m 2的培养皿放培养基4ml之中移动，在培养装置中进行培 养。
[0219] 48小时、4天、6天、9天后，将聚酰亚胺多孔质膜固定一染色，确认细胞的增殖。染色 用膜焚光染色剂CellMask(CellMask(商标）0range plasma membrane stain(Life Technologies公司）。之后，简记为CellMask)+DAPI进行。结果示于图10。在本细胞中也观测 到，在聚酰亚胺多孔质膜内形成集团着增殖的样式，确认适用的可能性。结果显示，作为代 表性的株化细胞之一的PC12细胞也可由本申请发明的方法培养。
[0220]【实施例7:培养细胞数的测定】
[0221]在本实施例中，将人皮肤成纤维细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方 法培养，测定培养细胞数。
[0222]【1、使用通常培养细胞的CCK8的细胞数测量】
[0223] 首先，使用以下的试剂及方法，通常测量培养中的细胞数，求出吸光度和实际的细 胞数的相关系数。
[0224] [试剂]细胞计数试剂盒8;同人化学研究所制溶液试剂（以下记作"CCK8"。）
[0225] [方法]一定期间在5cm2的室型培养皿上准备培养的人皮肤成纤维细胞，除去其培 养上清，用加2%的CCK8的一定量的培养基取代，在温育器内保存2小时。其后，移出着色的 上清，用480nm的波长测定吸光度（空白使用仅使用培养基测定的条件）。其后，除去同上清 后，用磷酸缓冲液清洗2次细胞，用0.05 %胰蛋白酶-EDTA溶液处理，对细胞数进行计数。
[0226] 由此方法求出培养条件和在CCK8浓度的条件的吸光度和实际的细胞数的相关系 数。
[0227] 【2.在聚酰亚胺多孔质膜上增殖的细胞数的测定】
[0228]与1同样地，将培养细胞的2cm2(l .4cm* 1.4cm)的聚酰亚胺多孔质膜移到5cm2的室 型培养皿，加一定量的加5 %的CCK8的培养基，在温育器内保存1~3小时，移出上清，用 480nm的波长测定吸光度。此时，使用2.5倍使用的CCK8，另一方面，由于仅面积2.5倍少的面 积有聚酰亚胺多孔质膜的面积，可直接进行与在1的阅读值的比较。（在使浓度或面积等的 条件变化时，换算变得必要。）使用1中求出的换算系数进行部件上生存的细胞数的计算，其 后，用培养基清洗2次，返回到温育器内继续培养。重复此作业，定量解析经时聚酰亚胺多孔 质膜上的细胞的增殖的样式。重复实验数，也进行再现性的验证。
[0229]进行各3次自然接种及吸入接种的结果示于图11。如图11所示，依赖于接种的方法 而细胞的增殖速度不同，但由1个月左右的培养而其差解消，到达类似的每单位面积的细胞 数。图中的虚线，由作为比较实验实施的培养皿等显示通常的附着培养时的培养细胞数上 限。基于面积比较细胞数时，相比通常的细胞培养，变得可在单位面积中培养更多的细胞。
[0230] 【实施例8:人皮肤角化细胞的培养】
[0231] 在本实施例中，将人皮肤角化细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方法 培养，用共聚焦激光显微镜及实体焚光显微镜观察。
[0232] 向2cmX2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基(KGM-Gold角化细胞增殖培养基 BulletKit(LONZA公司））0.5ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结 构的A面朝上而浸渍。将4 X104个的人皮肤角化细胞添加到上述正方形容器中的细胞培养 基。即，1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜每1个自然接种4 X 104个的人皮肤角化细 胞。
[0233]用细胞培养装置培养，在1天、3天、6天后，固定一染色。染色用CellMask+DAPI、或 者仅CellMask进行。其后，使用共聚焦激光显微镜(LSM700(Carl Zeiss公司制））及实体荧 光显微镜(Leica Ml65FC( Leica公司制））观察经时细胞的增殖和形态。
[0234] 结果示于图12。结果显示，作为人的原代培养细胞(原代培养细胞）的人皮肤角化 细胞也可由本申请发明的方法培养。
[0235] 【实施例9:人脐带静脉内皮细胞的培养】
[0236] 在本实施例中，将人脐带静脉内皮细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的 方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体焚光显微镜观察。
[0237] 向2cmX2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基（EGM-2BulletKit(L0NZA公司）） 0.5ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上而浸渍。将4 X 1〇4个的人脐带静脉内皮细胞添加到上述正方形容器中的细胞培养基。即，1.4cm见方的 正方形的聚酰亚胺多孔质膜每1个自然接种4X10 4个的人脐带静脉内皮细胞。
[0238] 用细胞培养装置培养，在3天、6天、10天后，固定一染色（CellMask+DAPI及 CellMask)。由染色、以及共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜的观察与实施例8同样地进 行。
[0239] 结果示于图13。结果显示，作为人的原代培养细胞(原代培养细胞）的人脐带静脉 内皮细胞也可由本申请发明的方法培养。
[0240]【实施例10:Vero细胞的培养】
[0241] 在本实施例中，将Vero细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方法培养， 用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察。聚酰亚胺多孔质膜使用25μπι、40μπι、75μπι的3 种。培养期间是1天-15天。
[0242] 向2cmX2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基（向DMEM添加 10%FBS及抗生物质 的）0.5ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上而浸渍。 将4 X 104个的Vero细胞添加到上述正方形容器中的细胞培养基。即，1.4cm见方的正方形的 聚酰亚胺多孔质膜每1个自然接种4X10 4个的Vero细胞。
[0243]用细胞培养装置培养，在1天、3天、7天、10天、15天后，固定一染色。染色用肌动蛋 白+DAPI进行，肌动蛋白的检测由鬼笔环肽进行。由共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜的 观察与实施例8同样地进行。
[0244] 结果示于图14-1~14-3。结果显示，即使对于作为代表性的株化细胞之一的Vero 细胞，也可由本申请发明的方法培养。
[0245] 【实施例ll:HeLa细胞的培养】
[0246]在本实施例中，将HeLa细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方法培养， 用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察。聚酰亚胺多孔质膜使用25μπι、40μπι、75μπι的3 种。培养期间、使用的显微镜、具体工序等如实施例10中记载。
[0247] 结果示于图15-1~图15-3。结果显示，即使对于作为代表性的株化细胞之一的 HeLa细胞，也可由本申请发明的方法培养。
[0248] 【实施例12:CH0细胞的培养】
[0249] 在本实施例中，将CH0细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方法培养，用 共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察。聚酰亚胺多孔质膜使用25μπι、40μπι、75μπι的3种。 在培养期间1天-7天，使用的显微镜、具体工序等如实施例10中记载。
[0250] 结果示于图16-1~图16-3。结果显示，即使对于作为代表性的株化细胞之一的CH0 细胞，可由本申请发明的方法培养。
【主权项】
1. 细胞的培养方法，其包括将细胞适用于聚酰亚胺多孔质膜，进行培养。2. 权利要求1所述的方法，其包括将细胞接种到上述聚酰亚胺多孔质膜的表面的工序。3. 权利要求1所述的方法，其包括下列工序： 在上述聚酰亚胺多孔质膜的干燥的表面载乘细胞悬浮液， 放置上述聚酰亚胺多孔质膜，或者移动上述聚酰亚胺多孔质膜而促进液的流出，或者 刺激表面的一部分，使细胞悬浮液被吸入上述膜，进而 使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出。4. 权利要求1所述的方法，其包括下列工序： 将上述聚酰亚胺多孔质膜之一面或两面用细胞培养基或灭菌的液体润湿， 向上述润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液，进而 使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出。5. 权利要求4所述的方法，其中活细胞停留在上述聚酰亚胺多孔质膜内，死细胞与水分 一同流出。6. 权利要求4或5所述的方法，其中上述灭菌的液体是灭菌水或灭菌的缓冲液。7. 权利要求1~6之任一项所述的方法，其包括向细胞培养容器中放入细胞培养基、细 胞及1个或其以上的上述聚酰亚胺多孔质膜，其中，聚酰亚胺多孔质膜处于悬浮于细胞培养 基中的状态下。8. 权利要求7所述的方法，其特征在于，使用2个以上的上述聚酰亚胺多孔质膜的小片。9. 权利要求7或8所述的方法，其中细胞自发粘接到上述聚酰亚胺多孔质膜。10. 权利要求1~6之任一项所述的方法，其中将上述聚酰亚胺多孔质膜 (i) 折叠， (ii) 卷成卷状， (iii) 将片或小片用丝状的结构体连接，或者 (iv) 结成绳状 而在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定。11. 权利要求10所述的方法，其中细胞自发粘接到上述聚酰亚胺多孔质膜。12. 权利要求1所述的方法，其包括将2个以上的聚酰亚胺多孔质膜上下或左右积层到 细胞培养基中而使用。13. 权利要求1所述的方法，其中将权利要求2~12之任一项所述的方法的2种或更多种 方法组合使用。14. 权利要求1~13之任一项所述的方法，其中细胞在聚酰亚胺多孔质膜的表面及内部 生长增殖。15. 权利要求1~14之任一项所述的方法，其中细胞选自动物细胞、昆虫细胞、植物细 胞、酵母菌及细菌。16. 权利要求15所述的方法，其中动物细胞是属于脊椎动物门的动物来源的细胞。17. 权利要求15所述的方法，其中细菌选自乳酸菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及蓝细菌。18. 权利要求1~14之任一项所述的方法，其中细胞选自多能性干细胞、组织干细胞、体 细胞及生殖细胞。19. 权利要求1~13之任一项所述的方法，其中细胞选自肉瘤细胞、株化细胞及转化细 胞。20. 权利要求1~19之任一项所述的方法，其中聚酰亚胺多孔质膜是含自四羧酸二酐和 二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。21. 用于在权利要求1~20之任一项所述的细胞的培养方法中使用的细胞培养装置，其 含聚酰亚胺多孔质膜。22. 权利要求21所述的细胞培养装置，其中2个以上的聚酰亚胺多孔质膜上下或左右积 层。23. 用于在权利要求1~20之任一项所述的细胞的培养方法中使用的试剂盒，其含聚酰 亚胺多孔质膜。
【专利摘要】本发明涉及细胞的培养方法、以及，用于在所述培养方法中使用的细胞培养装置及试剂盒。本发明的细胞的培养方法包括将细胞适用于聚酰亚胺多孔质膜，进行培养。本发明的方法在一实施方式中，包括将细胞接种到上述聚酰亚胺多孔质膜的表面的工序。或者，在一实施方式中，其包括下列工序：在上述聚酰亚胺多孔质膜的干燥的表面载乘细胞悬浮液，放置上述聚酰亚胺多孔质膜，或者移动上述聚酰亚胺多孔质膜而促进液的流出，或者刺激表面的一部分，使细胞悬浮液被吸入上述膜，进而使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出。或者，在一实施方式中，其包括下列工序：将上述聚酰亚胺多孔质膜之一面或两面用细胞培养液或灭菌的液体润湿，向上述润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液，进而使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出。
【IPC分类】C12N1/20, C12N1/16, C12M3/00, C12N1/00, C12M3/04, C12N5/071, C12N11/08, C12M1/00, C12N5/04
【公开号】CN105452440
【申请号】CN201480042131
【发明人】萩原昌彦, 川口哲夫, 马场浩祐, 清水基久
【申请人】宇部兴产株式会社
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年7月25日
【公告号】CA2919082A1, EP3026108A1, US20160168560, WO2015012415A1