专利名称：一种人二倍体细胞培养新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法
一种人二倍体细胞培养新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法
1.发明领域本发明属于生物技术领域,具体涉及一种新布尼亚病毒(SFTS bunyavirus)纯化灭活疫苗的制备方法。2.
背景技术：
新布尼亚病毒(Novel Bunyavirus, SFTS Bunyavirus),是发热伴血小板减少综合症(Fever with Throbocytopenia Associated syndrome, SFTS)的病原，为布尼亚病毒科白蛉热病毒属的一种新型病毒，于2009年在中国首先发现，也是中国首例发现的新型病毒。患者出现以高热、血小板减少、白血球降低、多器官功能紊乱、出血等为特征的严重急性传染病，严重影响着人民的健康和生命安全。到目前为止，全国已有河南、江苏、湖北、山东、 安徽和辽宁等16个省发现300多病例，造成40余人死亡。中国国家疾控中心、江苏省疾控中心先后成功的分离到该病病毒，并对其进行了病原学、流行病学、临床医学等研究。目前该病毒序列已经阐明，但是对SFTS尚无特效药治疗和疫苗预防。
3.
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一株新的，用于制备灭活疫苗的新布尼亚病毒JS-2007-001,该病毒分类命名为新布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopeniasyndrome virus ；Novel Bunyaviridae),其保藏号为 CCTCC V201211 ;保藏时间为 2012年3月I日；保藏单位为中国典型培养物保藏中心；保藏地址为武汉大学生命科学学院武汉市武昌珞珈山。本发明的目的之二在于提供了将上述新布尼亚病毒JS-2007-001制备成为纯化灭活疫苗的方法。本发明的优点在于，经过适应性培养、免疫原性鉴定和免疫保护作用鉴定发现，本发明中涉及的JS-2007-001病毒毒种具有最佳的生长特性和适应特性，在较短时间内达到生长高峰，可稳定获得较高滴度病毒，免疫动物获得抗体水平较高，从而能开发成为一种稳定的可商业化应用的纯化灭活疫苗。具体的，本发明涉及了一种新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法，其包括如下步骤1)采用转瓶培养人二倍体MRC-5细胞为产毒细胞；2)以保藏号为CCTCC V201211的新布尼亚病毒JS-2007-001作为毒种进行接种；3)接种、培养，收集病毒滤液；4)将病毒滤液进行灭活、除菌、浓缩和纯化；以及5)加入病毒保护剂，并检定合格后制备成品疫苗。在所述的制备方法中，其中所述的接种人二倍体MRC-5细胞的毒种为经二倍体细胞MRC-5传代适应的毒种，该毒种滴度按CCID5tl法不低于7. 01gCCID5(l/mL。上述制备方法的培养步骤具体为I)制备人二倍体细胞培养液。所述人二倍体细胞培养液为含10%新生牛血清、0. 3%水解乳蛋白、I % NaHCO3>2mM谷氨酰胺的MEM培养基；2)采用3L、10L或15L转瓶培养人二倍体细胞，其按I : 2或I : 4进行细胞传代，37°C培养，待细胞成片后接种二倍体细胞毒种；3)接种病毒。包括倒去培养液，加入浓度为100 1000CCID5Q/mL病毒，其MOI为O. 001 O. 0001 ;将接种病毒后的细胞置于33°C 35°C 12小时，使病毒与细胞充分接触吸附；然后倒去病毒液，用O. 01磷酸盐缓冲液对细胞表面进行冲洗；最后加入pH7. 4 7. 6DMEM溶液，送入33°C 35°C恒温室进行培养；4)将病毒培养144 168小时，当细胞病变达到“++++”后开始收获病毒；收获的病毒液按I : 4000加入β丙内酯，灭活72小时后进行浓缩纯化；5)纯化后的病毒液加入病毒保护剂除菌，检定合格后即为疫苗原液，再经分装，各项检验合格后制成疫苗。本发明所述的制备方法获得的疫苗主要质量指标为病毒滴度≥7. OlgCCID50/HiL ;疫苗免疫剂量0. 5mL/剂/人；抗生素残留量≤50ng/剂；牛血清残留量≤50ng/剂；热原≤20EU/剂；疫苗pH 7. 4-7. 8 ;热稳定性符合2010年药典第三部标准，合格；疫苗效力15 μ g/剂免疫动物对新布尼亚病毒感染≥ 90%保护作用；无菌检查符合2010年药典第三部标准；支原体检查符合2010年药典第三部标准；异常毒性试验符合2010年药典第三部标准疫苗。其它各项指标符合2000版《中国药典》标准。
4.
图I为人二倍体细胞MRC-5制备新布尼亚病毒灭活疫苗方法。
5.
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。本实施例仅仅用于对本发明的说明，不构成对本发明的限制。实施例I :细胞复苏和传代培养人二倍体细胞MRC-5购自美国科尼尔公司，冷冻细胞37°C解冻，加入37°C预热的MEM培养基(Invitrogen)。1000RPM离心10分钟，收集细胞，新用ImL完全培养基(MEM培养基加上10%胎牛血清、O. 3%水解乳蛋白、1% NaHC03、2mM谷氨酰胺溶液)悬浮，进行细胞计数，按I. 5 X IOVmL细胞接种到每个含IOmL完全培养基的25cm2细胞培养瓶。置于37°C，5% CO2相对湿度90%细胞培养箱培养。当细胞形成完全单层时，倒掉培养基，加入O. 25%胰蛋白酶(Invitrogen) (PH7. 6-7. 8)，消化到细胞单层表面出现针孔样时加入IOmL MEM培养基吹打到形成单细胞悬液，1000RPM离心10分钟，收集细胞，ImL完全培养基悬浮，进行细胞计数，每个含IOmL完全培养基的25cm2细胞培养瓶接种I. 5 X 106/mL细胞，标明时间和世代，置于37°C，5% CO2相对湿度90%细胞培养箱培养。实施例2 :转瓶扩增培养人二倍体细胞MRC-5采用3L、10L或15L转瓶培养人二倍体细胞。分别接种I. 5X 105/mL细胞400ml、1000mlU500ml到装有完全培养基的3L、IOL或15L细胞转瓶中，置于37°C细胞培养箱培养。经历5 6天，细胞形成完全单层时，常规消化制备单细胞悬液，按I : 2或I : 4进行细胞传代，37°C培养。实施例3 :二倍体细胞适应新布尼亚病毒株的建立7株新布尼亚病毒株分别分尚自江苏和安徽疫区，6株直接分尚于病人血清，I株来源于可疑病犬。分离时所有细胞为VERO细胞(表I)。表I :7株新布尼亚病毒株的分离时间与来源
权利要求
1.一种新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法，其包括如下步骤 I)采用转瓶培养人二倍体MRC-5细胞为产毒细胞；2)以保藏号为CCTCC V201211的新布尼亚病毒JS-2007-001作为毒种进行接种；3)接种、培养，收集病毒滤液；4)将病毒滤液进行灭活、除菌、浓缩和纯化；以及5)加入保护液，并检定合格后制备成品疫苗。
2.如权利要求I所述的制备方法，其中所述的人二倍体MRC-5产毒细胞为经二倍体细胞MRC-5传代适应的毒种，该毒种滴度按CCID5tl法不低于7. 01gCCID5(l/mL。
3.如权利要求I所述的制备方法，其中所述的培养步骤具体为 1)制备人二倍体细胞培养液，所述人二倍体细胞培养液为含10%新生牛血清、0.3%水解乳蛋白、I % NaHCO3>2mM谷氨酰胺的MEM培养基； . 2)采用3L、IOL或15L转瓶培养人二倍体细胞，其按I: 2或I : 4进行细胞传代，37°C培养，待细胞成片后接种二倍体细胞毒种； . 3)接种病毒，包括倒去培养液，加入浓度为100 1000CCID5(l/mL病毒，其MOI为.0.001 0. 0001 ;将接种病毒后的细胞置于33°C 35°C下12小时，使病毒与细胞充分接触吸附；然后倒去病毒液，用0.01磷酸盐缓冲液对细胞表面进行冲洗；最后加入含0. 1%人白蛋白pH7. 4 7. 6DMEM溶液，送入33°C 35 °C恒温室进行培养； . 4)将病毒培养144 168小时，当细胞病变达到“++++”后开始收获病毒；收获的病毒液按I : 4000加入P丙内酯，灭活72小时后进行浓缩纯化； .5)纯化后的病毒液加入病毒保护剂后除菌，检定合格后即为单价病毒液，再经分装，各项检验合格后制成疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种使用转瓶培养人二倍体细胞MRC-5细胞和新布尼亚病毒(JS-2007-001)毒种来制备新布尼亚病毒(SFTS bunyavirus)纯化灭活疫苗的方法。本发明采用新布尼亚病毒(JS-2007-001)毒种，用转瓶培养人二倍体MRC-5细胞为产毒细胞，经过细胞扩增、病毒种子驯化、接种、培养、收集病毒滤液，再经过除菌、浓缩以及加入保护液制备成品疫苗。
文档编号A61K39/12GK102805863SQ20121012148
公开日2012年12月5日 申请日期2012年4月24日 优先权日2012年4月24日
发明者万里明, 刘培生, 刘孝民, 罗兰 申请人:万里明