专利名称：细菌素和新的细菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过使用新的产细菌素产乳酸细菌和/或由这些菌种产生的新细菌素控制动物、特别是家禽中的疾病。本发明还涉及新细菌素，所述新细菌素的氨基酸序列，以及产生所述新细菌素的产乳酸细菌菌株。进一步地，本发明涉及含有所述新细菌素和/或产生它们的产乳酸细菌的菌株的治疗组合物，以及所述治疗组合物的用途。
背景技术：
食用未正确处理的家禽产品已经导致人的肠疾病。早已认识到沙门氏菌(Salmonella spp.)是这类疾病的致病菌,近来认识到弯曲杆菌(Campylobacter spp.),特别是空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)也被牵连其中。这两种微生物可以定植于家禽的胃肠道中，而对这些鸟类没有任何有害效果，虽然一些已被定植的鸟类可以被检测到，但无症状的带菌者可以在生产和处理过程中自由传播这些微生物，导致进一步感染活的鸟类和尸体。家禽在食物供应中作为沙门氏菌和弯曲杆菌的原始贮主(Jones等，JournalofFood卩1*(^6(^丨011(食品保护杂志)，第54卷，吣.7，502-507，1991年7月)。在养成生产期间预防在活家禽中的定植可以消除家禽污染的问题。许多因素促成细菌在动物消化道内的定植和继续存在。这些因素已被Savage (Progress in Food and Nutrition Science (食品和营养科学进展)，第 7 卷，65-74,1983)详尽地评述。在这些因素中所包括的是(I)胃酸度(Gilliland，JournalofFood Production(食品生产杂志)，第 42 卷，164-167,1979) ； (2)胆汁盐(Sharpe 和Mattick, Milchwissenschaft, 第 12 卷，348-349,1967 ；Floch 等，American Journalof Clinical Nutrition (美国临床营养学杂志)，第 25 卷，1418-1426，1972 ;Lewis 和Gorbach, Archives of Internal Medicine (内科学档案)，第 130 卷，545-549,1972 ；Gilliland 和 Speck, Journal of Food Protection (食品保护杂志)，第 40 卷，820-823,1977) ;Hugdahl 等,Infection and Immunity (感染和免疫)，第 56 卷，1560-1566,1988)；(3)螺动；(4)消化酶(Marmur, Journal ofMolecular Biology (分子生物学杂志)，第 3 卷，208-218,1961) ； (5)免疫反应；和(6)本源微生物(indigenous microorganism)以及它们产生的抗菌化合物。前四种因素取决于宿主的表现型，可能不是实际上可控的变量。胃肠(GD道的免疫反应不易调节。涉及本源微生物及其代谢物的因素取决于GI道的正常菌群。控制弯曲杆菌和/或沙门氏菌的定植的一种可能的方法是通过使用竞争性排斥(CE) ο Nurmi 和 Rantala (Nature (自然)，第 241 卷，210-211,1973)证明通过将来自健康家禽肠内物质的细菌管饲给微生物群落还没有建成的年幼的雏鸡(chick)抵抗沙门氏菌定植，有效控制沙门氏菌的感染。给雏鸡施用不确定的CE制备物加速新孵出鸟类的消化道菌群的成熟，并提供由成年雌禽向其后代传送微生物群落的自然过程的替代者。实验室和现场实验的结果提供通过给雏鸡施用正常微生物群落控制弯曲杆菌的优点的证据；降低的鸟群受弯曲杆菌感染的频率(Mulder和Bolder, IN !Colonization Control ofhuman bacterial enteropathogens in poultry(家禽中人细菌性肠道病原体的定植控制);L. C. Blankenship (编)，Academic Press,加利福尼亚圣地亚哥，359-363,1991)以及降低的被定植的鸟类的粪便中空肠弯曲杆菌(C. jejuni)水平已有报道(Stern, PoultryScience (家禽科学)，第 73 卷，402-407，1994)。Schoeni 和 Wong (AppI. Environ. Microbiol.，第 60 卷，1191-1197,1994)报道了通过应用碳水化合物添加剂和三种已被鉴定的拮抗剂(差异朽1檬酸杆菌(Citrobacterdiversus) 22,克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae) 23 和大肠杆菌(Escherichiacoli) 25)显著减少了肉仔鸡(broiler)中空肠弯曲杆菌的定植。也有在用嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)和幾链球菌(Streptococcus faecium)的家禽分离培养物治疗以后，感染肉仔鸡的肠内样品中空肠弯曲杆菌显著减少的证据(Morishita等，AvianDiseases (禽类疾病)，第 41 卷，850-855，1997)。 Snoeyenbos等(美国专利No. 4, 335, 107,1982年6月)通过冻干粪便并厌氧培养这种制备物开发了预防沙门氏菌定植的竞争性排斥(CE)微生物群落技术。Mikola等(美国专利No. 4，657，762，1987年4月)用肠道粪便和盲肠内容物作为CE微生物群落源用于预防沙门氏菌定植。Stern等(美国专利No. 5，451，400，1995年9月和美国专利6，241，335，2001年4月)公开一种粘膜CE组合物以保护家禽和家畜抵抗沙门氏菌和弯曲杆菌的定植，其中预先洗涤的盲肠的粘蛋白层被刮下，被刮下的刮屑保持在无氧环境中，进行厌氧培养。Nisbet等(美国专利No. 5，478，557，1996年12月)公开了一种确定的益生菌(probiotic)，其可以得自各种家养动物，其是通过连续培养直接来自成年目标动物的粪便，盲肠和/或大肠内容物的分批培养物获得的。微生物产生多种证明有抗细菌性质的化合物。一类这样的化合物，细菌素，由杀菌蛋白组成，其作用机制类似于离子载体抗生素。细菌素通常具有抵抗与其产生者密切相关的菌种的活性。它们在由复杂微生物种群，例如肠道，口腔或其他上皮表面分离出的细菌菌种中的广泛存在表明细菌素可能在细菌生态系统的种群动态方面具有调节作用。细菌素被定义为由细菌产生的具有生物活性蛋白部分和杀菌作用的化合物(Tagg等，Bacteriological Reviews (细菌学评论),第 40 卷,722-256,1976)。其他特性包括(I)窄谱抑制活性，集中于密切相关的菌种；(2)与特定的细胞受体结合；以及(3)质粒携带细菌素产生和宿主细胞细菌素免疫性的遗传决定簇。不完全确定的拮抗性物质被称为“细菌素样物质”。一些有效对抗革兰氏阳性细菌、相反不对抗革兰氏阴性细菌的细菌素，具有较广谱的活性。已有建议术语细菌素，当用于描述由革兰氏阳性细菌产生的抑制剂时，应满足(I)是一种肽和(2)具有杀菌活性的最低标准(Tagg等，同上)。乳酸细菌是最重要的益生菌微生物之一。它们是革兰氏阳性的，不产生孢子的，过氧化氢酶阴性的缺乏细胞色素的生物。它们是厌氧但耐氧的、有复杂营养要求的、耐酸的以及严格可发酵的，并以乳酸作为糖发酵的主要终产物。乳酸产生细菌包括乳酸杆菌(Lactobacillus)菌种，双歧杆菌(Bifidobacterium)菌种，幾肠球菌(Enterococcusfaecalis),屎肠球菌(Enterococcus faecium),乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis),肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides),乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici),嗜酸芽抱乳酸菌(SPorolactobacillus inulinus),嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)等。这些 菌种在其中广泛存在细菌素方面是受到特别关注的,也广泛应用于发酵奶、食品和肉加工工业中。它们在食品的保存和风味特征中的作用已有详尽记载。大部分由这些菌种产生的细菌素仅仅具有抵抗其他乳酸细菌的活性，但有几种显示出对较大种系差异的革兰氏阳性细菌以及，在特定条件下，对革兰氏阴性细菌的抗菌活性。乳酸杆菌已被广泛研究其拮抗剂的产生。其中包括充分定性的细菌素(DeKlerk，1967 ；Upreti和 Hinsdill 1975 ；Barefoot 和 Klaenhammer 1983 ;Joerger 和 Klaenhammer1986);可能的细菌素样物质(Vincent et al. , 1959),和其他与细菌素不必然相关的拮抗剂(Vakil 和 Shahni 1965 ;Hamdan 和 Mikolaj cik 1974 ；Mikolaj cik 和 Hamdan 1975;以及 Shahni 等，1976)。Klaenhammer(1993)将当时所知的乳酸细菌细菌素分为四个主要类别第I类-羊毛硫抗生素(Lantibiotics)，其是< 5kDa的小肽,含有不常见的氨
基酸羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸。它们受到特别关注是因为它们具有相对于其他细菌素而言非常广谱的活性。实例包括Nisin, Nisin Z, carnocin U149, lacticin481,和lactocin5。第II类——小的不含羊毛硫氨酸的肽一类非均质的< IOkDa的小肽。这一类包括具有抵抗李斯特氏菌(Listeria spp.)的活性的肽。第III类-大的热不稳定的> 30kDa的蛋白质。实例是Helveticin。第IV类——含有额外部分例如脂类和碳水化合物的复杂细菌素-蛋白质。本发明提供含有至少一种产乳酸细菌菌株的新菌株和/或由至少一种新菌株产生的新细菌素的新的组合物；使用所述菌株或细菌素的方法，所述新菌株，所述新细菌素的氨基酸序列，以及使用方法，其均与相关技术中的菌株、细菌素和使用方法不同。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供产生新细菌素的乳酸杆菌和肠球菌的新菌株。本发明的另一个目的是提供鉴定特征为NRRL B-30514的新唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株 PVD32。本发明的又一个目的是提供鉴定特征为NRRL B-30510的新嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)LWP320。本发明的又一个目的是提供鉴定特征为NRRL B-30645的新粪肠球菌(Enterococcus faecalis)LWP2I。本发明的又一个目的是提供鉴定特征为NRRL B-30511的新坚韧肠球菌(Enterococcus durans)菌株 LWP26。本发明的又一个目的是提供具有选自由NRRL B-30514和NRRL B-30510组成的组的乳酸杆菌菌株的鉴定特征的分离的乳酸杆菌。本发明的又一个目的是提供具有选自由NRRL B-30645和NRRL B-30511组成的组的乳酸杆菌菌株的鉴定特征的分离的乳酸杆菌。本发明的另一个目的是提供由乳酸杆菌和肠球菌的新菌株产生的新细菌素。
本发明的又一个目的是提供具有如SEQ ID NO I所示氨基酸序列的新细菌素0R7。本发明的又一个目的是提供具有如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的新细菌素LWP320。本发明的又一个目的是提供具有如SEQ ID NO 3所示氨基酸序列的新细菌素LWP21。本发明的又一个目的是提供具有如SEQ ID NO 4所示氨基酸序列的新细菌素LWP26。本发明的另一个目的是提供治疗组合物，包括(a)有效量的至少一种分离的细菌素，以至少降低至少一种目标细菌的定植水平，所述的细菌素具有选自NRRL B-30514、NRRL B-30510.NRRL B_30645、NRRL B-30511、和其混合物组成的组的菌株的鉴定特征的产 乳酸细菌菌株产生；和(b)适当的治疗载体。在本发明的一个实施方案中，所述细菌素具有选自由SEQ ID NO. I、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4或其混合物组成的组的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供用于动物的治疗饲料，包括(a)有效量的至少一种分离的细菌素，以至少降低至少一种目标细菌的定植水平，所述的细菌素具有选自由NRRLB-30514、NRRL B-30510、NRRL B-30511、NRRL B-30645和其混合物组成的组的菌株的鉴定特征的产乳酸细菌菌株产生，(b)治疗载体，和(c)动物饲料。在本发明的一个实施方案中，所述至少一种细菌素具有选自由SEQ ID NO USEQ ID NO 2,SEQ ID NO 3,SEQ ID NO 4和其混合物组成的组的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供用于动物的治疗饲料，包括(a)有效量的细菌素，以至少降低至少一种目标细菌的定植水平，所述细菌素具有选自由NRRL B-30510、NRRLB-30514和其混合物组成的组的乳酸杆菌菌株的鉴定特征的乳酸杆菌菌株产生，(b)治疗载体，和(c)动物饲料。在本发明的一个实施方案中，所述细菌素具有选自由SEQ IDNOI和SEQ ID NO 2组成的组的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供用于动物的治疗组合物，包括(a)有效量的至少一种分离的细菌素，以至少降低至少一种目标细菌的定植水平，所述细菌素具有选自由NRRLB-30511、NRRL B-30645和其混合物组成的组的肠球菌菌株的鉴定特征的肠球菌菌株产生，(b)治疗载体，和(c)动物饲料。本发明的另一个目的是提供至少降低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其是通过给所述动物施用包含至少一种产新细菌素的乳酸杆菌或肠球菌的新菌株，至少一种由乳酸杆菌或肠球菌的新菌株产生的新细菌素，或者所述新菌株和/或新细菌素的组合的治疗组合物。本发明的另一个目的是提供至少减低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其是通过给所述动物施用包含特征为NRRL保藏号B-30514和B-30510的乳酸杆菌；鉴别特征为NRRL B-30511和NRRL B-30645的肠球菌；和其混合物的新菌株的治疗组合物。本发明的又一个目的是提供至少降低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其是通过给所述动物施用包含至少一种鉴别特征为NRRL B-30510, NRRL B-30511,NRRL30514, NRRL B-30645，和其混合物的新菌株；至少一种具有如SEQ ID NO K SEQ IDN02、SEQ ID NO 3,SEQ ID NO 4所示氨基酸序列，和其混合物的细菌素；或新菌株和新细菌素的组合的治疗组合物。本发明的又一个目的是提供至少降低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其是通过给所述动物施用包含具有如SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的新细菌素的治疗组合物。本发明的又一个目的是提供至少降低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其是通过给所述动物施用包含具有如SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的新细菌素的治疗组合物。本发明的又一个目的是提供至少降低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其是通过给所述动物施用包含具有如SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的新细菌素的治疗组合物。 本发明的又一个目的是提供至少降低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其是通过给所述动物施用包含具有如SEQ ID NO :4所示氨基酸序列的新细菌素的治疗组合物。本发明的另一个目的是提供至少降低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其是通过给所述动物施用包括具有鉴别特征为NRRL B-30510或NRRL B-30514的乳酸杆菌细菌新菌株；具有鉴别特征为NRRL B-30511或NRRL B-30645的肠球菌新菌株，和其混合物产生的细菌素的治疗组合物。 本发明的其他目的和优点根据下述说明将变得明显。微牛物的保藏唾液乳酸杆菌，标明为NRRL B-30514(菌株PVD32)，嗜酸乳酸杆菌标明为NRRLB-30510(菌株LWP320);坚韧肠球菌标明为NRRL B-30511 (菌株LWP26)于2001年8月3日保藏，粪肠球菌标明为NRRL B-30645(菌株LWP21)于2003年4月I日保藏。所有上述菌株已按照布达佩斯条约的规定保藏于美国农业部农业研究服务中心专利培养物保藏中心(国家农业应用研究中心(National Center for Agricultural Utilization Research),1815N. University Street, Peoria,Illinois 61604)。
图I是SDS-PAGE后对0R7直接检测的照片。凝胶用空肠弯曲杆菌覆盖以确定哪个条带具有抗菌活性以及具有活性的条带的分子量。第I道——6，500-97，000的MMW分子量标记(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) 97, 000，66，000，43，000，30，000，21，000，14，400 和6，500Da。第2道的条带——纯化的lactocin 0R7，第3道的条带——被空肠弯曲杆菌吸收后的CAP lactocin 0R7，具有抗菌活性，生长抑制的区域(见箭头)，质量为大约6，OOODa，第4道的条带——CAP lactocin 0R7。其他条带没有显示出抗菌活性。图2是SDS-PAGE后对细菌素LWP320和LWP26直接检测的照片。凝胶用空肠弯曲杆菌覆盖以确定哪个条带具有抗菌活性以及具有活性的条带的分子量。第3道——3，000-43，000 的 LMW分子量标记(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) 3, 000，11，400，18，000，21，000和43，OOODa。第I道的条带——细菌素LWP320，第2道的条带——细菌素LWP26，具有抗菌活性，生长抑制的区域，质量分别为大约6，000和大约3，OOODa0其他条带没有显示出抗菌活性。
图3是SDS-PAGE后对肠球菌素LWP21直接检测的照片。凝胶用空肠弯曲杆菌覆盖以确定哪个条带具有抗菌活性以及活性条带的分子量。第4道——1060-43, 000的LMW分子量标记(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) : 1，060，2，500，3，500，14，400，20，000，30，000和43，OOODa。第I道的条带(SP-琼脂糖凝胶后的肠球菌素LWP21)，和第2道的条带(苯基-琼脂糖凝胶CL-4B后的第2峰)具有抗菌活性，生长抑制的区域(见箭头)，质量为大约6，OOODa。第3道的条带(phenyl-Sepharose CL-4B后的峰)，具有大约3，OOODa的质量。其他条带没有显示出抗菌活性。
具体实施例方式肠感染在人中的重要性已经被日益充分地认识到，家禽污染和人感染之间的关系也有详尽记载。通过干预家禽加工厂消除这种健康危险的能力也是众所周知的。在肉仔鸡生产和加工过程中，含有病原体的粪便物转移到肉上，并继续存在于加工食品的厨房中。
竞争性生物的代谢物可能有助于控制病原体例如空肠弯曲杆菌和沙门氏菌。本发明的新拮抗菌种从肉仔鸡的盲肠和嗉囊粘膜表面分离而来。表征的拮抗物的天然组分是低分子量的肽，细菌素，其具有广谱的拮抗活性。本发明提供了新乳酸杆菌和肠球菌菌株，新细菌素，所述细菌素的氨基酸序列，含有所述新细菌素和/或产生它们的菌株的治疗组合物，以及使用所述新治疗组合物的方法。嗜酸乳酸杆菌LWP320分离菌是兼性厌氧菌(微需氧性细菌)，过氧化氢酶阴性的，革兰氏阳性的非运动性的多形态的棒状细菌，其在MRS琼脂上在大约37°C延迟生长。当在MRS琼脂上生长时，该分离菌在大约24小时的微需氧培育后产生直径为大约0. 5mm至大约0.8mm的发白色的、半透明的菌落。在MRS肉汤中，菌株LWP320只在培养管底部生长。唾液乳酸杆菌PVD32菌株是兼性厌氧菌(微需氧性细菌)，革兰氏阳性的，过氧化氢酶阴性的，非运动性的，多形态的棒状杆菌。菌落在大约37°C微需氧培育大约18-24小时后产生直径为大约Imm至大约3mm的圆形至规则形状的、光滑的、凸面的具有清晰边缘的菌落。该菌株产生乳酸和H2O2。粪肠球菌LWP21菌种是兼性厌氧菌(微需氧性细菌)，革兰氏阳性球菌，过氧化氢酶阴性。在MRS琼脂上在37°C生长延迟。当在MRS琼脂上培养时、该菌株在大约37°C在大约24小时的微需氧培育后产生直径为大约0. 2mm的发白色的，半透明的菌落。在大约37°C在大约48小时的微需氧培育后，菌落的直径为大约1_至大约I. 2_。该菌株在MRS肉汤中仅生长在培养管底部大约2/3体积中。坚韧肠球菌LWP26菌种是兼性厌氧菌(微需氧性细菌)，革兰氏阳性球菌，过氧化氢酶阴性的，在大约37°C在MRS琼脂上延迟生长。当在MRS琼脂上生长时，该菌株产生发白色的、半透明的菌落，并在大约37°C微需氧培育大约24小时后变透明。在大约37°C微需氧培育大约48小时后,菌落大小平均为大约0. 8mm至大约I. Omm0在MRS肉汤中，该菌株生长在管中的全部体积。对分离的乳酸杆菌和肠球菌菌种产生细菌素活性的筛选通过在营养琼脂上用感兴趣的不同目标细菌接种的培养物进行。其他检测菌株在有氧条件下在大约37°C培养大约14-24小时。小肠结肠炎耶氏菌(Yersinia enterocolitica)和假结核耶氏菌(Y. pseudotuberculosis)在大约28°C在有氧条件下培养大约14-24小时。抵抗空肠弯曲杆菌的活性的检测在用空肠弯曲杆菌接种的含有大约5%裂解血液的弯曲杆菌琼脂上进行。血的使用是本领域普通技术人员熟知的，包括例如羊，马等。抵抗空肠弯曲杆菌的活性的检测在大约5% O2，大约10% CO2，和大约85% N2的微量需氧条件下在大约42°C进行大约24-48小时。将大约O. 2ml生理盐水中悬浮的拮抗细菌平板接种于乳酸杆菌琼脂上，培育大约24小时。大约O. 5cm3的琼脂块被切下并转移到添加有裂解血、大约10mg/ml利福平、大约2. 4U/ml多粘菌素，并接种了大约IO7个空肠弯曲杆菌细胞的布鲁氏菌或弯曲杆菌琼脂上。平板在微量需氧条件下在大约42°C培育大约24-48小时。活性通过测量生长抑制的区域来评价。发现有拮抗性的乳酸杆菌分离菌被评价其细菌素的产生。粗制的抗菌制备物(CAP)通过仅对在需氧条件下在大约37°C在饥饿培养基(starvation medium)上生长大约 18小时的拮抗菌株的培养物进行硫酸铵沉淀来制备，所述的饥饿培养基为
K2HPO46.0 g
KH2PO40.2 g
(NH4) 2SO40.2 g
MgSO40.1 g
葡萄糖9.0 g
组氨酸0.08 g
精氨酸0.02 g加蒸馏水至1000ml，pH值为大约7. 2。然后将培养物流体以大约12，OOOXg离心大约10分钟。得到的上清然后加入INNaOH调整pH值至大约6. 2并加入大约130U/ml过氧化氢酶以除去有机酸和过氧化氢，和抑制因子。通过组合进行硫酸铵沉淀、脱盐色谱和凝胶过滤从上清中分离拮抗肽，得到粗制的抗菌制备物(CAP) ο CAP样品通过O. 22 μ过滤器(MiIlipore, Bedford, MA, USA)过滤。发现有拮抗性的肠球菌分离菌被评价其细菌素的产生。粗制的抗菌制备物(CAP)通过仅对在有氧条件下在大约37°C在MRS肉汤中生长大约18小时的拮抗菌株培养物进行硫酸铵沉淀来制备，所述的MRS肉汤为MRS 肉汤 15. Og乳糖0.05g加蒸馏水至大约1000ml，pH 1.2。然后将培养物流体以大约12，OOOXg离心大约10分钟。得到的上清然后加入INNaOH调整pH值至大约6. 2并加入大约130U/ml过氧化氢酶以除去有机酸和过氧化氢，和抑制因子。通过组合进行硫酸铵沉淀、脱盐色谱和凝胶过滤从上清中分离拮抗肽，得到粗制的抗菌制备物(CAP) ο CAP样品通过0.22 μ过滤器(Mi I lipore, Bedford, MA, USA)过滤。所有上述肽的分子量通过SDS-PAGE电泳确定。所述肽的pi通过等电聚焦确定。氨基酸序列通过Edman降解法使用，例如，491cLC自动测序仪(Applied Biosystems, Inc.)确定。为本发明的目的，术语“肽”指至少两个或更多个氨基酸或氨基酸类似物的化合物。氨基酸或氨基酸类似物可以通过肽键相连。在另一个实施方案中，氨基酸可以通过其他键，例如酯，醚等相连。肽可以是任何结构构型，包括线性，分支，或环状构型。本文所用的术语“氨基酸”指天然或合成的氨基酸，包括D或L光学异构体，和氨基酸类似物。本发明的肽衍生物和类似物包括但不限于那些包含作为一级氨基酸序列的包括其序列中的残基被功能等同的氨基酸残基替换从而导致保守性氨基酸替换的改变的序列的肽的全部或部分氨基酸序列。例如，序列中的一个或多个氨基酸残基可以被另一个具有类似极性的，作为功能等同物的氨基酸替换，导致沉默的改变。序列中氨基酸的替换可以选自该氨基酸所属类别的其他成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸。含有芳香环结构的氨基酸是苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天门冬酰胺，和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸，和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。这种改变不会显著影响聚丙酰胺凝胶电泳确定的分子量或等电点。非保守性氨基酸替换也可以被引入以替换氨基酸，使之具有特别偏好的性质。例如，Cys可以 被引入到可能的位置以与另一个Cys形成二硫桥。Pro可以因其特别的平面结构而被引入。本发明的肽可以被化学合成。合成肽可以用熟知的固相液相技术，或肽浓缩(peptide condensation)技术,或其组合制备,可以包括天然的和/或合成的氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是标准的Boc (Na-氨基保护的Na-t- 丁基氧羰基)氨基酸树脂，进行Merrifield的原始固相程序的标准进行去保护、中和、稱联和洗漆步骤(J. Am. Chem. Soc,第85卷，2149-2154，1963)，或碱敏感的Na-氨基保护的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸(Carpino和Han, J. Org. Chem.，第37卷，3403-3409，1972)。此外，本发明的方法可以使用本领域技术人员熟知的其他Na-保护的基团。固相肽合成可以用本领域的普通技术(参见例如 Stewart 和 Young, Solid Phase Synthesis (固相合成),第二版,Pierce ChemicalCo. , Rockford, 111.，1984 ;Fields和 Noble, Int. J. Pept. Protein Res.,第 35 卷,161-214,1990)，或用自动合成仪实现。根据本发明，所述肽和/或所述新细菌菌株可以置于治疗可接受的载体内局部、肠胃外、经粘膜，例如口服，经鼻，或经直肠，或经皮肤给药。本发明的肽如果需要的话可以进行修饰以增加所述肽穿过细胞膜的能力，例如通过增加所述肽的疏水性，使所述肽与载体(例如特异性受体的配体)相接合等。本发明还提供将靶分子与本发明的肽相接合。为本发明目的的靶分子指当体内给药时，定位于所希望的一个或多个区域的分子。在本发明的各种实施方案中，靶分子可以是肽或蛋白质、抗体、凝集素、碳水化合物或类固醇。靶分子可以是在靶细胞上的受体的肽配体或抗体，如单克隆抗体。为了便于交联，抗体可以减少到两个重链和轻链的异质二聚体，或者F(ab’)2片段可以被还原，并通过还原的巯基与所述肽交联。本发明的另一个方面是提供治疗组合物。所述治疗组合物可以用于口服、经鼻、肺部给药、注射等。所述治疗组合物包含有效量的本发明的至少一种细菌素和它们的衍生物和/或至少一种新菌株以至少降低至少一种目标细菌定植的水平，还包括可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。稀释剂可以包括缓冲液，如，举例而言，Tris-HCl，醋酸盐，磷酸盐；添加剂可以包括去垢剂和增溶试剂，如，举例而言，Tween 80，聚山梨醇酯80等；抗氧化剂包括，如，举例而言，抗坏血酸，焦亚硫酸钠等；防腐剂可以包括，例如，Thimersol,苯甲醇等；以及膨胀物质如乳糖,甘露醇等。本发明的治疗组合物可以被合并入聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，聚乳酸，聚乙醇酸等的微粒制备物中，或被合并入脂质体中。脂质体的包封包括各种聚合物的包封。各种不同的聚合物载体都可用于贮含和/或递送上面所讨论的一种或更多种治疗试剂，包括例如生物可降解的和不能生物降解的组合物。生物可降解组合物的代表性实例包括白蛋白，胶原，明胶，透明质酸，淀粉，纤维素(甲基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素，醋酸纤维素苯二甲酸酯，醋酸纤维素琥珀酸酯，羟丙基甲基纤维素苯二甲酸酯)，酪蛋白，右旋糖苷，多糖，纤维蛋白原，聚(D，L丙交酯)，聚(D，L-丙交酯共乙交酯)，聚(乙交酯)，聚(羟基丁酸酯)，聚(烷基碳酸酯)和聚(原酸酯)，聚酯，聚(羟基戊酸)，聚二噁烷酮，聚(对苯二甲酸乙二酯)，聚(苹果酸)，聚(丙醇二酸)，聚酐，聚磷腈，聚(氨基酸)和它们的共聚物(通常参见，Ilium, L. , Davids, S. S.(编)"Polymers in Controlled DrugDelivery (受控药物释放中的聚合物)"Wright, Bristol, 1987 ；Arshady, J. ControlledRelease 17 1-22,1991 ；Pitt, Int.J. Phar. 59 173-196,1990 ；Holland 等，J.ControlledRelease 4:155-0180,1986)。不能降解的代表性实例包括聚(乙烯-醋酸乙烯酯)(“EVA”)共聚物，硅橡胶，丙烯酸聚合物(聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚甲基丙烯酸甲酯，聚氰基丙烯酸烷基酯)，聚乙烯，聚丙烯，聚酰胺(尼龙6，6)，聚氨酯，聚(酯型聚氨酯)，聚(醚型聚氨酯)，聚(酯-脲)，聚醚(聚(环氧乙烯)，聚(环氧丙烷)，Pluixmics和聚(四亚甲基二醇)，硅橡胶和乙烯基聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，聚(乙烯醇)，聚(醋酸乙烯苯二甲酸酯)。聚合物也可以被开发出来的，或者是阴离子的(例如藻酸盐，卡拉胶，羧甲基纤维素和聚丙烯酸)，或者是阳离子的(例如壳聚糖，聚L赖氨酸，聚氮丙啶，和聚烯丙胺)(通常参见Dunn等，J.Applied Polymer Sci. 50 :353-365,1993；Cascone 等，J.Materials Sci. !Materialsin Medicine (药物中的材料)5 :770-774,1994 ;Shiraishi 等，Biol. Pharm. Bull. 16 (11)1164-1168，1993 ；Thacharodi 和 Rao, Int ' 1J. Pharm. 120 :115-118,1995 ；Miyazaki 等，Int' 1J.Pharm. 118 :257-263,1995)。聚合物载体可以制成各种形式的，具有希望的释放特性和/或具有特定的所希望的性质。例如，聚合物载体可以被制成当暴露于特定的触发事件(如PH)时释放治疗试剂(参见例如 Heller 等，"Chemically Self-Regulated Drug Delivery Systems,(以化学的方式自调整的药物递送系统)"，自iPolymers in Medicine III (药物中的聚合物III)，Elsevier Science Publishers B. V.，阿姆斯特丹，1988, pp. 175-188 ;Kang 等，J. AppliedPolymer Sci.48 :343-354,1993 ;Dong等，J.Controlled Release 19 :171-178,1992；Dong和 Hoffman, J. Controlled Release 15 141-152,1991 ；Kim 等，J.Controlled Release28 :143-152,1994 ；Cornejo-Bravo 等，J. Controlled Release 33 :223-229,1995 ；ffu 和Lee, Pharm. Res. 10(10) : 1544-1547，1993 ；Serres 等，Pharm. Res. 13(2) : 196-201，1996 ；Peppas, " Fundamentals of pH-and Temperature-Sensitive Delivery Systems, (pH及温度敏感递送系统基础)"，自Gurny等(编)，Pulsatile Drug Delivery (脉动的药物递送)，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH,斯图加特，1993, pp. 41-55 ；Doelker, " Cellulose Derivatives,(纤维素衍生物)"1993,自 Peppas 和 Langer (编),Biopolymers I (生物聚合物I), Springer-Verlag, Berlin)。pH敏感的聚合物的代表性实例包括聚丙烯酸及其衍生物(包括例如均聚物如聚氨基羧酸；聚丙烯酸；聚甲基丙烯酸，这些均聚物的共聚物，以及聚丙烯酸和如上所讨论的丙烯单体的共聚物。其他PH敏感的聚合物包括多糖如醋酸纤维素苯二甲酸酯；羟丙基甲基纤维素苯二甲酸酯；醋酸羟丙基甲基纤维素琥拍酸酯；trimellilate醋酸纤维素偏苯三酸酯(trimellilate);和壳聚糖。其他pH敏感的聚合物还包括任何PH敏感的聚合物和水溶性聚合物的混合物。 同样地，聚合物载体可以被制成是温度敏感的(参见例如，Chen等，"NovelHydrogels of a Temperature-Sensitive Pluronic Grafted to a Bioadh esivePolyacrylic Acid Backbone for Vaginal Drug Delivery,(用于阴道药物递送的接枝到生物粘附聚丙烯酸骨架的温度敏感型Pluronic的新型凝胶)"，自Proceed. Intern.Symp. Control. ReI. Bioact. Mater. 22 167-168, Controlled Release Society, Inc.,1995 ；Okano, " Molecular Design of Stimuli-Responsive Hydrogels for TemporalControlled Drug Delivery，(用于时序受控药物递送的剌激响应型水凝胶的分子设计)"自 Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22 :111-112, Controlled ReleaseSociety, Inc.，1995 ; Johnston 等，Pharm. Res. 9 (3) :425_433，1992 ;Tung，Int ' 1J.Pharm. 107 :85-90,1994 ；Harsh 和 Gehrke，J.Controlled Release 17 :175-186，1991 ；Bae 等，Pharm. Res. 8 (4) :531-537,1991 ；Dinarvand 和 D ' Emanuele, J. ControlledRelease36 :221-227,1995 ；Yu 和 Grainger， " Novel Thermo-sensitive AmphiphilicGels Poly N-isopropyIaeryIamide-co-sodium acrylate-co-n-N-alkylacrylamideNetwork Synthesis and Physicochemical Characterization，(新型热敏感型两亲凝胶聚N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯酸钠-共-n-N-烷基丙烯酰胺网络合成和物化特性)"，俄勒R科学与技术研究生院化学和生物科学系，Beaverton，俄勒R州，pp. 820-821 ；Zhou和 Smid，" Physical Hydrogels of Associative Star Polymers，(缔合的星型聚合物的物理水凝胶)"，纽约州立大学环境科学和林学院化学系聚合物研究所，Syracuse,纽约州，pp. 822-823 ;Hoffman 等，"Characterizing Pore Sizes and Water' Structure' inStimuli-Responsive Hydrogels,(剌激响应型水凝胶中的孔径和水‘结构’特征)"，华盛顿大学生物工程中心，P. 828 ;Yu 和 Grainger，" Thermo-sensitive Swelling Behaviorin Crosslinked N-isopropylacrylamide Networks Cationic, Anionic and AmpholyticHydrogels,(交联的N-异丙基丙烯酰胺网络中的热敏感型溶胀性能)"，俄勒R科学与技术研究生院化学和生物科学系，Beaverton，俄勒R州，pp. 829-830 ;Kim等，Pharm.Res. 9 (3) :283-290,1992 ；Bae 等，Pharm. Res. 8 (5) :624-628,1991 ；Kono 等，J. ControlledRelease 30 :69-75,1994 ；Yoshida 等，J.Controlled Release 32 :97-102,1994 ；Okano等，J. Controlled Release 36 :125-133,1995 ；Chun 和 Kim，J. Controlled Release 38 39-47，1996 ;D' Emanuele 和 Dinarvand, Int' 1J. Pharm. 118 :237-242,1995 ；Katono 等，J.Controlled Releasel6 :215-228,1991 ;Hoffman，" Thermally Reversible HydrogelsContaining Biologically Active Species，(包含生物活性物质的热可逆型水凝胶)"，自 Migliaresi 等(编)，Polymers in Medicine III (药物中的聚合物 III)，ElsevierScience Publishers Β· V.，阿姆斯特丹，1988，pp. 161-167 ;Hoffman，" Applications ofThermally-Reversible Polymers and Hydrogels in Therapeutics and Diagnostics，(热可逆型聚合物和凝胶在治疗学和诊断学中的应用)"，自第三届药物递送系统中的新进展国际研讨会，盐湖城，犹他州，1987年2月24-27日，pp. 297-305 ;Gutowska等，J.Controlled Release 22 :95-104,1992 ；Palasis和 Gehrke,J. Controlled Release 18 1-12，1992 ； Paavo I a 等，Pharm. Res. 12 (12) 1997-2002，1995)。热胶凝聚合物的代表性实例，以及它们的凝胶温度(LCST(°C ))包括均聚物如聚(N-甲基-N-n-丙基丙烯酰胺)，19.8 ;聚(N_n_丙基丙烯酰胺)，21. 5 ;聚(N-甲基-N-异丙基丙烯酰胺)，22. 3 ’聚(N-n-丙基甲基丙烯酰胺)，28. O ’聚(N-异丙基丙烯酰胺)，30. 9 ;聚(N，η-二乙基丙烯酰胺)，32. O ;聚(N-异丙基甲基丙烯酰胺)，44. O ;聚(N-环丙基丙烯酰胺)，45. 5 ;聚(N-乙基甲基丙烯酰胺)，50. O ;聚(N-甲基-N-乙基丙烯酰胺)，56. O ;聚(N-环丙基甲基丙烯酰胺)，59. O ;聚(N-乙基丙烯酰胺)，72. O。而且，热胶凝聚合物可以通过制备上述两个或多个单体之间的共聚物，或者将这种均聚物与其他水溶性聚合物如丙烯醒基单体(aeryImonomer)(例如丙烯酸及其衍生物如甲基丙烯酸,丙烯酸酯及其衍生物如甲基丙烯酸丁酯，丙烯酰胺，和N-n- 丁基丙烯酰胺)组合来制造。热胶凝聚合物的其他代 表性实例包括纤维素醚衍生物如羟丙基纤维素，41°C ;甲基纤维素，55°C ;羟丙基甲基纤维素，66°C ;和乙基羟乙基纤维素，和 Pluronics 如 F-127，10_15°C ;L_122，19°C ;L_92，26°C ；L-81,20°C ;和 L-61，24°C。利用和本发明的聚合物载体可以制成多种不同的形式，包括例如棒状设计(rod-shaped device)、丸、厚片(slab)或胶囊(参见例如，Goodell et al.，Am. J. Hosp.Pharm. 43 :1454-1461,1986 ;Langer 等， "Controlled release of macromoleculesfrom polymers (大分子从聚合物的受控释放)"，自 Biomedical Polymers, PolymericMaterials and Pharmaceuticals for Biomedical Use (生物医学,用于生物医学应用的聚合物材料和药物)，Goldberg, E. P.，Nakagim, Α·(编)Academic Press, pp. 113-137,1980 ；Rhine 等，J. Pharm. Sci. 69 :265-270,1980 ；Brown 等，J. Pharm. Sci. 72 :1181-1185,1983 ；以及 Bawa 等，J. Controlled Release I :259-267,1985)。治疗试剂可以通过封闭在聚合物基质中与聚合物共价连接被连接，或者可以封装在微胶囊中。在本发明的特定优选的实施方案中，治疗组合物以非胶囊的制剂如微球(尺寸范围在纳米到微米)、糊剂、各种尺寸的丝状剂(thread)、薄膜剂和喷雾剂被提供。本发明的另一个方面是提供治疗组合物和动物饲料。本发明的治疗组合物可以用上述的聚合物载体包封，然后通过任何已知的将其应用于饲料中的方法添加到饲料中，例如通过机械搅拌，喷洒等。所述治疗组合物包括，例如，能有效地至少降低至少一种目标细菌在动物中定植的水平的量的至少一种细菌素和/或拮抗细菌，例如大约O. 5g每种的lactocin和/或肠球菌素/lOOOg，大约I. 25g聚合物载体例如聚乙烯吡咯烷酮/IOOOgdP大约8. 6%稀释剂例如水/lOOOg，与可消化的任何颗粒组分，例如磨碎的玉米谷物；谷物例如燕麦，小麦，荞麦；磨碎的果实例如梨等混合。然后将所述治疗组合物以有效地至少降低至少一种目标细菌的定植水平的量加入任何类型的动物饲料中，例如细菌素对饲料的比为大约I : 10至大约I : 100。为本发明的目的，动物饲料的实例包括青饲料，青贮饲料，干燥的青饲料，根，块茎，肉质果，谷类，种子，啤酒糟，果渣，啤酒酵母，蒸馏残渣，面粉加工副产品，糖、淀粉或油生产的副产品，和各种食品废弃物。该产品可以添加到饲养牛、家禽、兔、猪、或羊等的动物饲料中。它可以与用于这些家畜的其他饲料添加剂混合使用。
下述实施例仅仅是为了进一步举例说明本发明，并非要限制由权利要求确定的本发明的范围。实施例I产生细菌素的两种新拮抗菌株，唾液乳酸杆菌，标明为NRRL B_30514(菌株PVD32)和嗜酸乳酸杆菌，标明为NRRL B-30510 (菌株LWP320)从肉仔鸡的盲肠和嗉囊中分离出来。所述盲肠和嗉囊预先排空并用大约IOOml无菌的O. 85% w/v盐水溶液(生理盐水)洗涤两次。盲肠和嗉囊物悬浮于PH为大约7. O的无菌盐水溶液中。将大约O. Iml的10倍稀释的悬液直接平板接种于选择性MRS琼脂上。平板在大约37°C厌氧培育大约16-18小时。从每个样品选择至少10个乳酸杆菌特异的菌落。乳酸杆菌用APO 50CHL微检测系统(bioMerieux,法国)进行鉴别。菌株唾液乳酸杆菌PVD32和嗜酸乳酸杆菌LWP320在大约37°C在MRS琼脂上培养大约24小时。这两个菌株是兼性厌氧菌，革兰氏阳性的非运动性的棒状细菌，能够在大 约30°C，37°C，和42°C生长。菌株PVD32在MRS琼脂上生长，在大约37°C微需氧培育大约18-24小时后，产生直径为大约1-3_的圆形至规则形状的、光滑的、凸面的具有清晰边缘的菌落。菌株LWP320在MRS琼脂上生长，在37°C微需氧培育大约24小时后，产生直径大约为O. 5到O. 8mm的发白的,半透明的菌落。粪肠球菌LWP21和坚韧肠球菌LWP26在大约37°C在MRS琼脂上生长大约24小时。它们是革兰氏阳性的兼性厌氧菌，非运动性的球菌，能在大约30°C，37°C，和42°C生长。菌株LWP21在MRS琼脂上生长，产生发白色的半透明菌落，微需氧培育大约24小时后变得透明。在大约37°C微需氧培育大约48小时后，菌落直径为大约O. 8至大约I. 0mm。使用API 50CHL悬浮介质，在API 50CHL和EN-C0CXUS图表种类中的结果如下述表I所示。下述表2显示的结果表明菌株PVD32是唾液乳酸杆菌，菌株LWP320是嗜酸乳酸杆菌，菌株LWP21是粪肠球菌，菌株LWP26是坚韧肠球菌。评价拮抗分离物的拮抗活性的目标细菌包括从俄罗斯的肉仔鸡中分离的空肠弯曲杆菌的菌株L4和BI,空肠弯曲杆菌ATCC 11168,肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的几个种，绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株ATCC 9027,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytongenes),用作检测培养物以评价分离菌的拮抗活性。空肠弯曲杆菌在大约37°C在大约5% O2，大约10%CO2，和大约85% N2的微需氧条件下，在添加有大约0. 02%亚硫酸氢钠，大约0. 05%硫酸亚铁，和大约5%部分裂解羊血的布鲁氏菌琼脂或弯曲杆菌琼脂上生长大约18-24小时。其他菌株小肠结肠炎耶氏菌(Y. enterocolitica)和假结核耶氏菌(Y. pseudotuberculosis)在营养琼脂上在大约37°C或大约28°C在有氧条件下培养大约18-24小时。分离菌对弯曲杆菌的拮抗活性被评价。大约0. 2ml生理盐水悬液被平板接种于MRS琼脂上，在大约37°C培育大约24小时。大约0. 5cm3的琼脂块被切割下来并转移到添加有大约5% -10%部分裂解羊血，大约10mg/ml利福平，和大约2. 5u/ml多粘菌素，接种量为每个平板大约IO7个空肠弯曲杆菌细胞的布鲁氏菌琼脂或弯曲杆菌琼脂上。平板在大约42°C在如上所述的微量需氧条件下培育大约24小时。拮抗活性通过测量空肠弯曲杆菌抑制区域的直径大小得以评价。对空肠弯曲杆菌的拮抗活性用11，790种分离菌进行评价，其中279种分离菌显示出对空肠弯曲杆菌的拮抗作用。
表I. API50CHL和EN-C0CCUS检测的鉴定结果
检测(得分)Γ 1
PVD32API 50CHL(99.9%)唾液乳酸杆菌
LWP320API 50CHL(96.6%)嗜酸乳酸杆菌
LWP21EN-COCCUS-检测(96% )粪肠球菌
LWP26EN-COCCUS-检测(98% )坚韧肠球菌表2a.乳酸杆菌菌种的特征(API 50CHL的结果)
分离菌及其性质碳水化合物PVD32LWP320
O-对照
赤藓糖醇(Erythriol)
D-阿拉伯糖 L-阿拉伯糖
Tl
D-木糖 L-木糖
福寿糖醇β-甲基-木糖苷
半乳糖++
D-葡萄糖~
D-果糖~
D-甘露糖~
权利要求
1.一种细菌素，所述细菌素的氨基酸序列是SEQ ID NO 2。
2.—种细菌素，所述细菌素的氨基酸序列是SEQ ID NO 3。
3.—种细菌素，所述细菌素的氨基酸序列是SEQ ID NO 4。
4.一种治疗组合物,包括 (a)有效量的至少一种分离的细菌素，以至少降低至少一种目标细菌的定植水平，所述细菌素的氨基酸序列是选自由SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4组成的组的氨基酸序列；和 (b)适当的治疗载体。
5.一种用于动物的治疗饲料,包括 (a)有效量的至少一种分离的细菌素，以至少降低至少一种目标细菌的定植水平，所述细菌素的氨基酸序列是选自由SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4组成的组的氨基酸序列， (b)治疗载体；和 (C)动物饲料。
6.治疗组合物在制造至少降低至少一种目标细菌在动物中的定植水平的药物中的应用，其中所述治疗组合物包括 有效量的至少一种细菌素，以至少降低至少一种目标细菌的定植水平，所述细菌素的氨基酸序列是选自由SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4组成的组的氨基酸序列；和 治疗载体。
全文摘要
新的细菌素和/或新的产乳酸菌株被用于至少减少至少一种目标细菌在动物、特别是家禽中的定植水平。
文档编号A61P31/04GK102887945SQ20121012125
公开日2013年1月23日 申请日期2005年3月18日 优先权日2005年3月18日
发明者N·J·斯特恩, E·A·斯韦托奇, B·V·叶鲁斯拉诺夫, L·I·沃洛季纳, Y·N·科瓦列夫, T·Y·库德里亚夫采瓦, V·V·佩雷列金, V·D·波基兰科, V·P·列夫查克, V·N·博曾科夫, O·E·斯韦托奇, E·V·米特西韦奇, I·P·米特西韦奇 申请人:由农业部部长代表的美利坚合众国, 国家应用微生物和生物技术研究中心