一种格氏乳球菌和生物防腐保鲜剂及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种格氏乳球菌和生物防腐保鲜剂及其应用，所述的格氏乳球菌命名为格氏乳球菌(Lactococcus garviea)SY?1，保藏号为CGMCC No.9485。所述的生物防腐保鲜剂含有所述的格氏乳球菌的发酵液。本发明格氏乳球菌SY?1的发酵液具有较强的抗菌、抑菌活性，特别与菊芋叶提取物按一定比例混合协同使用，对山药等块根作物的黑斑病具有较好的防治作用，大大减少了其发病率、延长了其贮藏时间，同时还具有一定的保鲜作用；本发明格氏乳球菌SY?1发酵液与菊芋叶提取物混合物具有安全、高效、无毒、无残留、可食用等众多优点，具有较好的经济和社会价值。CGMCC No.948520140728
【专利说明】
一种格氏乳球菌和生物防腐保鲜剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种格氏乳球菌和生物防腐保鲜剂及其应 用。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称，其在自然界 分布广泛，具有丰富的物种多样性。它们在工业、农业、食品和医药等与人类生活密切相关 的领域具有极高的应用价值，因此受到人们极大的关注和重视。细菌素是细菌在代谢过程 中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽。对同种近缘菌株呈现 狭窄的抑制谱，通过在靶细胞上穿孔、抑制肽聚糖合成，与核糖体或tRNA相互作用抑制蛋白 质合成，直接降解靶细胞DNA，从而起到抑菌效果。乳酸菌通过分泌细菌素具有一定的抑菌 活性。目前细菌素已广泛地应用于农业生产和食品加工等领域。
[0003]山药、土豆、红薯等是颇具食用和药用保健价值的粮食作物，深受广大群众的喜 爱，大有发展前途。近年来，随着种植面积的不断扩大，其病害发生也随之加重，其中包括真 菌病害、细菌病害以及病毒病害等，而这些病害的发生在雨水多的季节尤为突出，其为害程 度也随之加重，严重制约着这些农作物的发展。目前主要是使用化学药剂对其进行防治，化 学药剂有毒、有残留，对农产品质量和人民健康产生重要影响。随着对食品安全和健康问题 的普遍关注，消费者对天然产物的兴趣越来越高。由于化学防腐剂存在的问题和缺陷，天然 生物防腐剂引起了食品工业界的极大重视。采用天然防腐剂，可以赋予食品更高的营养价 值，减少或完全停用化学防腐剂，并且确保食品的微生物安全性。
【发明内容】
[0004] 发明目的：针对目前化学药剂在山药、土豆、红薯等块根农作物黑斑病防治、保鲜 等方面存在的问题，本发明提出了具有优异抑菌效果的一种格氏乳球菌，可将其应用于农 产品贮藏期间黑斑病防治中以及农产品保鲜中。
[0005] 为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0006] -种格氏乳球菌，命名为格氏乳球菌（Lactococcus garviea) SY-I，保藏号为 CGMCC No.9485〇
[0007] 本发明格氏乳球菌从山药表皮分离，分类命名为格氏乳球菌Lactococcus garviea，革兰氏阳性菌，单菌落为乳白色、圆形，表面光滑，边缘完整，已经保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为CGMCC No.9485，保藏曰期 2014年 7 月28。
[0008] 本发明还提供了所述的格氏乳球菌在农产品储存期黑斑病防治中的应用。所述的 应用包括:将所述的格氏乳球菌的发酵液施加与农产品的表面。
[0009] 本发明还提供了所述的格氏乳球菌在农产品保鲜中的应用。所述的应用包括:将 所述的格氏乳球菌的发酵液施加于农产品的表面。
[0010] 在农产品保鲜或黑斑病防治过程中，所述的格氏乳球菌的发酵液与菊芋叶提取物 联合施加于农产品的表面，能够发挥更好的效果。联合施用时，所述的发酵液与菊芋叶提取 物的质量比为150-200:1，使用时稀释0-7倍，较好的稀释3-5倍。
[0011] 所述的发酵液的制备方法为:活化所述的格氏乳球菌，然后接种于培养基中进行 培养，获得种子液;将种子液接种于发酵培养基中进行发酵，发酵结束后获得发酵液。
[0012] 所述活化的方法为:取所述的格氏乳球菌菌种，划线至ATB固体培养基平板上，进 行培养;培养温度为25-28°(：，培养时间为30-3611。
[0013] 制备种子液时，所述的培养基为ATB液体培养基，培养温度为25-28°C，培养时间为 24-30h。
[0014] 发酵时，接种量为5-10 %体积比，发酵培养基为ATB液体培养基，培养温度为25-28 。(：，培养时间为24-30h。
[0015] ATB液体培养基配方为：葡萄糖8g/L，酵母浸粉4g/L，蛋白胨10g/L，MgS〇4 · 7H20 0.2g/L，MnS〇4 · 4H20 0.05g/L，番茄汁250mL/L，pH值4.5-4.8,溶剂为水，121°C灭菌20min。
[0016] 所述的菊芋叶提取物的制备方法包括:取菊芋叶，粉碎、打浆后置于50~60%乙醇 水溶液中进行超声提取，超声提取结束后离心，取上清，上清浓缩干燥后得所述的菊芋叶提 取物。
[0017] 超声提取的料液比为1:10~15。超声提取的温度为30-40°C，时间为60-80min，超 声功率为600-800w。离心条件为离心力6000-8000g，离心时间30min。浓缩温度为30-40°C。
[0018] 所述的农产品为山药、土豆等块茎。
[0019] 本发明还提供了一种生物防腐保鲜剂，含有所述格氏乳球菌的发酵液。
[0020] 进一步的，所述的生物防腐保鲜剂还含有菊芋叶提取物。
[0021] 生物防腐保鲜剂中，所述发酵液与菊芋叶提取物的质量比为150-200:1。
[0022] 所述的生物防腐保鲜剂可应用于农产品储存期黑斑病防治或农产品保鲜中。具体 方法为:将所述的生物防腐保鲜剂用水稀释0-7倍，较好的为3-5倍，利用喷洒或浸泡处理山 药等块根农产品，晾干后进行贮藏。
[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0024] 1)本发明从山药表皮分离获得了格氏乳球菌SY-I，该菌保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心（菌种保藏号为CGMCC No.9485,保藏日期2014年7 月28)，该菌株具有优异的抑菌效果，特别是对山药黑斑病菌具有强烈的抑制作用。
[0025] 2)本发明采用了格氏乳球菌SY-I发酵液，其发酵液具有较强的抗菌功能，与菊芋 叶提取物按一定比例混合协同使用，对山药等块根作物贮藏期间的黑斑病具有较好的防治 效果，大大减少了其发病率、延长了其贮藏时间。
[0026] 3)本发明格氏乳球菌SY-I发酵液与菊芋提取物混合物和普通化学药剂相比，具有 安全、高效、无毒、无残留、可食用、不会对环境和人体造成任何伤害等众多优点，
[0027] 4)本发明格氏乳球菌SY-I发酵液与菊芋提取物混合物主要用于山药等块根作物 在贮藏期间黑斑病的防治，同时其还可以减少块根水分的散失、抑制其呼吸强度，具有一定 的保鲜作用。
【附图说明】
[0028] 图1为格氏乳球菌SY-I抑菌图；
[0029] 图2为格氏乳球菌SY-I在ATB培养基上的菌落形态；
[0030] 图3为格氏乳球菌SY-I革兰氏染色图；
[0031] 图4为格氏乳球菌SY-I 16S rRNA基因序列；
[0032]图5为格氏乳球菌SY-I发酵液与菊芋提取物混合物对山药黑斑病防治作用；
[0033]图6为格氏乳球菌SY-I发酵液与菊芋提取物混合物对土豆保鲜作用。
【具体实施方式】
[0034] 本发明所涉及的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)SY_l，已于2014年7月28保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，分类命名为格氏乳球 菌Lactococcus garviea，菌种保藏号为CGMCC No·9485。本发明格氏乳球菌(Lactococcus garvi ea) SY-I是从山药表皮分离获得。
[0035] 以下实施例用于说明本发明，但并不限定于本发明。若无特别说明，下述实施例中 所用技术方法均为常规方法;若无特别说明，下述实施例中所用实验材料均为常规化学试 剂和生化试剂。
[0036]以下所述的ATB培养基配方为:葡萄糖8g/L，酵母浸粉4g/L，蛋白胨10g/L,MgSO4 · 7H20 0.2g/L，MnS〇4 · 4H20 0.05g/L，番茄汁250mL/L，pH值4.5-4.8，121°C灭菌SOmiruATB固 体培养基:ATB液体培养基中加入2 %琼脂。
[0037]实施例1格氏乳球菌SY-I的分离鉴定 [0038] 1、分离
[0039]取新鲜山药皮(带泥土)50g，打碎，混合均匀，取IOg处理过的山药皮倒入含有20粒 细玻璃珠和IOOmL灭菌去离子水的250mL三角瓶中，在摇床上150r/min、25°C条件下震荡lh， 静止30min后，取上清lmL，用灭菌去离子水10倍梯度稀释，分别得到10' 10' 10-3、10-4、10 一5、10-6、10- 77个梯度，分别吸取100yL，不同梯度稀释液涂于ATB固体平板培养基上，25-28 °C，静止培养30-36h。利用接种环挑取单菌落在ATB固体培养基平板上划线纯化2-3次，将纯 化的不同形态的单菌落编号转接到ATB固体平板上，25-28Γ，静止培养30-36h，然后保存于 4°C待用。
[0040] 2、抑菌试验
[0041]将保存于ATB固体培养基上的纯化了的菌株在ATB液体培养基中培养，培养条件为 25°C，静止培养36h。另外将山药表皮黑斑上的菌体接种到ATB固体培养基平板上，均匀涂 布，在30°C培养48h。然后利用灭菌打孔器在固体平板上打孔，孔径为4mm，每个平板均匀打6 个孔。然后将40yL培养好的待测定分离纯化菌液滴加到孔内，在28°C静止培养36h，通过抑 菌圈评估待测菌株对山药黑斑病菌的抑制活性。结果发现有三株菌株对山药黑斑病菌有明 显抑制作用，但SY-I抑制活性最强，抑菌圈直径为24.3mm，结果见图1。因此后面对这株菌进 行了进一步的鉴定。
[0042] 3、形态观察
[0043]将抑菌活性最强的菌株SY-I接种到IOOmL ATB液体培养基中，25°C静止培养30h， 然后在无菌条件下用无菌接种环在ATB固体培养基上划线，之后在25°C静止培养36h，观察 菌落形态，单菌落为乳白色、圆形，表面光滑，边缘完整，结果见图2所示。挑取单菌落，进行 革兰氏染色，并在显微镜下观察，此菌为革兰氏染色阳性球菌，结果见图3所示。由图2和图3 结果基本鉴定SY-I为乳酸球菌。
[0044] 4、分子生物学鉴定
[0045]利用灭菌牙签挑取SY-I单菌落于含有50mL ATB液体培养基的250mL三角瓶中，在 25 °C静止培养24h，然后利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取此菌的基因组DNA。利用16S rRNA通用引物fd2 (5 ' -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 '）和rpI (5 ' -ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 '） PCR扩增DNA片段，将PCR产物送基因测序公司进行测序。此菌16S rRNA基因测序结果如图4 所示。根据获得的16S rRNA基因序列，在NCBI数据库中利用genebank数据库进行比对，得出 其与格氏乳球菌基因相似度最高达99.5%，因此鉴定此菌为格氏乳球菌（Lactococcus garviea)，并命名此菌为格氏乳球菌SY-I。
[0046]实施例2菌株的应用 [0047] 1、抑菌试验
[0048] 格氏乳球菌SY-I发酵液的制备:取格氏乳球菌SY-I保藏菌种，无菌操作下划线至 ATB固体培养基平板上，进行活化培养;活化培养后，在无菌条件下挑取单菌落接种至装有 50mL ATB液体培养基的250mL三角瓶中，进行培养，获得种子液;将种子液按5 %体积比接种 至新的ATB培养基中，在28 °C条件下静止培养24h，得发酵液；
[0049] 菊芋叶提取物的制备:取新鲜菊芋叶，粉碎、打浆，按照1:10料液比(g/L)混合后置 于50%乙醇水溶液中进行超声提取，提取温度40°C，提取时间60min，超声波功率800w;提取 后在8000g离心力下，离心30min，除去沉淀取上清;将上清在30°C真空浓缩，然后冷冻干燥 得菊芋叶提取物。
[0050] 将格氏乳球菌SY-I发酵液与菊芋叶提取物按一定比例混合后稀释不同比例，喷洒 到新鲜山药表面，放置30天后，检测山药黑斑病的发病率。以喷洒清水、格氏乳球菌SY-I发 酵液和菊芋液提取物为对照，结果如表1所示。
[0051 ]实验组1:发酵液与菊芋叶提取物按质量比200:1配制使用；
[0052]实验组2:发酵液与菊芋叶提取物按质量比200:1配制后用水稀释3倍使用；
[0053]实验组3:发酵液与菊芋叶提取物按质量比200:1配制后用水稀释5倍使用；
[0054]实验组4:发酵液与菊芋叶提取物按质量比200:1配制后用水稀释7倍使用；
[0055] 对照组1:清水；
[0056] 对照组2:格氏乳球菌SY-I发酵液；
[0057] 对照组3:菊芋叶提取物，用水稀释为浓度0.5 %使用。
[0058]表1
[0060]由表1可知，格氏乳球菌SY-I发酵液和菊芋叶提取物对山药黑斑病都具有一定的 抑制效果，但低于两者混合物的抑制效果。两者混合质量比为200:1时，稀释1倍到5倍，抑制 效果基本一样，稀释7倍时抑制效果明显减弱。根据此结果最终确定发酵液与菊芋叶提取物 按质量比150-200:1进行混合，然后稀释3-5倍使用。
[0061] 2、在防治山药黑斑病中的应用
[0062] 将保存的格氏乳球菌SY-I种子液按10 %体积比接种到ATB液体培养基中，25 °C静 止培养30h得发酵液。取新鲜菊芋叶，粉碎、打浆，按照1:10料液比（g/L)混合后置于50%乙 醇溶液中进行超声提取，提取温度40°C，提取时间60min，超声波功率800w;提取后在8000g 离心力下，离心30min，除去沉淀取上清;将上清在30°C真空浓缩，然后冷冻干燥得菊芋叶提 取物。将格氏乳球菌SY-I发酵液与菊芋叶提取物按质量比150:1进行混合，然后加水稀释3 倍、5倍，然后喷洒到新鲜山药表面，喷洒完后进行常温储藏，分别在贮藏20天、30天和40天 后检测山药发病率，结果如图5所示。喷洒3倍稀释液的山药贮藏20天、30天和40天后山药发 病率分别为3%、7 %和13%，喷洒5倍稀释液的山药贮藏20天、30天和40天后山药发病率分 别为 4%、11% 和 18%。
[0063] 3、在土豆保鲜中的应用
[0064]将保存的格氏乳球菌SY-I种子液按10 %体积比接种到ATB液体培养基中，25 °C静 止培养30h得发酵液。取新鲜菊芋叶，粉碎、打浆，按照1:15料液比（g/L)混合后置于60%乙 醇溶液中进行超声提取，提取温度30°C，提取时间80min，超声波功率600w;提取后在6000g 离心力下，离心30min，除去沉淀取上清;将上清在40°C真空浓缩，然后冷冻干燥得菊芋叶提 取物。将发酵液与菊芋叶提取物按质量比200:1进行混合，然后加水稀释5倍，然后喷洒到新 鲜土豆表面，喷洒完后进行常温储藏，每隔5天测定一次重量，得出失重率，结果如图6所示。 由图6可知喷洒本发明液体的土豆失重率明显低于对照失重率，说明本发明格氏乳球菌SY-1发酵液与菊芋叶提取物混合物具有较好的保鲜效果。
【主权项】
1. 一种格氏乳球菌，其特征在于，命名为格氏乳球菌(Lactococcus garviea)SY_l，保 藏号为CGMCC No.9485。2. 根据权利要求1所述的格氏乳球菌在农产品保鲜或农产品储存期黑斑病防治中的应 用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用包括:将所述的格氏乳球菌的 发酵液施加于农产品的表面。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述的格氏乳球菌的发酵液与菊芋叶提 取物联合施加于农产品的表面。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，联合施用时，所述的发酵液与菊芋叶提取 物的质量比为150-200:1，稀释0-7倍使用。6. 根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的发酵液的制备方法为:活化所述 的格氏乳球菌，然后接种于培养基中进行培养，获得种子液;将种子液接种于发酵培养基中 进行发酵，发酵结束后获得发酵液。7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的菊芋叶提取物的制备方法包括:取 菊芋叶，粉碎、打浆后置于50~60%乙醇水溶液中进行超声提取，超声提取结束后离心，取 上清，上清浓缩干燥后得所述的菊芋叶提取物。8. -种生物防腐保鲜剂，其特征在于，含有所述格氏乳球菌的发酵液。9. 根据权利要求8所述的生物防腐保鲜剂，其特征在于，所述的生物防腐保鲜剂还含有 菊芋叶提取物，所述发酵液与菊芋叶提取物的质量比为150-200:1。10. 根据权利要求8或9所述的生物防腐保鲜剂在农产品保鲜或农产品储存期黑斑病防 治中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK105861400SQ201610438452
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】马艳弘, 李亚辉, 殷剑美, 张宏志, 张培通, 黄开红
【申请人】江苏省农业科学院