专利名称：一种新型高效非细胞性疫苗的制备及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学和医学领域，更具体地涉及一种新型高效疫苗的制备方法以及该类疫苗在各类肿瘤及感染性疾病预防和治疗中的应用。
背景技术：
肿瘤及感染性疾病的主动性免疫治疗是治疗及预防肿瘤或感染性疾病的有效手段，自从人类采用接种牛痘预防天花以来，人类在感染性疾病的预防及控制上取得了很大的进展，目前在我国已经基本消灭了天花、脊髓灰质炎等感染性疾病，但在其他重大疾病的治疗方面如肿瘤及艾滋病、病毒性肝炎等疾病的预防及治疗方面，仍然缺乏有效的手段。
肿瘤的免疫治疗是继手术、放疗、化疗之后的一个新的治疗模式，肿瘤免疫治疗的中心环节就是诱导机体产生特异性和非特异性的抗肿瘤免疫。采用肿瘤疫苗去诱导特异性的抗肿瘤免疫，对于抑制肿瘤的生长及转移更为重要，目前尽管已知一些肿瘤抗原，但对于大多数肿瘤来说，肿瘤抗原仍是未知的。目前常用的肿瘤疫苗包括采用全细胞瘤苗、肿瘤细胞的裂解物、肿瘤抗原致敏的树突状细胞瘤苗、基因工程疫苗等，取得了一定的疗效，但也明显存在不足。
1.肿瘤相关抗原肽疫苗。目前人类已经获得了四类肿瘤相关抗原，(1)肿瘤特异性抗原，包括MAGE-1、MAGE-3、GAGE、RAGE等，这类抗原在正常组织除了睾丸和胎盘外不表达，只在肿瘤细胞中表达；(2)肿瘤分化抗原，包括MART-1、gp-100、酪氨酸激酶相关蛋白-1，分布于黑色素细胞瘤；(3)突变基因编码蛋白，如MUM-1等这些基因分布广泛，但在肿瘤组织中突变而成为肿瘤抗原；(4)在肿瘤组织高表达的一类抗原，如HER2-neu等。目前采用合成抗原肽或基因工程表达及DNA疫苗的方式制备该类疫苗。
2.树突状细胞瘤苗。树突状细胞是体内最强的专职性抗原递呈细胞，是抗肿瘤免疫应答的始作俑者，采用肿瘤细胞裂解物或肿瘤相关抗原肽致敏树突状细胞回输体内，可以诱导抗原特异性的免疫应答，目前该类疗法已经进入临床I-III期试验3.抗独特型抗体疫苗。抗独特型抗体可以模仿蛋白和抗原肽，在部分试验中人们已经可以应用抗独特型抗体诱导针对肿瘤相关抗原的特异性的免疫反应，该类疫苗的优势在于可以产生比抗原肽更强的免疫应答。
4.基因修饰的肿瘤疫苗。采用病毒或基因修饰肿瘤细胞作为瘤苗是研究较多的一类肿瘤疫苗，主要是采用细胞因子基因、共刺激分子等、希望提高肿瘤细胞的免疫原性，诱导抗肿瘤免疫应答。
然而，目前以上4种肿瘤疫苗均存在明显不足，许多肿瘤抗原不明确，无法诱导肿瘤特异性的CTL，而采用树突状细胞瘤苗和基因修饰的肿瘤细胞瘤苗，也存在体外操作复杂、质量难以控制、疗效有限等因素。
因此，本领域迫切需要开发新的疗效好、操作简便的新肿瘤疫苗。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效的用于肿瘤及感染性疾病治疗及预防的疫苗成分，该疫苗成分是采用细胞经热诱导后的外排体；本发明的另一目的是提供所述外排体的制法及用途。
在本发明的第一方面，提供了一种外排体，所述外排体是由细胞经热诱导后的产生的分泌至细胞外的囊泡，其中所述的细胞选自下组肿瘤细胞、病原体及被病原体感染的细胞；所述的囊泡具有以下特征(a)具有直径为50-100nm的囊泡结构；(b)含有选自下组的免疫分子肿瘤抗原或病原体抗原、MHC分子、粘附分子和共刺激分子；(c)含有选自下组的趋化因子MIP-1α、MIP-1β、MIP-3β、MCP-1和IP-10；(d)含有热休克蛋白分子。
在一优选例中，所述的外排体在体外可以趋化和激活免疫细胞，并且在体内诱导抗原特异性和非特异性的免疫应答反应。
在另一优选例中，本发明的外排体是用如下方法制备的
(1)将细胞在43±3℃下热诱导0.5-10小时，然后在37±2℃下孵育2-24小时，收集细胞培养上清，其中所述的细胞选自下组肿瘤细胞、病原体及被病原体感染的细胞；(2)300-500×g低速离心去除细胞，收集上清；(3)1000-3000×g中速离心去除细胞碎片和细胞器，收集上清；(4)7000-12000×g高速离心去除小细胞器和杂质，收集上清；(5)80000-120000×g超高速离心0.5-5小时，收集沉淀，即为外排体。
在另一优选例中，所述的细胞是肿瘤细胞，尤其是人的肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的外排体同时含有肿瘤抗原或病原体抗原、MHC分子、粘附分子、共刺激分子、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3β、MCP-1IP-10、和热休克蛋白分子。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，含有有效量的本发明所述的外排体和药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可以是治疗性的或预防性的。在一优选例中，它是疫苗。
在本发明的第三方面，提供了一种制备外排体的方法，包括以下步骤(1)将细胞在43±3℃下热诱导0.5-10小时，然后在37±2℃下孵育2-24小时，收集细胞培养上清，其中所述的细胞选自下组肿瘤细胞、病原体及被病原体感染的细胞；(2)300-500×g低速离心去除细胞，收集上清；(3)1000-3000×g中速离心去除细胞碎片和细胞器，收集上清；(4)7000-12000×g高速离心去除小细胞器和杂质，收集上清；(5)80000-120000×g超高速离心0.5-5小时，收集沉淀，即为外排体。
在一优选例中，各步骤的条件如下(1)置于41-45℃中热诱导1±0.5小时左右，然后在37℃孵育4-8小时，收集细胞培养上清；(2)300-500×g离心5-10分钟，收集上清；(3)1000-3000×g离心20±10分钟，收集上清；(4)7,000-12,0000×g离心30±15分钟，收集上清；(5)80,000-120,000×g离心1±0.5小时，收集沉淀，PBS洗涤，获得热诱导后外排体。
在本发明的第四方面，提供了本发明外排体的用途，它被用于制备预防或治疗肿瘤及感染性疾病药物。
在本发明的第五方面，提供了一种预防或治疗肿瘤及感染性疾病的方法，该方法包括，给个体施用安全有效量的本发明的热诱导外排体。
图1显示了本发明高效疫苗结构的电镜观察。
图2是本发明高效疫苗的鉴定。
图3显示了本发明高效疫苗表达趋化因子、MHC分子及热休克蛋白。
图4显示了本发明高效疫苗对树突状细胞及T细胞的趋化作用。
图5显示了本发明高效疫苗刺激T细胞或增强树突状细胞刺激T细胞增殖试验。
图6显示了本发明高效疫苗对肿瘤的抑制作用。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现细胞经热诱导后的外排体(exosome)是一种新的可用于肿瘤及感染性疾病高效疫苗，可以很好地解决疾病抗原不明确、难以诱导特异性免疫应答的不足，同时可以明显提高疗效，具有制备简便、特异性高、诱导免疫应答强、疗效好等特点。在此基础上完成了本发明。
外排体是细胞所释放的直径为50-100nm的微小的膜性囊泡，成熟的红细胞以外排体的形式将功能所不需要的浆膜蛋白排出细胞外，例如转铁蛋白受体(TfR)或乙酰胆碱脂酶等。通过电镜的深入研究，证实外排体不是由细胞膜直接芽生形成的，而是来源于称为多囊泡体(multivesicular bodies，MVBs)的由内吞过程形成的结构。这种小囊泡出现在MVBs内腔中，很可能是由MVBs内侧面的膜芽生而来。最后通过MVBs与胞浆膜的直接融合，这些小囊泡被释放到细胞外的基质中，即被称为外排体。近年来发现外排体并不仅仅由终期分化的网织红细胞唯一分泌，有人证实了EB病毒转染的B淋巴细胞可以分泌同样的这种小囊泡。在B淋巴细胞和抗原提呈细胞中，包括MVBs在内的这种参与内吞过程的结构正是多肽结合MHCII类分子的部位。EB病毒来源的含有多肽MHCII类分子复合物，并能够将其直接呈递给CD4+T淋巴细胞。Zitvogel等报道了DC同样也可以分泌外排体，并且这种DC来源的外排体含有MHCI类和MHCII类分子。当用肿瘤细胞来源的多肽冲击DC后得到的外排体，可以诱导CTL介导的抗肿瘤免疫反应，导致荷瘤小鼠的肿瘤生长明显抑制。最近，Zitvogel实验室又报道了人和小鼠的肿瘤细胞均能够持续分泌外排体，这些肿瘤细胞来源的外排体含有MHCI类分子和LAMP1并且能够将肿瘤抗原呈递给DC从而产生显著的CD8+T细胞依赖的抗肿瘤免疫反应，且这种免疫效应对同系的和异系的荷瘤小鼠有交叉治疗作用，提示肿瘤来源的外排体可能与肿瘤免疫密切相关。外排体可以作为肿瘤治疗的制剂和肿瘤疫苗，介导针对同系小鼠和不同系小鼠的肿瘤免疫保护作用。
在本发明中，与未经热休克的肿瘤细胞释放的外排体(EXO)相比，肿瘤细胞“经热休克后的外排体(HS EXO)”发生了质的改变，含有多种高浓度的趋化因子。趋化因子作为细胞因子中的一个超家族，是对白细胞具有趋化作用的一类小分子的细胞产物。趋化因子及其受体在炎症反应，免疫应答，抗感染，抗肿瘤中都起着非常关键性的作用。多种趋化因子可趋化免疫活性细胞以及抑制血管生成来抵抗肿瘤的生长和转移。
本发明的热诱导外排体具有一般外排体的基本特性以及自身独特的生物学特性(1)呈50-100nm的囊泡样结构，大小比较均一，结构完整；(2)含有抗原(包括肿瘤抗原、或衍生自微生物和其他感染细胞的抗原)、MHCI/II类分子、共刺激分子、转铁蛋白受体、LAMP-1和HSC70等热休克蛋白分子；(3)含有多种趋化因子，如MIP-1α(CCL3)、MIP-1β(CCL4)、MIP-3β(CCL19)、MCP-1(CCL2)和IP-10(CXCL10)；(4)可以趋化、活化树突状细胞及T细胞。
本发明的实验证实，热休克后外排体可以显著趋化DC和T细胞，提示外排体内趋化因子可以发挥趋化活性。HS EXO中含有高水平的MHCI类和II类分子以及多种共刺激分子、粘附分子、肿瘤抗原提呈的伴侣分子HSP70等，而且HS EXO中所含有的大部分免疫分子与EXO相比显著上调，提示HS EXO比EXO有更强的免疫学活性。用HS EXO和EXO治疗肿瘤，发现HS EXO有更好的肿瘤治疗效果，诱导出更强的CTL和特异性抗肿瘤免疫反应。以HS EXO作为疫苗，可以更好地保护同系和不同系荷瘤宿主免受肿瘤细胞的攻击，而且对荷瘤宿主已形成的肿瘤亦有明显的治疗作用。在注射HS EXO后4h肿瘤区即有DC的浸润，至24h左右即达到比较多的水平，提示HS EXO瘤体内注射后可以利用其中所含有的趋化因子迅速吸引DC到局部聚集，通过其表面的粘附分子与DC粘附，然后在共刺激分子的参与下，凭借自身HSP蛋白所携带的内源性肿瘤多肽将肿瘤特异性抗原和肿瘤共有抗原提呈给DC，继而促使DC的成熟并返回淋巴结，启动特异性免疫应答反应。HS EXO的瘤体内注射可以募集CD4+和CD8+的T淋巴细胞从而在局部形成有效的抗肿瘤免疫反应。
本发明还提供这种新型高效疫苗的制备方法，它主要包括步骤(a)在热诱导温度下热诱导一段时间，然后复苏。例如，将细胞在43±3℃下热诱导0.5-10小时，然后在37±2℃下孵育2-24小时，收集细胞培养上清，其中所述的细胞选自下组肿瘤细胞、病原体及被病原体感染的细胞；(b)分离获得热诱导外排体。较佳地，该分离包括步骤(i)低速离心去除细胞，、(ii)中速离心去除细胞碎片和细胞器、(iii)高速离心去除小细胞器和杂质和(iv)超高速离心，收集沉淀(即外排体)。应理解，这些步骤的具体条件可以有所保护，只要分离出外排体即可。一种优选的分离方法条件是(i)低速离心，300-500×g低速离心去除细胞，收集上清；(ii)1000-3000×g中速离心去除细胞碎片和细胞器，收集上清；(iii)7000-12000×g高速离心去除小细胞器和杂质，收集上清；(iv)80000-120000×g超高速离心0.5-5小时，收集沉淀，即为外排体。
在一优选例中，各步骤的条件如下(1)将要制备外排体的细胞置于在41-45℃中热诱导1小时左右，然后在37℃中孵育4-8小时，收集细胞培养上清；(2)300×g离心5-10分钟，收集上清；(3)1200×g离心20分钟，收集上清；(4)10,000×g离心30分钟，收集上清；(5)10,0000×g离心1小时，收集沉淀，PBS洗2次，获得热诱导后外排体。
本发明还提供了一种药物组合物或免疫组合物。在所述组合物中，含有药学上可接受的载体(包括稀释剂、赋形剂等)以及有效量的本发明热诱导外排体。热诱导外排体的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。
本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的热诱导外排体。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如肿瘤抗原)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体；它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。此外，免疫组合物中还可以含有免疫佐剂。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
本发明的含热诱导外排体的治疗或预防性药物组合物(包括疫苗)，可以经口服、皮下、皮内、腔内、瘤内或病变部位、淋巴结、静脉注射或埋植等方式应用。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。
本发明的热诱导外排体可用于治疗和预防肿瘤及感染性疾病发生，对已发生的肿瘤及感染性疾病具有治疗作用。代表性的例子包括(但并不限于)各种肿瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、恶性淋巴瘤、白血病、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、脑胶质瘤、膀胱癌、多发性骨髓瘤等以及各类感染性疾病如细菌、病毒、真菌、寄生虫感染包括艾滋病、各型病毒性肝炎等的预防及治疗。
本发明的主要优点在于(1)HS EXO内含有多种趋化因子、共刺激分子、MHC分子以及携带肿瘤抗原信息的HSP分子，因此其基本包含有以前所有疫苗的特征，是一种人工的抗原递呈囊泡(artificial antigen presenting vesicles，AAPV)。由于这种外排体来自于肿瘤细胞，携带有肿瘤抗原，又有几乎所有目前研制的高效肿瘤疫苗所必须的共刺激信号的特性，因此可作为一种非细胞性的新型疫苗。这种非细胞结构性的新型疫苗，可以有效诱导机体产生高效的抗肿瘤免疫应答，有效激发起特异性和非特异性抗肿瘤免疫，对肿瘤进行治疗以及预防其复发和转移。
(2)这种新型高效的肿瘤疫苗，未经基因修饰和外源基因导入，因此对机体潜在危害作用小，没有伦理的难题，无个体限制性。制备简单易行，是一种极有临床应用前景的新型生物制剂和疫苗，具有重要的应用价值和良好的市场前景，对有效控制肿瘤的发生发展、改善恶性肿瘤治疗现状具有重要意义，将有极大的社会效益和经济效益。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1热诱导外排体的制备取生长状态良好的(80％铺满)人肺腺癌细胞A549，先进行43℃热休克1h后，37℃恢复4h，收取培养上清，同时收取未经热休克的肿瘤细胞培养上清。4步离心法分离。即4℃离心300g，10分钟；1,200g，30分钟；10,000g，30分钟，最后，超速离心100,000g 60分钟，所获得的沉淀即为热诱导的细胞外排体。这种热诱导外排体可以直接作为高效的肿瘤疫苗或其主要活性成分。
重复上述步骤，分别用结肠癌细胞CT26、小鼠肺腺癌细胞3LL细胞、小鼠黑色素瘤细胞B16、小鼠肥大细胞瘤T815制得热诱导外排体。
实施例2热诱导外排体的鉴定外排体悬液用PBS洗2次，经固定液(2％多聚甲醛，0.25％戊二醛)4℃固定1h，用PBS洗一遍制成悬液滴片，1％锇酸固定，梯度酒精脱水，经超薄切片铅铀染色后透射电镜观察摄片。结果如图1所示，该外排体为均一的50-100nm的囊泡。
采用Western-blot分析其蛋白组成，结果如图2所示，该外排体表达MHC I类分子、Mac-1、转铁蛋白受体(Transferin receptor，TfR)、溶酶体相关膜蛋白(lysosome-associated membrane protein，LAMP)和HSC70。
实施例3热诱导外排体含趋化因子、MHC分子及热休克蛋白分子外排体经BCA法测蛋白浓度，加入上样缓冲液。于15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，每孔加入外排体30ug，电转移至硝酸纤维素膜(0.45u)(Bio-Rad公司)上，不同的一抗于4℃结合12h后，加入相应的二抗结合2h，按增强化学发光试剂盒(Amersham Life Sciences)说明书进行显影。
结果如图3所示，外排体中含有大量趋化因子、MHC分子及热休克蛋白分子。
实施例4热诱导外排体对树突状细胞及T细胞的趋化作用取1×106树突状细胞或T细胞重悬于含有0.5％BSA的0.1用l的RPMI 1640中，加入已事先铺满107B单层细胞的Transwell chamber(5μpore size；购于Costar公司)上孔中，上述外排体刺激后不同稀释度的培养上清加入下孔中，总量为0.6ml。于37℃ 5％CO2孵箱孵育4h后，收集下孔中的细胞，FACS标记后，于流式细胞仪上记数。
结果如图4所示，外排体趋化DC(CD11c+)和T细胞的数量明显增加。
实施例5热诱导外排体对树突状细胞刺激T细胞增殖的促进作用本实施例采用常规的3H-TdR掺入法进行分析，方法如下。分离正常外周血淋巴细胞，以完全培养基悬浮，注入T细胞尼龙毛柱，置37℃、5％CO2孵箱培养1小时，冲出非粘附的细胞作为反应细胞(即纯化的T细胞)，调节细胞浓度至2×106/ml，加入96孔圆底培养板，100μl/孔；取实施例1中制备的热诱导外排体20μg/ml致敏24h的第7天DC，以4000rad放射线灭活后，以2×103、6×103、2×104/孔/100μl分别加入已含有反应细胞的各孔，总体积200μl，每组3个复孔。置37℃、5％CO2孵箱中培养5天(120小时)，于培养结束前18小时加入3H-TdR(0.5μCi/孔)。收集细胞，液闪计数仪检测cpm值，结果以3孔平均值表示。
结果如图5所示。该热诱导外排体可以直接刺激或增强树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞的增殖反应。
实施例6热诱导外排体对肿瘤生长的抑制作用C57BL/6小鼠右腿部皮下接种2×105CT-26小鼠结肠癌细胞，随机分组，每组10只，3天后分别于对侧腿部皮下注射CT-26细胞来源的外排体，15μg/100μl/只。每间隔2天进行1次，共4次。治疗4周后处死小鼠，称瘤重结果如图6所示。采用本发明提供的新型肿瘤高效疫苗(热诱导外排体)，可以明显抑制肿瘤的生长。
此外，对于实施例1中用结肠癌细胞CT26、小鼠肺腺癌细胞3LL细胞、小鼠黑色素瘤细胞B16、小鼠肥大细胞瘤T815制得热诱导外排体，也获得了类似的结果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种外排体，其特征在于，它是由细胞经热诱导后的产生的分泌至细胞外的囊泡，其中所述的细胞选自下组肿瘤细胞、病原体及被病原体感染的细胞；所述的囊泡具有以下特征(a)具有直径为50-100nm的囊泡结构；(b)含有选自下组的免疫分子肿瘤抗原或病原体抗原、MHC分子、粘附分子和共刺激分子；(c)含有选自下组的趋化因子MIP-1α、MIP-1β、MIP-3β、MCP-1和IP-10；(d)含有热休克蛋白分子。
2.如权利要求1所述的外排体，其特征在于，所述的外排体在体外可以趋化和激活免疫细胞，并且在体内诱导抗原特异性和非特异性的免疫应答反应。
3.如权利要求1所述的外排体，其特征在于，是用如下方法制备的(1)将细胞在43±3℃下热诱导0.5-10小时，然后在37±2℃下孵育2-24小时，收集细胞培养上清，其中所述的细胞选自下组肿瘤细胞、病原体及被病原体感染的细胞；(2)300-500×g低速离心去除细胞，收集上清；(3)1000-3000×g中速离心去除细胞碎片和细胞器，收集上清；(4)7000-12000×g高速离心去除小细胞器和杂质，收集上清；(5)80000-120000×g超高速离心0.5-5小时，收集沉淀。
4.如权利要求1所述的外排体，其特征在于，所述的细胞是肿瘤细胞。
5.如权利要求1所述的外排体，其特征在于，所述的外排体同时含有肿瘤抗原或病原体抗原、MHC分子、粘附分子、共刺激分子、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3β、MCP-1IP-10、和热休克蛋白分子。
6.一种药物组合物，其特征在于，含有有效量的权利要求1所述的外排体和药学上可接受的载体。
7.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，它是疫苗。
8.一种制备外排体的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将细胞在43±3℃下热诱导0.5-10小时，然后在37±2℃下孵育2-24小时，收集细胞培养上清，其中所述的细胞选自下组肿瘤细胞、病原体及被病原体感染的细胞；(2)300-500×g低速离心去除细胞，收集上清；(3)1000-3000×g中速离心去除细胞碎片和细胞器，收集上清；(4)7000-12000×g高速离心去除小细胞器和杂质，收集上清；(5)80000-120000×g超高速离心0.5-5小时，收集沉淀，即为外排体。
9.如权利要求8所述的方法，各步骤的条件如下(1)置于41-45℃中热诱导1±0.5小时左右，然后在37℃孵育4-8小时，收集细胞培养上清；(2)300-500×g离心5-10分钟，收集上清；(3)1000-3000×g离心20±10分钟，收集上清；(4)7,000-12,0000×g离心30±15分钟，收集上清；(5)80,000-120,000×g离心1±0.5小时，收集沉淀，PBS洗涤，获得热诱导后外排体。
10.如权利要求1所述的外排体的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗肿瘤及感染性疾病药物。
全文摘要
本发明提供了一种新的肿瘤及感染性疾病的疫苗以及其制法和用途。该类疫苗为肿瘤细胞或病原体及其感染细胞经热诱导后的外排体(热诱导外排体)。本发明的热诱导外排体富含抗原分子、MHC分子、各类趋化因子、粘附分子、共刺激分子、热休克蛋白等，可以显著趋化和激活树突状细胞和T细胞等免疫细胞，有效诱导抗原特异性和非特异性的免疫应答反应，增强机体免疫功能。可用于肿瘤及各类感染性疾病的预防及治疗，具有制备简便、成本低、特异性强、疗效显著等特点。
文档编号A61K39/00GK1498658SQ0214502
公开日2004年5月26日 申请日期2002年11月4日 优先权日2002年11月4日
发明者王建莉, 王青青, 陈玮琳, 曹雪涛 申请人:杭州浙大康泰生物技术有限公司