化合物h2在制备脂肽类抑菌制剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于化合物领域，具体涉及化合物H2在制备脂肽类抑菌制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 芽孢杆菌是一类产生芽孢的革兰氏阳性菌株，它的分布广泛，生理特征丰富，易于 分离和培养，是自然界中重要的微生物菌群，芽孢杆菌可以产生多种抗菌活性物质，包括由 非核糖体途径合成的非核糖体肽类抗生素以及由核糖体途径合成的细菌素、酶类及其他活 性蛋白类抗菌物质等。
[0003] 168菌株是芽孢杆菌的模式菌株，也是目前研究的最为透彻的菌株，他的全基因组 已于1997年测序完成。与野生芽孢杆菌不同的是模式菌株168由于在实验室的长期继代培 养，发生了很多的自发突变因而丧失了很多野生型的特点，比如sfp基因的自发突变，使得 168菌株丧失了产生脂肽类化合物的能力，因而缺失了抑菌的能力。sfp基因编码的4'-磷酸 泛酰巯基乙胺基转移酶，是芽孢杆菌非核糖体途径合成脂肽类化合物的关键基因。
[0004] 本研究的目标菌株解淀粉芽孢杆菌HAB-2( 2015年1月27日在中国典型培养物保藏 中心进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为：CCTCC Μ 2015070,地址为武汉大学 内）经过一系列的前期实验表明：生防菌ΗΑΒ-2具有广谱的抑制热带病原真菌的活性，并且 对部分植物具有促进生长，对鲜果具有保鲜的作用，但是该菌株没有sfp基因，但是通过现 代的仪器分析手段我们又在HAB-2发酵液中检测得到了由于sfp缺失而不可能得到的脂肽 类物质一一表面活性素类物质，因此研究该菌株的具体活性成分很有必要，值得进一步的 研究。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于解决现有技术中的不足，对解淀粉芽孢杆菌HAB-2的发酵液的 具体活性成分进行研究，提供化合物H2在制备脂肽类抑菌制剂中的应用。
[0006] 本发明提供了化合物H2在制备脂肽类抑菌制剂中的应用，化合物H2的结构式如下 式所示：
[0008]优选地，化合物H2应用于制备防治植物真菌病害制剂。
[0009]进一步优选地，所述植物真菌病害为番茄早疫病、西瓜枯萎病、香蕉枯萎病、棉花 枯萎病、橡胶炭疽病、橡胶树棒孢霉落叶病、茶轮斑病、芒果炭疽病、和/或橡胶褐根病中的 一种或多种。
[0010]优选地，化合物H2从解淀粉芽孢杆菌HAB-2的发酵液中分离得到，所述菌株HAB-2 的保藏编号为:CCTCC Μ 2015070。
[0011 ]优选地，化合物Η2的制备方法如下：
[0012]步骤1，取解淀粉芽孢杆菌ΗΑΒ-2的发酵液，正丁醇萃取，取萃取液，浓缩；
[0013]步骤2,对浓缩物采用柱层析分离得到化合物Η2。
[0014]进一步优选地，柱层析分离包括以下步骤：
[0015] (1)对浓缩物使用减压柱层析（抽柱Vacuum Liquid Chromatography)，采用氯仿 和甲醇进行梯度洗脱；
[0016] (2)取具有抑菌活性的馏分，采用常压柱分离，洗脱所用溶剂为步骤（1)中洗脱出 具有抑菌活性的馏分的溶剂；
[0017] (3)取步骤(2)得到的馏分中具有抑菌活性的馏分，采用凝胶柱分离，洗脱所用溶 剂为步骤(1)中洗脱出具有抑菌活性的馏分的溶剂；
[0018] (4)取步骤(3)得到的馏分中具有抑菌活性的馏分，采用凝胶柱分离洗脱所用溶剂 为甲醇；
[0019] (5)取取步骤(4)得到的馏分中具有抑菌活性的馏分，过C18反向柱，采用甲醇和水 梯度洗脱，合并具有抑菌活性的部分，浓缩干燥，即得。
[0020] 更进一步优选地，若步骤（1)得到的具有抑菌活性的馏分由不同比例的氯仿和甲 醇的混合溶剂洗脱出来的，则步骤(2)洗脱所用溶剂的极性小于或等于步骤(3)洗脱所用溶 液的极性。
[0021]优选地，所述解淀粉芽孢杆菌HAB-2的发酵液的采用下述步骤制备而成;将解淀粉 芽孢杆菌HAB-2接种于液体的溶菌肉汤培养基中，在26~30°C的条件下，50~500转/分钟摇 菌1~3天，即得到发酵液。
[0022]本发明对解淀粉芽孢杆菌HAB-2的发酵液的具体活性成分进行研究，分离得到化 合物H2，具有广谱的抑制热带病原真菌的活性，并且对部分植物具有促进生长，对鲜果具有 保鲜的作用，可应用于制备脂肽类抑菌制剂，防治植物真菌病害，尤其可应用于番茄早疫 病、西瓜枯萎病、香蕉枯萎病、棉花枯萎病、橡胶炭疽病、橡胶树棒孢霉落叶病、茶轮斑病、芒 果炭疽病、和/或橡胶褐根病等，值得应用推广。
【附图说明】
[0023] 图1为化合物H2的1H-1!! C0SY、HMBC和NOSEY的关联图；
[0024] 图2为减压柱层析分离得到的各馏分的薄层层析色谱和抑菌效果图，其中，图a为 抑菌试验结果，图b为薄层层析色谱，1为脂肽，2为甲醇冲柱馏分，3为C:M=1:1冲柱馏分(C 为氯仿，Μ为甲醇），4为C:M=2:1冲柱馏分，5为C:M=3:1冲柱馏分，6.为C:M = 5:1冲柱馏分， 7为正丁醇提取物；
[0025]图3为过常压柱得到的各馏分的薄层层析色谱和抑菌效果图，其中，图a抑菌试验 结果，图b为薄层层析色谱；
[0026] 图4为过C:M=1:1凝胶柱得到的各馏分的薄层层析色谱和抑菌效果图，其中，图a 和图b为抑菌试验结果，图c为薄层层析色谱；
[0027] 图5为过甲醇凝胶柱得到的各馏分的抑菌效果图；
[0028] 图6过C18反向柱得到的各馏分的抑菌效果图；
[0029]图7为提纯的化合物H2的抑菌效果图，其中，图a为抑菌试验结果，1为正丁醇提取 物，2为过C18反向柱得到活性成分，3为提纯的化合物H2;图b为化合物H2的薄层层析色谱； [0030]图8为化合物H2的氨基酸分析图；
[0031 ]图9为化合物H2与咪鲜胺抑菌能力比较结果图，其中，其中，图a为抑菌试验结果，1 为咪酰胺，2为脂肽提取物，3为正丁醇提取物，4为纯品化合物H2,图b为咪鲜胺与抑菌圈大 小线性回归方程图。
【具体实施方式】
[0032]下面参照附图，结合具体的实施例对本发明做进一步的说明，以更好地理解本发 明。
[0033] 1、化合物分离
[0034] 1.1解淀粉芽孢杆菌HAB-2的发酵液
[0035]将保存的生防菌菌株HAB-2接种于溶菌肉汤培养基上28°C活化培养，培养3天，挑 去黄豆粒大小的生防菌HAB-2加入到液体的溶菌肉汤培养基中，28°C，200转每分钟摇菌2 天，即得到发酵液，利用高速离心机，10000转每分钟离心10分钟去除菌体，得到无菌体发酵 液，
[0036] 1.2正丁醇萃取法
[0037]按照体积比1:1的比例将发酵液与正丁醇充分混合，静止12个小时，分液漏斗萃取 得到上层正丁醇，利用旋转蒸发仪，蒸出有机溶剂正丁醇即得到浓缩物。
[0038] 1.3减压柱层析
[0039] 对浓缩物使用减压柱层析，采用氯仿(C)和甲醇(M)进行梯度洗脱:C:M = 5:1(V/V) 4C:M=3:1(V/V)-C:M = 2:1(V/V)4C:M=1:1(V/V)-M。通过硅胶 TLC 薄层层析来检测馏 分和更换洗脱溶剂。
[0040] 将芒果炭疽病病原真菌接种于马铃薯葡糖糖琼脂培养基上，将各馏分滴加灭菌滤 纸片上彻底干燥以后，均匀的贴在培养基上，检测各馏分的抑菌活性。结果如图2所示。通过 硅胶TLC薄层层析与抑菌成分相互对照，馏分3(C:M=1:1冲柱馏分)和馏分4(C:M=2:1冲