cDNA连接在一起，则编码由所述抗体和特异性蛋白组成的融合蛋白的DNA即被构建。这段DNA被插入原核生物用或真核生物用表达载体中。将此表达载体转入原核生物和真核生物中后，表达此载体后，即可生产得到与特异性蛋白相结合的所述融合抗体。关于本发明中所述抗FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其对人FGF23结合活性或对人FGF23的功能抑制活性的评估，可通过免疫学方法检测如ELISA法(Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14,1988 ;Monoclona丄Antibodies Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996),或通过生物传感技术如Biacore生物传感器测定其结合解离常数(Journal of Immunological Methods,145 :229-240，1991)，以及通过检测用klothoc表达细胞对人FGF23刺激引起的早期生长反应基因-1启动子活性的抑制作用(Nature，444 :770-774，2006)等来进行。在本发明中，“人抗体”被定义为来源于人的抗体基因的基因表达产物的抗体。正如下面所描述的那样，可以通过将此人抗体基因位点转入动物，从而将抗原给予有产生此人源抗体能力的转基因动物后获得。这些转基因动物的实例包括小鼠。能产生人抗体的小鼠的已建立的方法描述在，如国际专利出版号W002/43478中。对于本发明所述抗体的实例包括下面实施例中所述的由ClO杂交瘤细胞产生的抗体(C10抗体)。在2007年2月2日，ClO杂交瘤细胞已经进行基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏在专利有机体保藏中心(Central 6,1-IHigashi 1-chome, Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,日本)独立的行政机构“先进エ业科学和技术研究院(Advanced IndustrialScience and Technology) ”，索取号为 FERM ABP-10772 (识别表示C10)。本发明抗体或其功能性片段也包括包含重链和/或轻链的单克隆抗体或其功能性片段，组成所述重链和/或轻链的氨基酸序列各具有ー个或几个氨基酸缺失、取代和添カロ。在此，“I个或几个”、“几个”指的是9个以下，优选5个以下，更优选3个以下，尤其优选2个。如先前所描述氨基酸序列的部分修饰(缺失、取代、插入、添加)可通过对编码此氨基酸序列的核苷酸序列的部分修饰而被引入组成本发明所述抗体或功能性片段的氨基酸序列。这些核苷酸序列的部分修饰可通过已知的位点特异性突变弓I入法的常规方法被弓I入[Proc Natl Acad Sci USA. ,81 :5662-5666,1984] 本发明所述抗体包括所有免疫球蛋白类型和同种型的抗体。本发明所述抗FGF23抗体可通过以下生产方法制得。如将FGF23，或FGF23的一部分，或者FGF23的一部分和合适的能引起其抗原的抗原性增长的药物载体物(例如，牛血清白蛋白等)所形成的偶合物(conjugate)，必要时与相应的佐剂(弗氏完全或不完全佐剂等)一起免疫所需的非人哺乳动物如人抗体生成转基因小鼠。对于FGF23，天然型或重组型FGF23均可使用。或者，通过将编码FGF23的基因转入表达载体并在此动物体内表达此FGF23蛋白的方法来产生免疫致敏作用。通过杂交瘤(由来自免疫致敏动物的抗体生成细胞和没有抗体生产能力的骨髄瘤细胞融合而成)的培养，产生与用于免疫作用的抗原有特异亲和性的单克隆抗体，筛选产生所述单克隆抗体的克隆，由此制得了单克隆抗体。本发明所述抗体包括那些通过利用所属领域技术人员熟知的基因工程修饰技术 (例如，參见欧洲专利申请EP314161)而被转换成不同亚类的抗体。也即是说，通过基因エ程技术，利用编码本发明所述抗体可变区的DNA，可以制得ー种不同于原有亚类的亚类抗体。2.本发明所述抗体的生产生产ー种单克隆抗体包括以下几个步骤。也即是(I)用作免疫原的抗原蛋白或该抗原蛋白表达载体的制备，(2)通过动物体内抗原注射或动物体内抗原表达,免疫动物后,抽取动物血样和分析血样中抗体滴度,且在确定脾脏分离时间后，制备抗体生产细胞(3)制备骨髓瘤细胞(4)融合抗体生产细胞和骨髄瘤细胞(5)筛选能产生目标抗体的杂交瘤细胞团(6)杂交瘤细胞团被打散成单个细胞克隆
(7)可任选地培养杂交瘤或饲养已被移植杂交瘤的动物以用于大量单克隆抗体的生产(8)检测分析以此种方法生产的单克隆抗体的生物活性和识别特异性，或检测作为标记性试剂的特性。、下文将按上面步骤对抗-FGF23单克隆抗体的生产方法作详细描述。然而，这种抗体的生产方法并不限于此种方法。如，也可使用脾脏细胞以外的抗体生成细胞和骨髓瘤细胞(此抗体的生产)。(I)抗原的纯化作为抗原，可使用利用基因重组技术,将编码FGF23的DNA序列整合到一个合适的表达质粒上，在FGF23于宿主如大肠杆菌或动物细胞等中产生后，已纯化的FGF23蛋白。因为人FGF23蛋白的ー级结构是公知的[GenBank索取号No. AAG09917，SEQ ID N0:4]，利用本领域技术人员熟知的方法化学合成的来源于FGF23氨基酸序列组成的不完全肽段也可当作此抗原使用。(2)抗体生成细胞的制备步骤已制得的上述(I)所提到的抗原与佐剂如弗氏完全或不完全佐剂或铝钾等混合，且混合物作为免疫原免疫实验动物。对于所述实验动物，最适合使用具有人源抗体生产能カ的转基因小鼠。此类小鼠在參考文献[Tomizuka.等，Proc Natl Acad Sci USA. ,97 722-727,2000]中被 Tomizuka 等描述。免疫小鼠时，免疫原的给药方法可以是皮下注射、腹腔注射、静脉注射、皮内注射、肌肉注射、足趾注射等方法中的任意ー种。优选腹腔注射、足趾注射或静脉注射。可进行一次免疫或在一个合适的时间间隔内进行多次免疫。随后，測量存在于免疫动物血清的抗所述抗原的抗体滴度。当使用具有很高抗体滴度的动物作为抗体生成细胞的生产原料吋，后续操作步骤的效率将得到提高。一般来讲，优选使用来源于最终免疫后3-5天的动物的抗体生成细胞用于后续的细胞融虫合。在这里，用于抗体滴度检测方法的例子包括如放射性同位素免疫定量測定法(以下记作"RIA法")、固定酶免疫定量測定法(以下记作"ELISA法")、荧光抗体法、被动血凝反应法等各种公知技木。从检测灵敏度、快速性、精确性和自动化操作的可行性来看，RIA法或ELISA法是合适的方法。本发明所述抗体的滴度检测，例如使用ELISA检测法，可通过以下步骤进行。首先，将抗人抗体的抗原被吸附于ELISA96孔板等的固定表面。然后，用与此抗原无关的蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)，封闭没有吸附抗原的此固定表面。漂洗此表面后，与作为ー抗的连续浓度梯度稀释的试剂(如来自于具有人抗体生产能力的转基因小鼠的血清)接触反应，以使所述抗原与样品中的抗-FGF23抗体相结合。再然后，作为ニ抗的酶标记抗人抗体被加入，此ニ抗可与所述人抗体結合。漂洗后，加入所述酶的底物。然后，检测因底物降解引起的颜色变化所导致的光吸收改变，以计算抗体滴度。(3)骨髓瘤制备步骤对于骨髄瘤，可使用来源于哺乳动物如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔或人等自身不具有抗体生产能力的细胞。一般来讲，优选使用来自于小鼠的细胞系，如8-氮鸟嘌呤抗性小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag8U. I (P3-U1) [Yelton,D. E.等，Current Topics in Microbiologyand Immunology,81 1-7,1978], P3/NSI/l_Ag4_l(NS-1) [Kohler, G.等，EuropeanJ. Immunology, 6 :511-519,1976]，Sp2/0_Agl4 (SP2/0)[Shulman, M.等，Nature,276 269-270，1978]，P3X63Ag8. 653 (653) [Kearney, J. F.等，J. Immunology, 123 :1548-1550，1979]，P3X63Ag8(X63) [Horibata,K. Harris,A. ff. ,Nature, 256 :495-497,1975]等。这些细胞系的继代培养要用合适的培养基，如8-氮鸟嘌呤培养基[一种补充有谷氨酰胺、2-巯基こ醇、庆大霉素和胎牛血清(FCS)、还有8-氮鸟嘌呤的RPMI-1640培养基]、Iscove' sModified Dulbecco; s培养基(MDM)或Dulbecco' s改良(Modified)Eagle培养基(DMEM培养基)。然而，在细胞融合前3-4天，细胞系的继代培养要用正常培养基(如包含有10%FCS的DMEM培养基)，为细胞融合准备的细胞数目不低于2xl07。(4)细胞融合 抗体生成细胞是浆细胞和其前体细胞的淋巴细胞。这些细胞可以从生物个体任意位置获得。一般来讲，脾脏、淋巴结、骨髄、扁桃体、外周血、或者它们的合适组合均可被融合。一般来讲，最常使用脾脏细胞。.最后一次免疫动物后，存在抗体生成细胞的部位，如脾脏，从能得到指定的抗体滴度的小鼠中分离出来，从而制得作为抗体生成细胞的脾脏细胞。下一歩，融合脾脏细胞和骨髓瘤细胞。对于脾脏细胞和步骤(3)中得到的骨髄瘤细胞的融合方法，最常用的方法是使用聚こニ醇。这种方法的细胞毒性相对较低，融合操作也简单容易。这种方法有以下步骤，比如将脾脏细胞和骨髓瘤细胞用无血清培养基(如DMEM)或磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)漂洗好，脾脏细胞和骨髓瘤细胞以5 1-10 I的比例混合并离心。移去上清液，打散沉淀的细胞团，边搅拌边加入ImL含50% (w/v)聚こニ醇(分子量1000-4000)的无血清培养基。然后，缓慢加入IOmL的无血清培养基，随后离心。弃去上清液，在正常培养基(以下称HAT培养基)中悬浮沉淀的细胞，所述正常培养基(HAT培养基)含有合适量的次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶脱氧核苷(以下称HAT)溶解物和人白细胞介素_6(以下称IL-6)。这些细胞被等量均分至培养板各孔(以下称培养板)，并在37 □和存在5% CO2的条件下培养约两个星期。在培养期间，根据需要补充HAT培养基。(5)杂交瘤细胞团的筛选上述所提到的骨髄瘤细胞为8-氮鸟嘌呤抗性株吋，也即是说，如果它是一种次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷性细胞株时，没有融合的骨髓瘤细胞或仅由骨髓瘤细胞融合形成的融合型细胞，在含有HAT的培养基中不能存活。而另一方面，仅由抗体生成细胞形成的融合型细胞，或由抗体生成细胞与骨髄瘤细胞形成的融合型细胞杂交瘤细胞是能够生存的。但是仅由抗体生成细胞融合形成的融合型细胞的生存周期是有限的。因此，通过在含HAT培养基中的持续培养，仅仅由抗体生成细胞与骨髄瘤细胞形成的融合型细胞杂交瘤细胞能够生存。从而，杂交瘤细胞可被筛选出来。对于正在克隆中生长的杂交瘤，培养基被换成不含氨基蝶呤的培养基(以下称作HT培养基)。然后，收集部分培养基上清液，用如ELISA法检测抗-FGF23抗体滴度。上面，为利用8-氮鸟嘌呤抗性细胞系的方法示例。但是，其他细胞系也可相应地应用于杂交瘤细胞的筛选方法。在这些情况下，所使用的培养基组合物也可变化。(6)克隆步骤通过利用与(2)中所用相同的抗体滴度检测方法检测抗体滴度，决定用于生产所述特异性抗体的杂交瘤细胞被移至另ー个培养板，并进行克隆。克隆方法的实例包括限制性稀释法，在此方法中，杂交瘤细胞被稀释至培养板中每个培养孔仅含有一个杂交瘤细胞， 并被培养；软琼脂培养法，在这种方法中，杂交瘤细胞被培养在软琼脂培养基中，克隆被收集；ー种在此方法中用显微操作器每次转移一个细胞并对其培养的方法；分类机分拣克隆法，在这种方法中，利用细胞分拣机分离单个细胞等。限制性稀释法较为简单和常用。关于培养孔，在培养孔里抗体滴度被观察到，如，当利用限制性稀释法重复克隆2-4次时，产生具有稳定的抗体滴度的细胞系被筛选出来，以用作抗-FGF23单克隆抗体生成杂交瘤细胞系。(7)通过杂交瘤细胞培养制备单克隆抗体将HT培养基换成正常培养基，以培养已完成克隆的杂交瘤细胞。对于大规模培养，有利用大容量培养瓶的循环培养、旋转器培养，或利用中空纤维系统的培养等。通过用本领域技术人员熟知的方法如凝胶过滤等方法对大规模培养上清液的纯化，获得抗-FGF23单克隆抗体。此外，通过将所述杂交瘤在相同品系小鼠(如BALB/c)或nu/nu小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔等腹膜中的生长，获得含有大量抗-FGF23单克隆抗体的腹膜液。简单的抗体纯化方法是使用商品化的单克隆抗体纯化试剂盒(比如，MAbTrap GII kit ；GE HealthcareBioscience Co. )以这些方法获得的单克隆抗体具有高抗FGF23抗原特异性。此外，重组型抗体的制备可通过利用基因重组技术(Delves，P. J.，ANTIBODYPRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES. ，1997 WILEY, Shepherd, P.和 Dean C. ， MonoclonalAntibodies.，2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, Goding, J. ff.，Monoclonal Antibodies principles and practice. , 1993 ACADEMIC PRESS),从骨髓瘤等抗体生成细胞中克隆编码所述抗体的基因，将此基因整合到ー种合适的载体并转入ー种宿主(如哺乳动物细胞系、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等)而得到。本发明包括含有由产生本发明抗体的杂交瘤产生的抗体的基因序列的核酸,尤其包括下述的含有由本发明的杂交瘤产生的抗体的重链可变区和轻链可变区的核酸。在这里，核酸包括DNA和RNA。此外，本发明也包括本发明中所述的重链可变区和轻链可变区成熟片段的核酸，在此，所述成熟片段是指去除所述信号肽序列后剰余的重链可变区和轻链可变区肽段。此外，除上述的核酸外，本发明中所述核酸还包括具有与本发明中所述抗体氨基酸序列的氨基酸和所述抗体重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸相对应的密码子的核酸。为制备编码来自于所述杂交瘤的单克隆抗体的基因，ー种方法被运用，按照这种方法，编码所述单克隆抗体每条轻链可变区，轻链恒定区，重链可变区，重链恒定区的DNA可通过PCR等方法得到制备。在此制备方法中，根据抗-FGF23抗体基因或其氨基酸序列设计的寡DNA被用作引物。对于模板，从杂交瘤中制得的DNA可用作模板。所述这些DNA被整合到一个合适的载体上并被转入宿主细胞后，得到表达，或者将这些DNA —起整合到一个合适的载体后共表达。对于载体，可以使用能在微生物宿主中自主生长的噬菌体或质粒。对于质粒DNA，其实例包括来源于大肠杆菌、枯草杆菌或酵母等的质粒。对于噬菌体DNA，其实例包括λ噬菌体。所有能表达目的基因的宿主均可用作转化宿主。其实例包括细菌(大肠杆菌、枯草杆菌等)、酵母、动物细胞(COS细胞、CHO细胞等)和昆虫细胞等。将基因转入宿主中所用的方法是众所周知的，可例举出许多方法(如钙离子法、
电穿孔法、原生质体法、こ酸锂法、磷酸钙、脂质体转染法等)。此外，将基因转入下述动物中所用的方法，其实例包括以下所述方法显微注射法、应用电穿孔技术或脂质体转让法将基因转入胚胎细胞的方法、以及核移植法等。在本发明中，可通过培养转化子，以及对培养产物的收集，获得抗-FGF23抗体。在这里，“培养产物”表示以下的任何ー种(a)培养物上清液，(b)培养的细胞或培养的菌体或它们的匀浆，以及(c)转化子分泌物。为了培养转化子，要使用适合所用宿主的培养基，并使用静止培养法、滚瓶培养法等培养方法。培养完毕后，当所述目标抗体产生于细菌菌体或细胞内时，所述抗体通过细菌菌体或细胞的匀楽:得到收集。此外，当所述目标抗体产生于细菌菌体或细胞外时,培养物溶液被直接使用，或者是通过离心等方法除去细菌菌体或细胞。随后，通过单独使用或适当组合使用各种用于蛋白质分离纯化的色谱技术的常规生物化学方法，从所述培养产物中分离纯化所述目标抗体此外，利用转基因动物构建技术，构建所述目标抗体基因被整合为内源基因的动物宿主如转基因牛、转基因山羊、转基因绵羊或转基因猪等。从这些转基因动物分泌的奶中可以得到大量的来源于所述目标抗体基因的单克隆抗体(Wright, G.,等，Bio/Technology
9=830-834,1991)。当在体外培养杂交瘤吋，按照培养细胞的特性、试验研究的目的和培养方法等各种条件，使所述杂交瘤得到生长、保持和储存。已知营养培养基或各种来源和制备于已知基础培养基的营养培养基可被用于在培养上清液中生产所述单克隆抗体。(8)所述单克隆抗体的分析在这些方法中制得的所述单克隆抗体的同型类和亚类分析可通过以下方法进行。首先，鉴定方法的实例包括平板双向扩散(Ouchterlony)法、ELISA法或RIA法等。平板双向扩散法较简单，但当所述单克隆抗体浓度低时，必需进行浓缩操作。另ー方面，当使用ELISA法或RIA法吋，培养上清液可直接与被吸附于固定表面的抗原反应，且通过使用与各种免疫球蛋白的同型类和亚类反应的抗体作为ニ抗抗体，可对所述单克隆抗体的同型类和亚类进行鉴定。此外,可用Folin/Lowry法，以及通过计算其在280nm的光吸收[I. 4(0D280)=免疫球蛋白lmg/mL]的方法，进行蛋白质定量。所述单克隆抗体识别表位的鉴定(表位作图)按如下进行。首先，构建单克隆抗体识别的分子的各部分结构。对于部分结构的构建，其方法如下ー种方法是采用众所周知的寡肽合成技术，制取分子的各部分肽段；ー种方法是利用基因重组技术将编码所述目标部分肽段的DNA序列整合到一个合适的表达质粒，所述肽段在宿主如大肠杆菌等体内或体外制得。然而，为实现上述目的，一般是将上述两种方法组合使用。例如，利用本领域技术人员熟知的基因重组技术构建以随机长度从羧基末端或氨基末端开始连续性缩短的抗原蛋白多肽系列。然后，研究所述单克隆抗体与这些多肽的反应活性，并大致确定其识别位点。以下，作更详细的说明，利用本领域技术人员众所周知的寡肽合成技术，合成这些肽的相应部分的寡肽或变体等。为了确定表位，研究单克隆抗体与这些多肽的结合能力，所述单克隆抗体含有在本发明用于预防或治疗的药物中作为活性成分，或者研究这些多肽对所述单克隆抗体与相应抗原的结合能力的竞争性抑制活性。作为获得各种寡肽的简单方法，可使用商品试剂盒(如SPOTs kit (Genosis Biotechnologies),利用多肽合成技术的多肽系列合成试剂盒(Chiron Co)等)(9)所述抗体片段的生产 基于上述(7)中所描述抗体，利用基因工程或蛋白质化学方法生产所述抗体片段。对于基因工程技术方法，其实例是构建编码目的抗体片段的基因，并用合适的宿主如动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌等表达此基因，纯化所述抗体片段。对于蛋白质化学方法，其实例是蛋白酶(如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等)被用于特异性位点剪切并进行纯化。对于所述抗体片段，其实例是含有Fab、F(ab' )2、Fab'、scFv、双体、dsFv、CDR的肽段等。每ー种抗体片段的生产方法将在下面得到详细描述。 (i) Fab 的生产Fab可用蛋白质化学方法,通过利用木瓜蛋白酶处理IgG制得。木瓜蛋白酶处理后，如果所述初始抗体是具有蛋白A结合能力的IgG亚类，则通过蛋白A层析柱，分离IgG分子和 Fe 片段，回收均质 Fab (Monoclonal Antibodies !Principles and Practice,第三版，1995)。如果所述抗体为不具有蛋白A结合能力的IgG亚类抗体，利用离子交換层析，Fab从被洗脱在低盐浓缩液的片断中得到回收(Monoclonal Antibodies principles andPractice，第三版，1995)。此外，对于利用基因工程技术获得Fab，在大多数情况下使用大肠杆菌，或者使用昆虫细胞和动物细胞等来生产Fab。如，在上面2(7)中被描述的编码所述抗体可变区的DNA被克隆到Fab表达载体中，以构建Fab表达载体。对于所述Fab表达载体，任何可使Fab的DNA得到整合和表达的质粒都可使用。ー个实例是pIT106 (Science，240 :1041-1043,1988)等。Fab表达载体被转入合适的大肠杆菌，并可生成并聚集于包涵体或外周质中。对于来自于包涵体的Fab，可通过被常用于蛋白质的重折叠的方法而被激活。此外，当Fab表达于外周质时，具有活性的Fab被释放到培养上清液中。利用结合有抗原的层析柱，经过重折叠处理或来自于培养上清中的Fab被纯化得到均质Fab (AntibodyEngineering,A Practical Guide, W. H. Freeman and Company,1992).(ii)F(ab' )2 的生产F(ab' )2可用蛋白质化学方法，通过利用胃蛋白酶处理IgG制得。胃蛋白酶处理后，利用与Fab相同的纯化操作，可回收得到均质F(ab' ) 2 (Monoclonal Antibodies Principles and Practice,第三版，1995)。此外，也可通过马来酰亚胺类(如o_PDM或双马来酰亚胺己烷等)处理以下(iii)所述的Fab'，形成硫醚键，或者通过DTNB (5，5' -ニ硫代-双(硝基苯甲酸))处理，形成S-S键的方法,得到F (ab' ) 2 (Antibody Engineering,A Practical Approach,IRL PRESS,1996)。(iii)Fab'的生产Fab'可通过用 还原性试剂(如ニ硫苏糖醇等)处理上述(ii)中所述的F(ab' )2制得。此外，Fab'的生产可用基因工程技术，在大多数情况下使用大肠杆菌，或者使用昆虫细胞和动物细胞等。例如，在上述2(7)中的编码所述抗体可变区的DNA被克隆到Fab'表达载体中，以构建Fab'表达载体。对于所述Fab'表达载体，任何可使Fab'的DNA得到整合和表达的质粒都可使用。ー个实例是pAK19(BI0/TECHN0L0GY，10 :163-167，1992)等。Fab'表达载体被转入合适的大肠杆菌。Fab'可生成并聚集于包涵体或外周质中。对于来自于包涵体的Fab'，可通过被常用于蛋白质的重折叠的方法而被激活。此外，当Fab'表达于外周质时，通过溶菌酶部分消化、滲透压休克、超声波裂解等方法，匀浆细菌，这些(Fab')可从菌体外得到回收。利用G蛋白层析柱等，经过重折叠处理或来自于细菌匀浆液中的 Fab'被纯化得到均质 Fab' (Antibody Engineering,A Practical Approach, IRLPRESS,1996)。(iv)scFv 的生产利用基因工程技术，可用噬菌体或大肠杆菌或昆虫细胞或动物细胞等来生产ScFv0如，在上述2(7)中的编码所述抗体可变区的DNA被克隆到scFv表达载体中，以构建scFv表达载体。对于所述scFv表达载体，任何可使scFv的DNA得到整合和表达的质粒都可使用。其实例包括 pCANTAB5E(GE Healthcare Bioscience Co.), pHFA(HumanAntibodies&Hybridomas, 5 :48-56,1994)等。将scFv表达载体转入合适的大肠杆菌,通过使辅助性噬菌体感染，可得到其中scFv以与噬菌体表面蛋白融合的形式而被表达于噬菌体表面的噬菌体。此外,scFv可生成并聚集于转入有scFv表达载体的大肠杆菌的包涵体或外周质中。对于来自于包涵体的scFv，可通过被常用于蛋白质的重折叠的方法而被激活。此夕卜，当scFv表达于外周质时，通过溶菌酶部分消化、滲透压休克、超声波裂解等方法，匀浆细菌，这些(scFv)从菌体外被回收。利用阳离子交换层析等，经过重折叠处理或来自于细菌勻楽·液中的 scFv被纯化得到均质 scFv (Antibody Engineering, A Practical Approach,IRL PRESS,1996)。(V)双体的生产利用基因工程技术生产双体时，主要使用大肠杆菌，也可使用昆虫细胞和动物细胞。例如，制备DNA，其中连接上述2(7)中所述抗体的VH和VL，从而接头(linker)编码的氨基酸残基为8个残基或更少，并将其克隆到双体表达载体上，从而构建了双体表达载体。任何可使双体DNA得到整合和表达的质粒都可用作双体表达载体。其实例包括PCANTAB5E(GEHealthcare Bioscience)、pHFA (Human Antibodies Hybridomas, 5,48,1994)等，双体可产生和聚集在转入双体表达载体的大肠杆菌包涵体或外周质中。从包涵体中获得的双体，可通过常被用于蛋白质的重折叠法而被激活。此外，当(双体)被表达于外周质时，通过溶菌酶部分消化、滲透压休克、超声波裂解法等方法，匀浆细菌，这些(双体)从菌体外被回收。通过使用阳离子交换层析等技术(Antibody Engineering,A Practical Approach, IRLPRESS, 1996)处理，经过重折叠处理或来自细菌匀浆液的双体被纯化得到均质双体。(vi)dsFv 的生产利用基因工程技术生产dsFv时，主要使用大肠杆菌，也使用昆虫细胞和动物细胞。首先，将突变引入到在上述(ii)、(iv)和(V)中编码抗体VH和VL的DNA的合适位点，从而得到所述编码的氨基酸残基被半胱氨酸取代的DNA。所述制得的每条DNA均可被克隆于dsFv表达载体中以构建VH和VL表达载体。任何可使dsFv的DNA得到整合和表达的质粒均可用作 dsFv 表达载体。例如 pUL19 (Protein Engineering, 7 :697-704,1944)等。所述VH和VL表达载体可被转入合适的大肠杆菌中，且其可在包涵体或外周质中产生和聚集。获得来自包涵体或外周质的VH和VL,并使之混合,dsFv可通过常被用于蛋白质的重折叠法而被激活。经过重折叠法处理后，可通过离子交换层析法和凝胶过滤法进ー步纯化(ProteinEngineering,7 :697-704,1994)。(vii) CDR 肽的生产 含有⑶R的肽可通过化学合成法(如Fmoc法或Boc法等)制得。此外，⑶R肽表达载体可通过制备编码含有CDR肽的DNA，并克隆于合适的表达载体后获得。任何可使编码⑶R肽的DNA得到整合和表达的质粒均可用作所述表达载体。如pLEX (Invitrogen)和pAX4a+ (Invitrogen)等。所述表达载体可被转入合适的大肠杆菌中，且其可在包涵体或外周质中产生和聚集。从包涵体或外周质中得到⑶R肽，并可通过离子交换层析法和凝胶过滤法对其进行纯化(Protein Engineering, 7 :697-704,1994)。3.本发明中所述抗体和此抗体的功能性片段的特征本发明中所述抗体和此抗体的功能性片段具有任何以下特征(a)FGF23结合试验；与具有SEQ ID NO :4中从第25位到第251位的氨基酸残基的全长FGF蛋白序列结合。(b)体外试验；一种检测方法中FGF23的活性受抑制，利用此检测方法可以检测FGF23活性。体外检测FGF23活性的ー个方法的实例是用FGF23刺激引起早期生长反应基因-I 的启动子活化(Nature,444 =770-774,2006)。(c)体内实验；对人给药时，抑制内源性FGF23活性，增加血清磷浓度和血清1，25D浓度。与常规抗体(2C3B抗体(抗FGF23蛋白的小鼠单克隆抗体，公开于W003/057733，由索取号为FERM BP-7838的杂交瘤细胞产生的抗-FGF23抗体)相比，血清磷浓度和血清1，25D浓度增加程度更大，且增加血清磷浓度和血清1，25D浓度的持续时间长。比如，当给予猕猴时，其引起血清磷浓度升高的持续时间约是2C3B抗体的约3倍以上，优选约5倍，其引起血清1，25D浓度升高的持续时间约是2C3B抗体的约I. 5倍以上，优选约2. 5倍。本发明也包括编码本发明的抗FGF23抗体的氨基酸序列的核酸。此核酸可以是DNA或RNA。本发明中的核酸，优选编码ClO杂交瘤产生的抗体的氨基酸序列的核酸。ー个实例是编码重链可变区的氨基酸序列的核酸(C10抗体的重链核酸序列)，所述氨基酸序列由SEQ ID NO 11中从第58位C到第408位A的核苷酸序列编码。此外，另ー个实例是编码轻链可变区的氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列由SEQ ID NO :13中从第67位G到第384位A的核苷酸序列编码。II.药物组合物制剂，即含有本发明的人抗-FGF23抗体或此抗体的功能性片段的药物组合物包括在本发明范围内。这种制剂，除所述抗体或此抗体的功能性片段之外，优选包括生理上可接受的稀释剂或药物载体，或可以是ー种与其他药物(如其它抗体或抗生素)的混合物。合适的药物载体包括生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水葡萄糖溶液、缓冲生理盐水，但不限于这些载体。此外，抗体可以是冻干的和在必要时添加上述缓冲液后得到重建。给药方法包括ロ服给药、或肠胃外给药如口腔内、气管支气管内、直肠内、皮下注射、肌肉注射、静脉注射等给药，优选给药方法优选静脉注射给药。可通过各种制剂形式进行给药，这些剂型包括气雾剂、胶囊、药片、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏剂和月交布制齐U (tapes) O被制成液态制剂如乳剂和糖浆剂时，可使用添加剂如水；糖类如蔗糖、山梨醇和果糖等；醇类如聚こニ醇、丙ニ醇等；油类如芝麻油、橄揽油和大豆油等；防腐剂如对羟基苯甲酸酯类等；调味剂如草莓调味剂和薄荷等。被制备胶囊、药片、粉剂、颗粒剂等时，可使用添加剂如赋形剂如乳糖、葡萄糖、蔗糖、和甘露(糖)醇等；崩解剂如淀粉、海草酸钠等；润滑剂如硬脂酸镁和滑石粉等；粘合剂如聚こ烯醇、羟丙基纤维素和凝胶等；表面活性剂如脂肪酸酷等；增塑剂如丙三醇等。注射制剂可使用的添加剂包括水；糖类如蔗糖、山梨醇、木糖、海藻糖、果糖等；糖醇如甘露(糖)醇、木糖醇和山梨糖醇等；缓冲液如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和谷氨酸盐缓冲液等；表面活性剂如脂肪酸酷等。肠胃外给药的合适制剂包括注射剂、栓剂、气雾剂等。在使用注射剂时，通常以单剂量安瓿或多剂量容器的形式被提供。它可能是合适的粉剂，在使用时以合适的药物载体，如不含热源质的无菌水重新溶解。这些制剂含有常被用于制剂配制的添加剂如乳化剤、悬浮剂等。注射剂使用方法包括，如静脉输注、静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射、皮下注射、皮内注射等。此外，给药剂量随给药对象的年龄、给药方式、给药频率而不同，井能在很宽范围内调整。栓剂可用药物载体(如可可脂、氢化脂肪、羧酸等)进行配制。气雾剂可用载体所述抗体或此抗体的功能性片段本身进行配制，或者用载体进行配制，所述载体对给药对象(患者)的ロ部和呼吸道粘膜不产生刺激作用，且能使所述抗体或此抗体的功能性片段扩散成微粒，使其容易吸收。载体的具体实例包括乳糖、丙三醇等。根据所述抗体或此抗体的功能性片段的特性和所用载体的特性，可选用气雾剂、干粉等剂剂。此外，在ロ服制剂中所用的添加剂组分也可添加到这些肠胃外给药制剂中。所用剂量一般因症状、年龄、体重等而异，但是一般来说，对成年人的ロ服给药，约为姆天O. Olmg-lOOOmg。此剂量可一次给药或分成几次给药。在肠胃外给药时，可通过皮下注射、肌肉注射或静脉注射每次的给药量为O. Olmg-IOOOmgo本发明包括本发明所述抗体，或此抗体的功能性片段，或使用包含本发明所述抗体、或此抗体的功能性片段的药物组合物预防或治疗下述疾病的方法，此外，本发明还包括本发明所述抗体、或此抗体的功能性片段在制备用于预防或治疗下述疾病的药物中的用途。可被本发明所述抗体、或此抗体的功能性片段预防和治疗的疾病包括具有FGF23过度活性的疾病，如肿瘤引起的软骨病(tumor-induced osteomalachia)、ADHR、XLH、、骨纤维性结构不良、麦-奥ニ氏(McCune+Albright)综合征，以及伴随有异常矿物质代谢的疾病如常染色体隐性低血磷症。此外，(本发明)还有望提高对低血磷症、骨盐沉积衰竭、骨骼疼痛、肌肉无力、骨骼畸形、成长障碍、低1，2 血症等疾病相关的综合征的疗效。由于FGF23在生理条件下具有重要作用，被磷代谢和维生素D代谢控制所介导的FGF23钙代谢控制活性，可通过本发明所述抗体、或此抗体的功能性片段来调控，因此，它们(本发明所述抗体、或此抗体的功能性片段)可用于预防和治疗由矿物质代谢和维生素D代谢异常所导致的疾病，如骨质疏松症、佝偻病(包括低血磷症性佝偻病和维生素D抗性佝偻病)、高钙血症、低I丐血症、异位I丐化症(ectopic calcification)、骨硬化、派杰(Paget’ s)病、甲状旁腺机能亢进症、甲状旁腺机能減退症、搔痒症等。此外，本发明所述抗体或此抗体的功能性片段也可用于以肾病性骨营养不良、透析性骨病、肾小管功能障碍为代表的由肾衰竭透析和肾衰竭并发症引起的疾病的预防和治疗。另ー方面，据报道，1，25D不仅具有上述的对矿物质代谢(如钙代谢等)的活性，也具有细胞生长抑制作用、细胞分化活性等。因此，本发明所述抗体或此抗体的功能性片段也可用于其生长分化由1，25D调控的细胞引起的疾病的预防和治疗。
此外，众所周知，在肿瘤引起的软骨病中，由肿瘤引起的FGF23过量表达可导致病变。因此，可以想到，通过使用连接有放射性物质(如放射性同位素等)、或者连接有各种毒素治疗试剂(如低分子量药物等)的本发明抗体，和所述抗体在过量产生FGF23的肿瘤中的聚集，会导致肿瘤回缩。III.制剂实例包含本发明所述抗体或此抗体的功能性片段的制剂，以溶解在水或除水以外的药理上可接受的溶液中的无菌溶液或悬浮液的安瓿形式供使用。此外，也可将无菌粉剂(优选冻干的本发明所述抗体分子)填充在安瓿中，使用时用药理上可接受的溶液稀释后供使用。实施例下面是通过实施例对本发明作更详细描述，但这并不意味着本发明仅受限于实施例的这些描述。实施例I重组人FGF23表达载体的制备。(I)人FGF23H蛋白表达载体的构建。使用可造成肿瘤引起的软骨病(tumor-induced osteomalachia)的肿瘤的人cDNA文库为模板，扩增编码人FGF23基因的cDNA，所述操作过程使用FlEc0RI引物(SEQ IDNO 1)和LHisNot引物(SEQ ID NO 2)和LA-Taq DNA聚合酶，进行35个PCR循环，每个PCR循环的组成为96°C保温lmin，然后96°C 30秒，55°C 30秒和72°C 30秒。所述FIEcoRI引物在退火后与存在于编码人FGF23基因的核苷酸片段5'上游远端的序列結合，并在扩增获得的编码人FGF23基因的核苷酸片段5'端处引入EcoRI限制性酶切位点。所述LHisNot引物中含有可与编码人FGF23基因的核苷酸序列中的終止密码子5'端发生退火的序列、编码末端(terminal)密码子的序列(其在编码His6标记序列(His-His-His-His-His-His)和NotI限制性位点的序列之后)。結果，扩增片段编码人FGF23蛋白，在所述FGF23蛋白的羧基末端被加入一段His6-标记的序列，其下游处有ー个NotI限制酶位点。所述扩增片段经EcoRI和NotI消化后，与同样经EcoRI和NotI消化的动物细胞表达载体pcDNA3.IZeo(Invitrogen)相连接。以这种方法构建的所述表达载体被克隆且其核苷酸序列得以确定，从而确认该表达载体编码添加有His6标记序列的目标蛋白，即人FGF23蛋白。所述载体被称为 pcDNA/hFGF23H。FIEcoRI CCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG(SEQ ID NO :1)LHisNot ATAAGAATGCGGCCGCTCA ATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA(SEQ ID NO :2)(2)人FGF23蛋白表达载体的构建用pcDNA/hFGF23H作为模板扩增片段，其中使用FIEcoRI引物和LNot引物(SEQ IDNO 3)和LA-Taq DNA聚合酶，进行25个PCR循环，每个PCR循环的组成为94°C保温lmin，然后94°C 30秒，55°C 30秒和72°C lmin。结束反应后，所述编码人FGF23片段用EcoRI和NotI进行消化处理，然后纯化。通过将其插入到pEAK8/IRES/EGFP载体的EcoRI和NotI限制酶位点，这些纯化得到的片段被克隆，所述PEAK8/IRES/EGFP载体是动物细胞表达载体，其是通过在pEAKS (Edge Biosystem)内连接分子内核糖体进入序列(intramolecularribosomal entry sequence, IRES)和增强型绿色突光蛋白(EGFP)而得到的。由此获得的质粒的核苷酸序列得以确定，从而确认其编码人FGF23蛋白。所述载体被称为PEAK8/IRES/EGFP/hFGF23。LNot ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA(SEQ ID NO :3)(实施例2)(I)重组人FGF23蛋白和重组突变型人FGF23H蛋白的表达。通过对所述载体中氨苄青霉素抗性基因上FspI限制酶位点的剪切，使pcDNA/hFGF23H被线性化并被纯化，然后与鼠CHO克隆-I细胞(Shirahata，S.，等，Biosci BiotechBiochem, 59 :345-347,1995)混合，并利用 Gene Pulser II (Bio Rad)穿孔仪,使用电穿孔法被转染到此细胞内。在用含有10% FCS的MEMa培养基(Gibco BRL)培养这些细胞24小时后，培养基中加入Zecocin(Invitrogen)到终浓度O. 5mg/ml,然后(用此培养基)培养所述细胞I个星期。胰酶消化后，贴壁生长的细胞被释放，并通过有限稀释法，使其在Zecocin终浓度为O. 3mg/ml的条件下被克隆，以得到很多的细胞克隆。利用蛋白质印迹(Western blotting)技术，表达人FGF23H效率最高的细胞被鉴定出来。每个细胞克隆的培养上清液都被收集并对其进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将(电泳得到的)蛋白转移到PVDF膜(Millipore)上。通过使用抗-His-tag (羧基末端)抗体和ECL光致发光系统(photo-luminescent, GE Healthcare Bioscience),检测出来自约 32kDa 附近的 FGF23H蛋白的信号。因此，具有最高表达能力的被称为#20的细胞克隆被发现，此细胞克隆被命名为CH0-0ST311H，并于2000年8月11日保藏于位于日本的国际专利生物体保藏中心国立先进エ业科学和技术研究院(International Patent Organism Depositary (IPOD) NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)),Tsukuoa Centra丄6，l-l-lHigashi，Tsukuba，Ibaraki (保藏号FERM BP-7273)。在本说明书中，CH0-0ST311H被称作 CH0-hFGF23H。(2)人FGF23表达细胞的获得pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23载体对CHO Ras克隆-I细胞的转染通过使用膜融合脂的基因转染方法完成。当培养于6孔培养板中的CHO Ras克隆-I细胞已经覆盖住所述6孔培养板底部约60%时，移去所述培养基，并加入Iml无血清的MEMa培养基。2. 5 μ g转入载体和10 μ I Transfectam(注册■商标)(Promega)分别与50 μ I MEM α无血清培养基混合，两种溶液混合后，静置lOmin。将混合物加入事先准备好的6孔板的培养孔中。孵育2小时后，移去含有DNA的培养基，换上含有10% FCS的培养基，孵育培养物一整夜。第二天，加入嘌呤霉素(Sigma)至终浓度5 μ g/ml，以选择具有药物抗性的细胞。通过有限稀释法，由此获得的具有药物抗性的细胞被克隆。此外，利用蛋白质印迹技术，得到表达目标蛋白效率最高的细胞系。所述细胞被称为CH0-hFGF23。(3)重组人FGF23蛋白在动物细胞中的表达和检测。用抗羧基端-His6标记序列的抗体对培养物上清液中CH0_hFGF23H重组物的蛋白质印迹，检测到两条约为32kDa和IOkDa的条带。将这两条带从凝胶中切出，并测定其N-末端氨基酸序列。在较大分子量条带(约为32kDa)中，所检测到的序列是从SEQ ID NO :4中 第25位氨基酸开始的氨基酸序列，它可被视为是在分泌过程中其信号肽段序列已被切除的人FGF23蛋白。另ー方面，在较小分子量条带中，所检测序列被确认是从SEQ ID NO :4中第180位氨基酸开始的氨基酸序列，事实证明此片段是179与180位氨基酸之间发生剪切后产生的羧基末端片段。此外，通过利用可识别所述人FGF23N-末端ー侧的多克隆抗体对其的检测，具有从第179位氨基酸开始到N-末端氨基酸序列的多肽(氨基酸末端肽段)的存在也得到确认(国际专利出版号W002/14504)。相似地，在所述不具His6标记序列的CH0_hFGF23培养上清液中，发生于第179与180位氨基酸残基之间的剪切也得到确认(国际专利出版号W002/14504)。因此，以下的操作被用于分离和纯化没有发生剪切的全长人FGF23蛋白，所述全长人FGF23蛋白具有SEQID NO 4中从第25位到第251位的氨基酸序列(有时称作全长FGF23)。(4)重组全长人FGF23蛋白的纯化所述CH0_hFGF23培养上清液用 SuperCap (注册■商标)(Pall Gelman Laboratory)过滤，所使用的SuperCap是ー种孔径为O. 2μπι的膜过滤装置，过滤所得滤液通过SP-Sepharose FF (GE Healthcare Bioscience)。与层析柱结合能力较弱的物质被50mM的磷酸钠盐缓冲液(PH 6. 7)漂洗和洗脱下来。所述(洗脱)成分包括发生于第179与180位氨基酸残基之间的剪切作用产生的所述羧基末端片段。吸附在层析柱中的蛋白被浓度梯度为0-0. 7M的NaCl溶液洗脱下来，全长人FGF23蛋白在约O. 3M NaCl溶液的洗脱成分中被观察到。下ー步，全长人FGF23蛋白被吸附到金属亲和性层析柱Talon Superflow(注册■商标)(Clonetech)中，并经50mM的磷酸钠盐缓冲液(pH6. 7)漂洗,通过加入不同浓度咪唑，将所述全长人FGF23蛋白洗脱纯化。包含目标蛋白的所述(洗脱)成分被SP-S印harose FF柱吸收，洗脱后纯化。人FGF23 氨基酸序列(SEQ ID NO 4)MLGARLRLffV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSffGGLI HLYTATARNS YHLQIHKNGHVDGAPHQTIYSALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSPQYHFLVSLGRAKRAFLPGMN PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTRS AEDDSERDPL NVLKPRARMTPAPASCSQELPSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKFI(实施例3)生产人抗体的小鼠的产生(KM小鼠)用于制备人单克隆抗体的生产完全人抗体的小鼠具有内源性Ig重链和K-轻链都被破坏的纯合体遗传背景，同时具有包含人Ig重链基因位点的第14号染色体片段(SC20)和人Ig K -轻链转基因(KCo5)。所述小鼠通过A品系小鼠和B品系小鼠的杂交育种获得，其中A品系小鼠具有人Ig重链基因位点，B品系小鼠具有人Ig K -轻链转基因(KCo5)。所述A品系小鼠为内源性Ig重链和K-轻链都被破坏的纯合体，且具有可被传递给后代的第14号染色体片段(SC20)的小鼠品系。此小鼠品系在如Tomizuka等作出的报道中被描述(Tomizuka，等，Proc Natl. Acad. Sci. USA. , 97 :722-727, 2000) 此外，所述 B品系小鼠为内源性Ig重链和K -轻链都被破坏的纯合体,且具有所述人Ig K -轻链转基因(KCo5)的转基因小鼠品系。此小鼠品系在如Fishwild等作出的报道中被描述(Nat.Biotechnol. ， 14 ;845_851，1996)。在以下的免疫实验中所用的小鼠个体是由雄性A品系小鼠和雌性B品系小鼠或雄性B品系小鼠和雌性A品系小鼠杂交所获得的小鼠，并且，在此所用的小鼠血清中可同时检测到人 Ig 重链和 K _ 轻链[Ishida&Lonberg, IBC' s Ilth Antibody Engineering,Abstract 2000]。此外,所述产生人抗体的小鼠也可通过缔结合约的方法从Kirin BeerCompany公司获得。(实施例4)抗人FGF23的人单克隆抗体的制备(I).产生抗人FGF23的人单克隆抗体的杂交瘤的获得。本实施例中所用单克隆抗体可用普通方法制备,如，由Tamio Ando等编写的"单克隆抗体实验室操作说明"("Introduction to monoclonal antibody experimentalmanipulation" ), (Kodansha出版，1991)。实施例2中制备的全长人FGF23蛋白被用作免疫原，使用可产生实施例3中制得的人免疫球蛋白的人抗体生成小鼠。为制备人抗FGF23单克隆抗体，首先，将实施例2中得到的经纯化的全长人FGF23蛋白与RIBI佐剂(Corixa)在腹腔内混合，并在首次免疫时以每只小鼠20 μ g的剂量，将其腹腔接种于人抗体生成小鼠。与首次免疫相类似，在两周的时间间隔内，将纯化得到的FGF23蛋白与RIBI佐剂(Corixa)混合物共接种小鼠3次。五只小鼠被用于免疫作用，第三次免疫后，抽取血液样本，利用下述酶标识免疫吸附法(ELISA法)，血清中抗FGF23人IgG抗体的存在得到确认。利用ELISA方法，使用由用抗FGF23蛋白单克隆鼠抗体一3CIE抗体而固定化的FGF23，血清中含有最高(抗FGF23人IgG抗体)浓度值的小鼠被筛选出来，其中，所用抗FGF23蛋白单克隆鼠抗体--3CIE抗体被公开于国际专利出版号W003/057733(作为FERM BP-7839被保藏的杂交瘤产生的抗-FGF23抗体)。在进行如下所描述的脾脏分离之前3天，通过鼠尾静脉(接种)给药，以每个小鼠给药20μ g全长人FGF23蛋白免疫小鼠。所述脾脏用外科手术从经免疫的小鼠中分离出来，并被浸入含有350mg/mL碳酸氢钠、50单位/mL青霉素、50 μ g/mL链霉素的IOmL无血清DMEM培养基中(Invitrogen,以下称作无血清DMEM培养基)，然后用刮勺(spatula)将其碾碎在滤网(mesh)上(细胞滤器Falcon)。通过此滤网(mesh)的所述细胞悬浮液经离心后，生成细胞沉淀，然后，用无血清DMEM培养基漂洗这些细胞两次，接着，对悬浮在无血清DMEM培养基中的这些细胞进行细胞计数。当骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC No. CRL-1581)在含有10% FCS(Sigma)的DMEM(Invitrogen)培养基(以下称作含血清DMEM培养基)中，于37°C和存在5% CO2条件下进行培养时，要使其细胞密度不高于I X IO6细胞/mL。同样，用无血清DMEM培养基漂洗这些骨髄瘤细胞，并悬浮在无血清DMEM培养基中进行细胞计数。回收得到的脾脏细胞悬浮液与鼠骨髄瘤细胞悬浮液按5 I的细胞数目比例混合并离心后，将上清液完全去除。对所述细胞团,在一边用移液管尖端搅拌此细胞团时,一边缓慢加入作为融合介质的ImL 50%(w/v)的聚こニ醇1500 (Boehringer-Manheim),然后分两次缓慢加入预热到37°C的ImL无血清DMEM培养基，再加入7mL无血清DMEM培养基。离心后，去除上清液，得到融合细胞。由此所得的融合细胞用如下所述的有限稀释法进行筛选。杂交瘤的筛选通过在含10% FCS、IL-6(10ng/mL)(或10%杂交瘤克隆因子(以下称作HCF) =Biobase)、次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶脱氧核苷(T)(以下称作HAT Sigma)的DMEM培养基中培养来完成的。此 夕卜，用含HT(Sigma)、10% FCS和10% HCF的DMEM培养基，并通过有限稀释法，进行单个克隆。(细胞的)培养在96孔微量滴定板(Becton，Dickinson)上进行。生成抗-FGF23人单克隆抗体的杂交瘤克隆的选择(筛选)和由各个产生杂交瘤的人单克隆抗体的品质鉴定，通过如下所述的酶标识免疫吸附法(ELISA法)进行。結果，得到许多杂交瘤，所述杂交瘤包含人免疫球蛋白Y链(hlg Y)和人免疫球蛋白轻链K，并且可产生具有与人FGF23特殊反应活性的人单克隆抗体。从这些所得到的许多杂交瘤中，作为产生识别FGF23蛋白的抗体的杂交瘤，特别获得2个克隆(C10和C15)。此外，在包括本实施例在内的以下所有实施例中，生成本发明的抗-FGF23人单克隆抗体的各杂交瘤克隆用符号代表。在所述符号的前或后所出现的“抗体”意指由杂交瘤生成的抗体，或由宿主细胞产生的重组抗体，所述宿主细胞带有从所述杂交瘤中分离出来的抗体基因(全长或可变区)。在本文明确指出的范围内，有时杂交瘤克隆的名称可表示抗体的名称。在2007年2月2日，ClO杂交瘤克隆已保藏于位于日本的国际专利生物体保藏中心国立先进エ业科学和技术研究院(International PatentOrganism Depositary(IPOD)National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology (AIST)), Tsukuba Central 6,1-1-lHigashi, Tsukuba, Ibaraki)(保藏号为FERM ABP-10772) (ID 标签C10)。(2)来自于所述杂交瘤培养物上清液的ClO和C15抗体的纯化实施例4(1)中得到的ClO和C15杂交瘤被限制培养在含有胰岛素(Syg/ml，Invitrogen)、人转铁蛋白(5 μ g/ml, Invitrogen)、ニ磷脂酰甘油(0. OlmM, Sigma)、亚硒酸钠(2. 5X 10-5mM, Sigma) >I % Low IgG 胎牛血清(Hyclone)的 eRDF 培养基(KyokutoSeiyaku)中。所述杂交瘤被培养在长颈瓶中，所得培养物上清液被回收。利用Protein GFast Flow凝胶(GE Healthcare, Bioscience),使所述培养物上清液被亲和性纯化,此法使用PBS(-)为吸附缓冲液，O. IM甘氨酸缓冲液为洗脱缓冲液(pH 2. 8)。通过加入IM Tris (pH
9.0)，将洗脱成分的pH值调整到约为pH 7. 2。使用S^hadex G25脱盐层析柱(NAP column ；GE Healthcare Bioscience),由此制得的所述抗体溶液被PBS所置换,然后通过孔径为
O.22 μ m膜过滤器MILLEX-GV(MiIlipore)的过滤灭菌作用，使其无菌化，从而得到纯化的ClO和C15抗体。通过测定经纯化的抗体在280nm的吸光值，来测定其浓度，其中，计算基准为 I.40D = lmg/mL。(实施例5)编码ClO抗体的抗体基因的获得及其序列的測定(I). ClO抗体的cDNA序列的合成为获得表达于ClO杂交瘤的含有人抗体重链和轻链的抗体可变区的所述DNA片段，应用5' RACE法(5, cDNA末端快速扩增技术)进行克隆，所述5, RACE法使用可与人抗体重链和轻链恒定区特异性结合的引物。具体是，进行克隆时所用的试剂盒为BD SMARTRACE cDNA扩增试剂盒(Becton Dickinson Bioscience Clonetech),克隆按试剂盒所附的操作说明进行。、根据操作说明，将RNA抽提试剂ISOGEN(Nippon Gene)加入到ClO杂交瘤中，取15 μ g纯化得到的总RNA用作cDNA合成的原料。以各个约I μ g的纯化获得的总RNA为模板，制得第一链cDNA。除RNA之外的所有试剂和酶均由BD SMART RACE cDNA扩增试剂盒(cDNA扩增试剂盒)提供。在第一链cDNA的合成中，总RNAI μ g/3 μ I5' CDSI μ ISMART Oligo I μ I由上述组分组成的反应混合物于70°C孵育2分钟，然后，加入
5 X Buffer 2 μ DTT I μ dNTP Mix I μ PowerScript 反转录醉 I μ 接着，于42°C孵育1. 5小时。进ー步地，加入50μ1 Tricine-EDTA缓冲液，然后于72°C孵育7分钟，获得第一链cDNA。⑵PCR方法扩增所述重链和轻链基因，并确认其核苷酸序列(2)-I ；PCR方法扩增所述重链和轻链基因为扩增编码所述ClO抗体的基因的cDNA，下述的反应混合物被制备并被用于PCR，所使用的ー组PCR引物包括3'引物和5'引物，其中，所述3'引物序列具有对人抗体基因的特异性序列(所述特异性序列将在下面被描述)，所述5'引物(通用引物A混合物)与添加于所述cDNA的5'末端的序列特异性杂交结合，所述cDNA用BD SMART RACE cDNA扩增试剂盒合成，此外，PCR所用酶为KOD-Plus-DNA聚合酶(Toyobo)。无菌水H2028 μ
第 I 链 cDNA2.5 μ
KOD-Plus-缓冲液(IΟΧ)5 μ
dNTP Mix (2 mM)5 μ
MgSO4 (25 mM)2 μ
KOD-Plus- (I 单位/μ )I μ 通用引物A混合物(UPM) (IOX)5 μ
基因特异性引物(GSP)(IOpM)1.5 μ 总体积50 μ 对于所述重链基因的扩增反应，所使用的引物为SMART RACE cDNA扩增试剂盒中的UPM引物和IgGlp引物(SEQ ID NO :5)，而对于所述轻链基因的扩增，所使用的引物为SMART RACE cDNA扩增试剂盒中的UPM引物和hk_2引物(SEQ ID NO 6)。IgG Ip TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTG(SEQ ID NO :5)hk-2 GTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGC (SEQ ID NO:引物 6)此外，所用的反应条件如下重复5个循环，每个循环包括94°C /30秒，72°C /3min,重复5个循环，每个循环包括94°C /30秒，70V /30秒，72V /3min重复25个循环，每个循环包括94°C /30秒，68°C /30秒，72°C /3min进ー步地,2 μ I所述反应混合物通过加入98 μ I Tricine-EDTA缓冲液得到稀释，所得5 μ I稀释液作为模板用于第二次(巢式)PCR反应所述PCR反应溶液的组成如下
无菌水H2O30 μ
第一次PCR反应溶液(50倍稀释) 5 μ KOD-Plus-缓冲液(IOX)5 μ
dNTP Mix (2 mM)5 μ
MgSO4 (25 mM)2 μ
KOD-Plus- (I 单位/μ )I μ 巢式通用引物A (NUP; 10 μΜ)I μ
基因特异性引物(GSP)(10pM)I μ
总体积50 μ 在上述反应中，用于所述重链基因扩增的ー组引物为NUP引物(在SMART RACEcDNA 扩增试剂盒中；Becton Dickinson Bioscience Clonetech)和 hh2 引物(SEQ ID NO:7) ο用于所述轻链基因扩增的ー组引物为UPM引物和hk-5引物(SEQ ID NO :8)。所述反应温度条件如下起始温度94°C lmin，然后重复20个循环，每个循环由94°C/5sec，68°C/10秒和72°C /3min组成，最后，72°C加热7min。hh2 GCTGGAGGGCACGGTCACCACGC(SEQ ID NO :7)hk-5 AGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC(SEQ ID NO :8)⑵-2 ;所述抗原基因的核苷酸序列的測定经扩增的重链PCR片段(以下称作HV [C]:由H链 的5'-非翻译区的前导序列，可变区(HV)和恒定区的部分区域[C]组成)和经扩增的轻链PCR片段(以下称作LV[C]由L链的5'-非翻译区的前导序列，可变区(LV)和所述恒定区的部分区域[C]组成)通过こ醇沉淀法被回收，然后用琼脂糖凝胶电泳法回收。再通过使用膜的DNA纯化试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen))进行纯化。经纯化的HV[C]扩增片段或LV[C]扩增片段分别被亚克隆到Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Zero Blunt TOPO PCR克隆盒)(Invitrogen)的PCR 4 Blunt-ΤΟΡΟ载体上，对所获得的克隆的质粒DNA，作插入DNA的核苷酸序列分析。DNA的核苷酸序列测定所用的引物是M13-20FW(SEQ ID NO 9)和M13RV(SEQID NO :10)。M13-20FW GTAAAACGAC GGCCAGTG(SEQ ID NO :9)M13RV CAGGAAACAGCTATGAC(SEQ ID NO :10)编码CIO抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA核苷酸序列，以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列展示如下〈C10重链核酸序列 > (可变区从ATG起始密码子到编码羧基末端氨基酸残基的DNA 序列)(SEQ ID NO 11)102030405060ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CTCCAGGTGC TCACTCCCAG708090100110120GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTTTCC130140150160170180TGCAAGGCAT CTGGATACAC CTTCACCAAC CACTATATGC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT190200210220230240GGACAAGGGC TTGAGTGGAT GGGAATAATC AACCCTATTA GTGGTAGCAC AAGTAACGCA250260270280290300CAGAAGTTCC AGGGCAGAGT CACCATGACC AGGGACACGT CCACGAGCAC AGTCTACATG310320330340350360GAGCTGAGCA GCCTGAGATC TGAGGACACG GCCGTGTATT ATTGTGCGAG AGATATTGTG370380390400408GATGCTTTTG ATTTCTGGGG CCAAGGGACA ATGGTCACCG TCTCTTCA〈C 10重链氨基酸序列 > (到前导序列和可变区)(SEQ ID NO : 12)(划线部分氨基酸残基代表作为分泌信号的前导序列)102030405060MDffTffRVFCL LAVAPGAHSQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN HYMHWVRQAP708090100110120
GQGLEWMGII NPISGSTSNA QKFQGRVTMT RDTSTSTVYM ELSSLRSEDT AVYYCARDIV130136DAFDFffGQGT MVTVSS〈CIO轻链核酸序列 > (可变区从ATG起始密码子到编码羧基末端氨基酸残基的DNA 序列)(SEQ ID NO 13)102030405060ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTTCTGC TGCTCTGGCT CCCAGGTGCC
708090100110120AGATGTGCCA TCCAGTTGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT CTGCATCTGT AGGAGACAGA130140150160170180GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGGGC ATTAGCAGTG CTTTAGTCTG GTATCAGCAG190200210220230240AAACCAGGGA AAGCTCCTAA GCTCCTGATC TATGATGCCT CCAGTTTGGA AAGTGGGGTC250260270280290300CCATCAAGGT TCAGCGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG310320330340350360CAGCCTGAAG ATTTTGCAAC TTATTACTGT CAACAGTTTA ATGATTACTT CACTTTCGGC370380384CCTGGGACCA AAGTGGATAT CAAA〈C10轻链氨基酸序列 > (到前导序列和可变区)(SEQ ID NO 14)(划线部分氨基酸残基代表作为分泌信号的前导序列)102030405060MDMRVPAQLL GLLLLffLPGA RCAIQLTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISSALVffYQQ708090100110120KPGKAPKLLI YDASSLESGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQFNDYFTFG128PGTKVDIK此外，在亚克隆于载体PCR 4Blunt_T0P0的ClO抗体的基因序列中，所述人抗体恒定区的部分序列被克隆，且此区域的DNA核苷酸序列也得到分析。其结果，可确认编码由Kabat等编写的EU index中所示的重链恒定区118位到191位氨基酸残基的序列，在此区域中，此序列被确认与人IgGl的氨基酸序列完全一致，且ClO抗体亚类为IgGl。此外，通过使用同样的方法，编码C15抗体的抗体基因也被获得，此抗体所属序列也得到确定。(实施例6)重组ClO抗体表达载体的构建ClO表达载体的产生(技术方案显不在图I)利用PCR技术，使用KOD-Plus-DNA聚合酶，以获得的含有ClO抗体LV[C]链的质粒DNA为模板，使用在其末端被设计成连上限制酶切位点(5,末端Bglll，3'末端BgIII)的引物 C10_L5_Bgl(SEQ ID NO :15)和 C10_L3_Bsi (SEQ ID NO :16)，所述ClO 抗体的 LV (轻链的前导序列+可变区)DNA被扩增。所述反应温度条件为起始温度94°C加热lmin，每个循环包括94°C /5秒和68°C /45秒重复此循环35次，最后，72°C加热3min。经扩增的DNA片段用限制性内切酶BglII和BsiWI消化处理后，再用琼脂糖凝胶电泳法纯化，回收得到约400bp DNA。另一方面，所述载体,N5KGl_Val Lark 载体(IDEC Pharmaceuticals, N5KG1 修饰型载体(美国专利6001358))同样经限制性内切酶BglII和BsiWI消化处理，并经碱性磷酸酶(E. coli C75) (Takara Shuzo Co. ,Ltd.)去磷酸化作用处理,然后用琼脂糖凝胶和DNA纯化试剂盒纯化，回收得到稍小于9kb的DNA。这两条DNA片段经T4 DNA连接酶连接后，转染到大肠杆菌DH10B，以获得转化子。对含有插入DNA的转化子的质粒DNA作DNA核苷酸序列分析后，获得质粒DNA，N5KGl_C10_Lv，其中，ClO抗体的LV被插入到编码N5KGl_Val Lark人抗体轻链恒定区的5'上游处的框架内。下一歩，所述ClO抗体的HV DNA(重链前导序列+可变区)被插入质粒载体(N5KGl_C10-_Lv)，其中，此质粒载体中已被插入LV。以含有所述ClO抗体的HV [C]的被亚克隆于pCR4Blunt-T0P0载体的质粒DNA为模板，使用设计成末端连有限制酶切位点(Sail位于Y末端，NheI位于:V末端)的引物C10_H5_Sal (SEQID NO 17)和C10_H3_Nhe (SEQ ID NO :18)，用PCR扩增HV0所述反应温度条件为起始温度94°C加热lmin，每个循环包括94°C /5秒和68°C /45秒，重复此循环35次，最后，72°C加热7min。经纯化的扩增的HV DNA片段被亚克隆于pCR4Blunt_T0P0载体，对由此获得的克隆的质粒DNA，作插入DNA的核苷酸序列分析。DNA的核苷酸序列測定所用的引物是上面所述的M13-20FW和M13RV。对亚克隆，作插入部分DNA的核苷酸序列的分析，这与作为模板的HV没有差异，此外，选择的质粒DNA(T0P0_C10_Hv)，其中的引物部分具有所设计的序列。这些DNA被限制酶SalI和NheI消化后，用琼脂糖凝胶电泳法纯化，回收得到约420bp的DNA，此DNA片段用T4DNA连接酶连接到同样地经限制酶(Sail和NheI)处理和去磷酸化处理的N5KGl_C10_Lv DNA (约9kb)上，然后，将所得连接产物转入到大肠杆菌DH10B，从由此得到的转化子中筛选出所述目标的质粒DNA。大量纯化由上述方法得到的抗体表达质粒DNA—N5KG1_C10_IH (克隆#1)，并证实在克隆过程中，L链和H链整个区域，及其插入位点周围的DNA核苷酸序列没有被引入变化(图2，图3)。进行DNA核苷酸序列的确认吋，使用SEQ ID NO :19-25的各种引物。制得的所述ClO抗体表达载体的简图见图4。此外，使用同样的方法，构建重组ClO抗体表达载体。C10_L5_Bgl GAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCT(SEQ ID NO :15)C10_L3_Bsi AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC(SEQ ID NO :16)C10_H5_Sal AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGGTCTTC(SEQ ID NO :17)C10_H3_Nhe AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC(SEQ ID NO :18)hh-4 GGTGCCAGGGGGAAGACCGATGG(S EQ ID NO :19)hh-1 CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAC (SEQ ID NO :20)CMVH903F GACACCCTCATGATCTCCCGGACC(SEQ ID NO :21)
CMVHRl303 TGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCT(SEQ ID NO :22)SEQU4618 TCTATATAAGCAGAGCTGGGTACGTCC(SEQ ID NO :23)
hk-1 TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC (SEQ ID NO :24)SEQU1783 GGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA(SEQ ID NO :25)(实施例7)重组型CIO抗体的制备通过将所述构建完成的ClO抗体表达载体转入宿主细胞，制得ClO抗体表达细胞。对于表达宿主细胞，使用在无血清培养基一EX-CELL325PF培养基(JRH，含有2mM谷氨酰胺，100单位/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(HT)补充物(I : 100) (Invitrogen))中条件性(conditioned)培养的ニ氢叶酸还原酶(DHFR)缺失的突变型CHO DG44细胞系(以下称作CHO细胞，IDEC Pharmaceuticals)。用电穿孔法进行
所述载体对宿主细胞的转入。通过电穿孔法，用限制酶AscI使约2yg ClO表达载体线性化，并在350V, 500 μ F条件下，使用BioRad Electroporator (BioRad电穿孔仪),将所述基因转入4X106 CHO细胞中，然后，将所得细胞接种于96孔细胞培养板。载体被转入宿主细胞后，加入G418并继续培养。对克隆进行确认检验后，筛选得到抗体表达株系。筛选得到的CHO细胞系在EX-CELL-325PF培养基(含有2mM谷氨酰胺，100单位/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(HT)补充物(I 100) (Invitrogen))中，于5% CO2条件下进行培养。所得培养物上清液被吸收在Mabselect Protein A column (GEHealthcare Bioscience)中，用 PBS 漂洗后，再用 20mM 朽1 樣酸钠盐(citrate-Na)和 5OmMNaCl (pH 3.4)缓冲液洗脱。用50mM pH 7. O磷酸钠盐缓冲液中和洗脱液。用去离子水稀释
I.5倍，将经稀释的洗脱液的导电率调整到4. 0ms/cm以下。紧接着，所得样品进料后被吸收到由 Q-Sepharose (Hitrap Q HP, GE Healthcare Bioscience)和 SP-Sepharose (HitrapSP FF, GE Healthcare Bioscience)连接组成的层析柱上，用20mM磷酸钠盐缓冲液(pH
5.0)漂洗，然后用PBS(-)洗脱。因此制得的抗体溶液通过孔径为0.22 μ m的膜过滤器，MlLLEX-GV(Millipore)，过滤除菌。通过检测其在280nm的光吸收值，计算经纯化的ClO抗体浓度，计算基准为[1.40D280 = lmg/mL]。另外，通过使用同样的方法，制备重组C15抗体。(实施例8)猕猴FGF23蛋白表达载体的构建将经EDTA处理后的猕猴静脉血和悬浮在PBS㈠中的5 % DextranT-2000 (GEHealthcare Bioscience)以2 : I的比例混合，以沉淀血红细胞。随后，上清液分层在淋巴细胞分离液(Ficoll-Plaque) (GE Healthcare Bioscience)的上层，离心得到淋巴细胞成分。由此所得的淋巴细胞被悬浮在IS0GEN-LS (Nippon Gene)，按照所附的实验方案，得到猕猴总淋巴细胞RNA。按照所附的实验方案，利用所制得猕猴总淋巴细胞RNA和第一链cDNA合成试剂盒(Invitrogen)，制备得到猕猴淋巴细胞cDNA文库。通过实施以下操作过程使编码猕猴FGF23的cDNA扩增所述猕猴淋巴细胞cDNA文库为模板，使用猴yFGF23FW引物(SEQID NO 26)和猴 FGF23RV 引物(SEQ ID NO :27)，以及 KOD plus DNA 聚合酶(Toyobo), 94°C孵育5min，然后进行45个PCR循环，每个PCR循环由94°C /20秒，55°C /30秒和72°C /50秒组成。所述猴FGF23FW引物退火后与存在于编码人FGF23的核苷酸序列5'上游区域的序列相结合，并在扩增得到的DNA片段FGF23编码区的5'处加入EcoRI限制酶位点。所述猴FGF23RV引物包含一段退火后可与包括编码人FGF23编码区終止密码子的序列相结合的序列，并包含有Not I限制酶位点。扩增所得的片段经EcoRI和NotI消化，再插入在pEAKS/IRES/EGFP载体的EcoRI和NotI限制酶位点处而被克隆，其中，所述pEAK8/IRES/EGFP载体在表达载体PEAKS (Edge Biosystem)内连接了内核糖体进入序列(IRES)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。对由此得到的质粒的核苷酸序列测序，以确定其编码猕猴FGF23蛋白，此载体被称为PEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23。此外，在本实施例中获得的猕猴FGF23的核酸序列和氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO 28和SEQ ID NO 29中。猴FGF23FW :CGGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCT(SEQ ID NO :26)猴FGF23RV :ATTTGCGGCCGCTAGATGAACTTGGCGAAGGGGC (SEQ ID NO :27)猕猴FGF23 核酸序列(SEQ ID NO 28)ATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCTCTGGGTCTGTGCCTTGTGCAGCGTCTGCAGCATGAGCGTCATCAGA GCCTATCCCAATGCCTCCCCATTGCTCGGCTCCAGCTGGGGTGGCCTGATCCACCTGTACACAGCCACAGCCAGGAACAGCTACCACCTGCAGATCCACAAGAATGGCCACGTGGATGGCGCACCCCATCAGACCATCTACAGTGCCCTGATGATCAGATCAGAGGATGCTGGCTTTGTGGTGATTACAGGTGTGATGAGCAGAAGATACCTCTGCATGGATTTCGGAGGCAACATTTTTGGATCACACTATTTCAACCCGGAGAACTGCAGGTTCCGACACTGGACGCTGGAGAACGGCTACGACGTCTACCACTCTCCTCAGCATCACTTTCTGGTCAGTCTGGGCCGGGCGAAGAGGGCCTTCCTGCCAGGCATGAACCCACCCCCCTACTCCCAGTTCCTGTCCCGGAGGAACGAGATCCCCCTCATCCACTTCAACACCCCCAGACCACGGCGGCACACCCGGAGCGCCGAGGACGACTCGGAGCGGGACCCCCTGAACGTGCTGAAGCCCCGGGCCCGGATGACCCCGGCCCCGGCCTCCTGCTCACAGGAGCTCCCGAGCGCCGAGGACAACAGCCCGGTGGCCAGCGACCCGTTAGGGGTGGTCAGGGGCGGTCGGGTGAACACGCACGCTGGGGGAACGGGCCCGGAAGCCTGCCGCCCCTTCGCCAAGTTCATCTAG猕猴FGF23 氨基酸序列(SEQ ID NO 29)MLGARLRLffV CALCSVCSMS VIRAYPNASP LLGSSffGGLIHLYTATARNS YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDAGFVVITGVMS RRYLCMDFGG NIFGSHYFNP ENCRFRHWTLENGYDVYHSP QHHFLVSLGR AKRAFLPGMN PPPYSQFLSRRNEIPLIHFN TPRPRRHTRS AEDDSERDPL NVLKPRARMT PAPASCSQELPSAEDNSPVA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEACRPFAKFI(2)猕猴FGF23表达细胞上清液的制备通过磷酸钙法，将pEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23瞬时转染到PEAK快速细胞(rapidcells) (Edge Biosystem)中，从而获得它们的培养物上清液。(实施例9)ClO抗体对猕猴FGF23结合能力的研究。通过以下用夹心ELISA的方法，研究了 ClO抗体不仅结合于人FGF23，同样也与猕猴FGF23结合。将实施例4中制得的ClO抗体、2C3B抗体和人IgGl对照抗体稀释在50mMNaHCO3溶液中，得到浓度为5 μ g/ml的稀释溶液，然后被加到96孔微孔板的各个孔中，4°C孵育12小时，以用于ELISA (Maxisorp (注册■商标)，Nunc)反应。由此，ClO抗体、2C3B抗体和作为对照的人IgGl对照抗体被吸收到微孔板中。接下来，除去所述这些溶液，并在每个孔中加入阻断剂(SuperBlock (注册商标)阻断缓冲液，PIERCE)，室温孵育30min，然后用含有O. 1% Tween20的Tris缓冲生理盐水(T-TBS)漂洗各个孔两次。将实施例2中纯化制得的全长人FGF23蛋白或实施例8中制得的表达猕猴FGF23的细胞上清液稀释到合适的浓度后，加到被抗-FGF23抗体覆盖的微孔板的各个孔中，与固定化的抗体反应两个小时，然后用含有O. 1% Tween20的Tris缓冲生理盐水(T-TBS)漂洗每个孔两次。接下来加入3 μ g/ml生物素标记的3C1E抗体，室温孵育I. 5小时，以使生物素标记的3C1E抗体与人或猕猴FGF23结合，其中，所述人或猕猴FGF23被结合在固定化抗体上。用T-TBS漂洗后，加入5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的链亲合素(DAKO)，使之反应I小吋，并用T-TBS漂洗3次。每孔加入含有四甲基联苯胺(DAKO)的底物缓冲液，室温孵育30min。每孔中加入O. 5M的硫酸，终止反应。以570nm波长为參照波长，用微孔板读出机(MTP-300，ColonaElectric Co.)检测其在450nm波长的吸光度。比较人全长FGF23蛋白和猕猴FGF23表达细胞培养物上清液在以3倍的稀释比进行稀释时的反应活性。所得结果显示在图5A和图B。正如图5A清楚显示的那样ClO抗体或2C3B抗体固定化时，对人全长FGF23蛋白的反应活性是相同的。在此条件下，对于猕猴FGF23表达细胞培养物上清液的稀释系列的反应性，在ClO抗体反应活性和2C3B抗体反应活性之间，没有观察到太大差异(图5B)。也即是，ClO抗体，与2C3B抗体相同，被证明能够结合于人和猕猴FGF23。
(实施例10)ClO抗体和2C3B抗体对正常猕猴血中磷浓度和血中I α，25- ニ羟基维生素D浓度的作用效果比较。FGF23具有以下的作用促进肾磷排泄和降低血液磷浓度，抑制肾中维生素D活化酶和降低血中Ia，25_ ニ羟基维生素D(以下称作1，25D)浓度(国际专利出版号W002/14504)。已证实将对2C3B抗体等FGF23，具有抑制作用，也即是，中和活性的抗体，给药于正常鼠，导致内源性FGF23活性的抑制、血清磷酸盐浓度和血清1，25D浓度升高(国际专利出版号W003/057733)。由此，这强烈表明对FGF23具有中和活性的抗体对由过量FGF23导致的包括肿瘤引起的软骨病、XLH等在内的人类疾病具有治疗作用。因此，研究了本发明中得到的人抗体一CIO抗体在体内对FGF23的中和活性。尤其是，由于对它在人体上的药理作用的期望，通过使用猴的内源性FGF23功能的抑制、以及猴的血清磷酸盐浓度和血清1，2 浓度的升高为指标，測定其中和活性能，其中，猴与其它动物种如啮齿类动物等相比，猴在进化上与人更接近。进行实验时，使用小鼠抗体一2C3B抗体，作为ClO抗体的比较对照。使用下面的方法，在未经处理的正常猕猴体内ClO抗体和2C3B对血清磷酸盐浓度的增长效果进行比较。使用实施例4中生产的ClO抗体。所用实验动物为2-3岁的雌性猕猴，体重2-4kg。各有3只动物被用于所述溶剂给药组和2C3B抗体给药组，4只动物被用于ClO抗体给药组。ClO抗体和2C3B抗体分别用PBS (-)配制成浓度为3mg/ml的抗体溶液，以此作为给药溶液。所述PBS(-)溶剂被用作阴性对照。ClO和2C3B抗体分别通过头臂静脉以lml/min的流速,分别按lmL/kg(相当于3mg/kg)给药量给药一次。通过L型 Wak 无机憐试剂(Wako Pure Chemical Industries)和 Hitachi Clinical AnalyzerModel 7180(Hitachi，Ltd·)，检测血清磷酸盐浓度。通过 1，25(0H)2D RIA Kit[TFB](Immunodiagnostic System),检测血清1,2 浓度。所述检测在抗体给药后O. 5、1、2、3、5、7、10、14、21、28、35、42、和49天分别进行。数据用平均值+/_标准误差表示。图6的数据显示了每种抗体给药后10天内定期收集的血液样本中血清磷浓度的变化。在测试期间，PBS (-)给药组血清磷浓度几乎不变，而在所述ClO抗体给药组和2C3B抗体给药组，与给药前和PBS(-)给药组相比，观察到明显的血清磷浓度升高。在所述ClO抗体和2C3B抗体给药组，血清磷浓度最高值出现时间均为抗体给药后第5天。在此时间点上，PBS(-)组、2C3B抗体组和ClO抗体组的血清磷浓度分别为5. 28mg/dl,8. IOmg/dI和9. 59mg/dl。比较抗体给药5天后2C3B抗体组和ClO抗体组的血清磷浓度与同时期的PBS(-)组的血清磷浓度的上升值，2C3B抗体组中血清磷浓度增长为2. 82mg/dl，而在ClO抗体组血清磷浓度增长为4. 31mg,(这些结果)表明，与所述2C3B抗体组相比，ClO抗体诱导的血清磷浓度增长是2C3B抗体诱导的血清磷浓度增长的I. 5倍以上(图7)。因此，与所述2C3B抗体给药组相比，ClO抗体给药组对血清磷浓度增长的作用明显更高。此外，给药10天后，2C3B抗体给药组的血清磷浓度与PBS (-)组的血清磷浓度处于相同水平，而ClO抗体给药组中的血清磷浓度(8. 76mg/dl)仍维持在比2C3B抗体给药组血清磷浓度最高水平(8. 10mg/dl)还要高的水平(图6)。另外，由ClO抗体引起的增加后血清磷浓度的保持时间比由2C3B抗体引起的増加后血清磷浓度保持时间更长，用2C3B抗体的所述保持时间是7天，这与PBS (-)给药组有明显差别，而用ClO抗体的所述保持时间是令人惊讶的35天，两者相差约5倍。同样地，对于抗体给药后的1，25D浓度，与2C3B抗体给药相比，ClO抗体给药后的1，25D浓度明 显上升，并且其保持时间明显延长(图8)。这些结果表明，与现有的FGF23中和抗体一2C3B抗体相比，在猕猴体内，ClO抗体具有更强的促血清磷浓度和血清1，2 浓度增长活性，也即是，具有更强的FGF23中和活性。目前对XLH等低血磷症性佝偻病的治疗，要求每天大剂量的磷和维生素D多次给药，以勉强维持磷浓度处于正常范围内。有报道表明给药多次性导致病人应变性差。本研究中，ClO抗体的单次给药即可得到对血清磷浓度和血清1，25D浓度持续性增长活性的事实表明，作为低磷血症治疗性药物，与常规的治疗方法相比，Cio抗体在治疗的疗效上很可能具有显著的优势。(实施例11)C15抗体对人和猕猴FGF23反应活性的确定用磷酸钙法将实施例11中制得的pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23或实施例8中制得的PEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23瞬时基因转染于PEAK快速细胞(Edge Biosystem)。转染3天后，收集每个培养物上清液。以实施例13中制得的C15抗体为ー抗(图9)，对所收集的培养物上清液作蛋白质印迹。结果表明类似于C15与人FGF23结合，C15也与猕猴FGF23结
ム
ロ ο(实施例12)ClO抗体和C15抗体对正常猕猴血磷浓度和血中I α，25- ニ羟基维生素D浓度的作用效果比较。实施例11表明C15抗体如同ClO抗体那样具有与人和猕猴FGF23重组蛋白结合活性。随后，对于ClO抗体和C15抗体，通过将其给予正常猕猴，比较其在体内对FGF23的中和活性。对猕猴内源性FGF23的中和活性的评价，以血磷浓度的上升值为指标来进行，使用实施例7中制得的ClO抗体和C15抗体。所用实验动物为2-3岁和体重2-3kg的正常猕猴。每个实验组使用2只雄性和一只雌性共3只动物。所用稀释介质为PBS(_)。制备的ClO抗体浓度为lmg/ml和3mg/ml, C15抗体浓度为3mg/ml。所述抗体通过隐静脉以Iml/min的流速,按lmL/kg的容量给药一次，以此获得lmg/kg和3mg/kg的ClO抗体给药剂量和3mg/kgC15抗体给药剂量。血清磷浓度通过L型Wako无机磷试剂(L型Wako无机磷试剂)(Wako Pure Chemical Industries)和日立自动分析仪7180 (Hitachi Clinical AnalyzerModel 7180 (Hitachi, Ltd.))被測定。采血在抗体给药前和给药1，3，5，7，10，14，21和28天后进行。测定在所有采血点的血清磷浓度。在ClO抗体lmg/kg给药组,ClO抗体3mg/kg给药组和C15抗体3mg/kg给药组，给药前它们的血清磷浓度分别为5. 37，5. 70和5. 58mg/dL，各组之间没有显著差异。给药后，所有猕猴体内均被观察到有血清磷浓度的增长。因此，不仅ClO抗体，而且C15抗体也显示出对猕猴内源性FGF23的中和活性。在ClO抗体lmg/kg给药组，ClO抗体3mg/kg给药组和C15抗体3mg/kg给药组,给药3天后血清磷浓度分别为
9.03,9. 10和8. 64mg/dL。在此时间点，ClO抗体lmg/kg给药组和C15抗体3mg/kg给药组的血清磷浓度达到最高值。另ー方面，ClO抗体3mg/kg给药组的血清磷浓度继续增长并在给药5天后达到最高值,此最高值为9. 75mg/dL。在ClO抗体lmg/kg给药组,ClO抗体3mg/kg给药组和C15抗体3mg/kg给药组，给药前和给药后的血清磷浓度最大差额分别为3. 67，4. 65和3. 06mg/dL。由此结果可知,在同样3mg/kg剂量下,与C15抗体( 对血清磷浓度的增长作用)相比，ClO抗体不仅显示出对血清磷浓度更高的增长作用。而且让人惊讶的是，ClO抗体lmg/kg剂量给药对血清磷浓度的增长作用比C15抗体3mg/kg剂量给药(对血清磷浓度的增长作用)还要高。接下来，对相比于给药前水平的血清磷浓度增长的持续时间进行了比较。其结果是所述ClO抗体lmg/kg给药组,ClO抗体3mg/kg给药组和C15抗体3mg/kg给药组的血清磷浓度增长的持续时间分别是14,28和7天。由此结果可知,在同样3mg/kg剂量下,与C15抗体(对血清磷浓度增长的持续时间)相比，ClO抗体不仅显示出对血清磷浓度增长活性的更高持续性。而且让人惊讶的是，ClO抗体lmg/kg剂量，比C15抗体3mg/kg剂量，可将血清磷浓度更长期地保持在高水平。以上这些事实说明，在猕猴体内，ClO抗体与同时获得的C15抗体(对血清磷浓度的作用)相比，ClO抗体具有更强的对血清磷浓度的增长活性和对血清磷浓度增长活性的持续性。也即是，与C15抗体相比，ClO抗体具有明显强的对猕猴FGF23的中和活性。(实施例13)人FGF23DNA片段(不含信号肽序列)的制备。按照操作说明书，用KOD-plus-DNA聚合酶(Toyobo)制备反应溶液。将FGF23 (-SP)FW 引物(SEQ ID NO :34)和 FGF23(-SP)RV 引物(SEQ ID NO :35)各 50pmol，作为模板的人FGF23-CDNA (从起始密码子到终止密码子共长756bp，SEQ ID NO :36)，添加到50 μ I反应溶液中，94°C孵育3min后，进行30个循环扩增，每个循环由98°C /15秒、63°C /15秒和680C /2min30秒组成。再在72°C孵育3min。所得684bp扩增片段用O. 8%凝胶分离收集。按照操作说明书，使用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen),从经回收的凝胶中回收所述扩增片段。用FseI (New England Biolabs Japan)对所回收的扩增片段进行酶消化,按照操作说明书，用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen)回收经酶处理的片段。由此得到与不含人FGF23的信号序列的人FGF23成熟形式相对应的部分DNA片段。FGF23(-SP) Fff TATCCCAATGCCTCCCCACTGCTCGGCTCCAGCTG(SEQ ID NO :34)FGF23 (-SP) RV :TTGGCCGGCCCTAGATGAACTTGGCGAAGGGGCGGCAGCCTTCCG (SEQ ID NO :35，包括FseI 位点)
所述人FGF23核苷酸序列(下划线标记为信号序列部分的，矩形框标记的是来自于所述(FGF23)全长序列的不含所述信号序列的人FGF23成熟形式区域的核苷酸)(SEQ IDNO 36)。
权利要求
1.一种分离的抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其含有SEQ ID NO :40所示的CDR1、SEQ ID N0:41 所示的 CDR2 和 SEQ ID NO :42 所示的 CDR3 作为重链 CDR，以及 SEQ IDNO 43所示的CDR1、SEQ ID NO 44所示的CDR2和SEQ ID NO 45所示的CDR3作为轻链CDR。
2.如权利要求I所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其中所述功能性片段是选自Fab、Fab'、F(ab' )2、二硫键稳定的Fv(dSFv)、二聚化的V区域(双体)、单链Fv(scFv)和CDR的肽段。
3.如权利要求I所述抗人FGF23抗体，其中，所述抗体的种类是IgG、IgA、IgE或IgM。
4.如权利要求3所述抗人FGF23抗体，其中，所述抗体的亚类是IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4。
5.一种药物组合物，其含有如权利要求1-4中任何一项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段作为活性成分。
6.如权利要求1-4中任何一项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段在制备通过FGF23控制磷代谢和/或维生素D代谢的药物中的用途。
7.如权利要求1-4中任何一项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段在制备预防或治疗矿物质代谢紊乱相关性疾病的药物中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其中，所述矿物质代谢紊乱相关性疾病选自肿瘤性软骨病、ADHR、XLH、骨纤维性结构不良、麦-奥二氏综合征和常染色体隐性低血磷症。
9.如权利要求1-4中任何一项所述的抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段在制备预防或治疗疾病的药物中的用途，所述疾病选自骨质疏松症、佝偻病、高钙血症、低钙血症、异位钙化症、骨硬化、派杰病、甲状旁腺机能亢进症、甲状旁腺机能减退症和搔痒症。
全文摘要
本发明提供一种抗FGF23抗体和通过使用此抗体对FGF23活性的抑制起到预防或治疗作用的一种作为预防或治疗药物的药物组合物。一种由杂交瘤细胞C10(索取号FERM BP-10772)产生的抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段。
文档编号A61P3/14GK102702355SQ201210161119
公开日2012年10月3日 申请日期2008年2月14日 优先权日2007年2月14日
发明者吉田均, 山下武美, 山崎雄司, 岛田孝志, 浦川到, 长谷川尚, 青野友纪子 申请人:协和发酵麒麟株式会社