细胞的培养方法、细胞培养装置及试剂盒的制作方法
【专利说明】细胞的培养方法、细胞培养装置及试剂盒 【技术领域】
[00011 本申请主张基于2013年7月26日中提出的日本国申请特愿2013-155550的优先权， 其全部内容并入本说明书中。
[0002] 本发明涉及细胞的培养方法、细胞培养装置及试剂盒。 【【背景技术】】
[0003] 【细胞培养】
[0004] 细胞在活体内一般作为三维的集团存在，但在经典的平面培养中，以细胞平铺在 容器的形状单层状培养。多有报告，由培养环境的差异，细胞的性质也大不同。另外，对于在 液体培养基中培养细胞的悬浮培养，有适宜于悬浮培养的细胞，也有不适宜的细胞。
[0005] SCIVAX Corporation开发的NanoCulture(注册商标)Plate(NCP)是由纳米印迹技 术，在底面实施模仿细胞外基质的图案化(微矩形和微蜂巢)的粘接型的3维培养多联盘。微 矩形是四角形状，微蜂巢是取六角形状的规则的的重复结构。通过细胞将此微图案作为支 架利用，能动地形成球形(细胞多数凝集而成三维状态）。
[0006] 另外，报告有使用将均一的极细胞突起(纳米柱)规则地多数列的细胞培养片（"纳 米柱细胞培养片"），进行结构与活体肝脏组织接近的3维之间细胞组织体(球形）的培养的 事例（Takahashi et al.，Tissue Engineering Part A.June 2012，Vol. 16，No.6，ρ· 1983-1995) 〇
[0007] 特开2009-213421记载使用蜂巢状多孔质膜(蜂巢膜)的球形的制造方法及球形制 造装置。
[0008] 这些细胞培养方法在是利用有正规则的重复图案的片(膜），细胞粘接于片的表面 状而增殖，由细胞培养形成的是同样的形状的细胞多数凝集而成三维状态的球形方面共 通，在其含义中限定。需求用于将细胞更简便地、有效、并且稳定培养的方法的开发。
[0009] 【聚酰亚胺多孔质膜】
[0010] 聚酰亚胺是指重复单位中含酰亚胺键的高分子的总称，通常，芳香族化合物直接 由酰亚胺键连接的芳香族聚酰亚胺。芳香族聚酰亚胺由于芳香族和芳香族经酰亚胺键而具 有共价结构，具有刚直且强固的分子结构，并且，由于酰亚胺键具有强的分子间力，有非常 高的水平的热、机械、化学性质。
[0011] 聚酰亚胺多孔质膜，自本发明前，以滤器、低介电常数膜、燃料电池用电解质膜等， 特别是以电池关系作为中心的用途利用。国际公开W02010/038873、特开2011-219585、及特 开2011-219586记载了，特别是，气体等的物质透过性优良，空孔率高，两表面的平滑性优 良，相对强度高，也不涉及高空孔率，有多数对向膜厚度方向的压缩应力的耐力优良的大空 隙的聚酰亚胺多孔质膜。
[0012] 【现有技术文献】
[0013] 【专利文献】
[0014] 专利文献 1:特开2009-213421
[0015] 专利文献 2:W02010/038873
[0016] 专利文献 3:特开2011-219585
[0017] 专利文献 4:特开2011-219586 [0018]【非专利文献】
[0019] 非专利文献 1: Takahashi et al ·，Tissue Engineering Part A· June2012， Vol.16,No.6,p.1983-1995 【
【发明内容】
】
[0020] 【发明要解决的技术课题】
[0021] 本发明涉及细胞的培养方法、以及用于所述培养方法的细胞培养装置及试剂盒。 [0022]【解决课题的技术方案】
[0023]不以限定为囝的，但本发明优选含以下的实施方式。
[0024]【实施方式1】
[0025] 细胞的培养方法，其包括将细胞适用于聚酰亚胺多孔质膜，进行培养。
[0026] 【实施方式2】
[0027]实施方式1所述的方法，其包括将细胞接种于上述聚酰亚胺多孔质膜的表面的工 序。
[0028]【实施方式3】
[0029] 实施方式1所述的方法，其包括下列工序：
[0030] 在上述聚酰亚胺多孔质膜的干燥的表面载乘细胞悬浮液，
[0031] 放置上述聚酰亚胺多孔质膜，或者移动上述聚酰亚胺多孔质膜而促进液的流出， 或者刺激表面的一部分，使细胞悬浮液被吸入上述膜，进而
[0032] 使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出。
[0033]【实施方式4】
[0034]实施方式1所述的方法，其包括下列工序：
[0035]将上述聚酰亚胺多孔质膜之一面或两面用细胞培养基或灭菌的液体润湿，
[0036]向上述润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液，进而
[0037]使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出。
[0038]【实施方式5】
[0039] 实施方式4所述的方法，其中活细胞停留在上述聚酰亚胺多孔质膜内，死细胞与水 分一同流出。
[0040] 【实施方式6】
[0041 ]实施方式4或5所述的方法，其中上述灭菌的液体是灭菌水或灭菌的缓冲液。
[0042]【实施方式7】
[0043]实施方式1~6之任一项所述的方法，其包括向细胞培养容器中放入细胞培养基、 细胞及1个或其以上的上述聚酰亚胺多孔质膜，其中，聚酰亚胺多孔质膜处于悬浮于细胞培 养基中的状态下。
[0044]【实施方式8】
[0045]实施方式7所述的方法，其特征在于使用2个以上的上述聚酰亚胺多孔质膜的小 片。
[0046] 【实施方式9】
[0047] 实施方式7或8所述的方法，其中细胞自发粘接到上述聚酰亚胺多孔质膜。
[0048]【实施方式10】
[0049] 实施方式1~6之任一项所述的方法，其中将上述聚酰亚胺多孔质膜
[0050] (i)折叠，
[0051] (ii)卷成卷状，
[0052] (iii)将片或小片用丝状的结构体连接，或者
[0053] (iv)结成绳状
[0054]而在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定。
[0055]【实施方式11】
[0056]实施方式10所述的方法，其中细胞自发粘接到上述聚酰亚胺多孔质膜。
[0057]【实施方式12】
[0058]实施方式1所述的方法，其包括将2个以上的聚酰亚胺多孔质膜上下或左右积层到 细胞培养基中使用。
[0059]【实施方式13】
[0060]实施方式1所述的方法，其中将实施方式2-12之任一项所述的方法的2种或更多种 方法组合使用。
[0061]【实施方式14】
[0062]实施方式1~13之任一项所述的方法，其中细胞在聚酰亚胺多孔质膜的表面及内 部生长增殖。
[0063]【实施方式I5】
[0064]实施方式1~14之任一项所述的方法，其中细胞选自动物细胞、昆虫细胞、植物细 胞、酵母菌及细菌。
[0065]【实施方式16】
[0066] 实施方式15所述的方法，其中动物细胞是属于脊椎动物门的动物来源的细胞。
[0067] 【实施方式17】
[0068] 实施方式15所述的方法，其中细菌选自乳酸菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及蓝细 菌。
[0069]【实施方式I8】
[0070] 实施方式1~14之任一项所述的方法，其中细胞选自多能性干细胞、组织干细胞、 体细胞及生殖细胞。
[0071] 【实施方式19】
[0072] 实施方式1~13之任一项所述的方法，其中细胞选自肉瘤细胞、株化细胞及转化细 胞。
[0073]【实施方式2〇】
[0074]实施方式1~19之任一项所述的方法，其中聚酰亚胺多孔质膜是含自四羧酸二酐 和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。
[0075]【实施方式21】
[0076]用于在实施方式1~20之任一项所述的细胞的培养方法中使用的细胞培养装置， 其含聚酰亚胺多孔质膜。
[0077]【实施方式22】
[0078]实施方式21所述的细胞培养装置，其中2个以上的聚酰亚胺多孔质膜上下或左右 积层。
[0079]【实施方式23】
[0080] 用于实施方式1~20之任一项所述的细胞的培养方法中使用的试剂盒，其含聚酰 亚胺多孔质膜。
[0081] 【发明效果】
[0082] 本发明基于向聚酰亚胺多孔质膜适用细胞，则细胞生长的发现。细胞优选自发粘 接到聚酰亚胺多孔质膜，可在膜的表面及内部增殖。由本发明的方法，将细胞简便，有效，并 且稳定培养变得可能。 【【附图说明】】
[0083]【图1】图1显示作为向聚酰亚胺多孔质膜的细胞悬浮液的接种形态的1实施方式自 然接种。
[0084]【图2】图2显示向作为聚酰亚胺多孔质膜的细胞悬浮液的接种形态的1实施方式吸 入接种。
[0085]【图3】图3显示人间质系干细胞的自然接种时的各接种面经时的变化。
[0086]【图4】图4显示人皮肤成纤维细胞的自然接种的各接种面经时的变化。
[0087]【图5】图5显示人皮肤成纤维细胞B面接种时的观测结果（24小时后）（湿膜法），显 示荧光显微镜照片及实体显微镜照片。
[0088]【图6】图6显示人间质系干细胞的A面吸入接种时的经时的变化(一点湿法）。
[0089]【图7】图7显示人间质系干细胞的B面吸入接种时的经时的变化(一点湿法）。
[0090]【图8】图8显示人间质系干细胞含浸接种时的各观测面经时的变化。
[0091]【图9】图9是人间质系干细胞含浸接种时的低倍率照片及关于实验的概观的照片。 [0092]【图10】图10显示PC 12细胞吸入接种时的经时的变化。
[0093]【图11】图11显示将人皮肤成纤维细胞使用膜厚25μπι的聚酰亚胺多孔质膜培养时 的细胞数。横轴显示培养后的天数，纵轴显示膜每1平方厘米的细胞数。
[0094]【图12】图12显示将人皮肤角化细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方 法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
[0095]【图13】图13显示将人脐带静脉内皮细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明 的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
[0096]【图14-1】图14-1显示将Vero细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(25μπι片）的本申请发 明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
[0097]【图14-2】图14-2显示将Vero细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(40μπι片）的本申请发 明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
[0098]【图14-3】图14-3显示将Vero细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(75μπι片）的本申请发 明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
[0099] 【图15-1】图15-1显示将HeLa细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(25μπι片）的本申请发 明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
[0100] 【图15-2】图15-2显示将HeLa细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(40μπι片）的本申请发 明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
[0101]【图15-3】图15-3显示将HeLa细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(75μπι片）的本申请发 明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
[0102] 【图16-1】图16-1显示将CH0细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(25μπι片）的本申请发明 的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。