液、白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液加入 已经稀释的氢氧化铝佐剂内，调pH至5. 8~7. 2,即为无细胞百日咳疫苗。
[0063] 进一步地，步骤S13中所述百日咳黏附素、丝状血凝素和百日咳毒素的纯化方法 分别为：
[0064] 所述百日咳黏附素的纯化为：将离心后收集的菌体采用60°C热释放，超滤浓缩 后，上样于Capto adhere层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，收集含百日咳黏附素的洗脱组 份，再上样于Capto SP层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，以氯化钠梯度洗脱，收集洗脱峰；
[0065] 所述丝状血凝素和百日咳毒素的纯化为：离心后的上清液超滤浓缩后上样于 Capto SP层析柱，流动相采用含尿素的磷酸盐缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，分别收集含丝状 血凝素和百日咳毒素的洗脱组份，将含百日咳毒素的洗脱组份上样于CaptoMMC层析柱，缓 冲液采用Tris-HCl缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，收集百日咳毒素洗脱峰；将含丝状血凝素 的洗脱峰上样于羟基磷灰石层析柱纯化，收集洗脱峰。
[0066] 将上述制备的无细胞百白破联合疫苗按照每人份剂量分别分装在预灌装注射瓶 和西林瓶中，再包装至每人份市售独立包装。
[0067] 以下通过实验说明本发明的有益效果：
[0068] 成品检定：
[0069] 1鉴别试验
[0070] 采用酶联免疫法检测PT、FHA、PRN抗原，应含有相应抗原（《中国药典》2010版三 部"吸附百白破联合疫苗"中附录IX S)。采用絮状试验（《中国药典》2010版三部"吸附 百白破联合疫苗"中附录XI D)，本品应与白喉抗毒素、破伤风抗毒素出现絮状反应。
[0071] 2物理检查
[0072] 2. 1外观：振摇后应呈均匀乳白色混悬液，无摇不散的凝块或异物。
[0073] 2. 2装量：依法检查（《中国药典》2010版三部，附录IA)，应不低于标示量。
[0074] 3化学检查
[0075] 3. I pH 值：应为 5. 8 ~7. 2
[0076] 3. 2氯化钠含量：应为7. 5~9. 5g/L(《中国药典》2010版三部，附录VII G)。
[0077] 3.3氢氧化铝含量：应为LO~I. 5mg/ml(《中国药典》2010版三部，附录VII F)。
[0078] 3.4游离甲醛含量：应不高于0.2g/L(《中国药典》2010版三部，附录VI F)
[0079] 3. 5戊二醛含量：应小于0· 01g/L(《中国药典》2010版三部，附录VI D)。
[0080] 4.效价测定
[0081] 4.1无细胞百日咳疫苗
[0082] 每1次人用剂量中的免疫效价应不低于4. OIU(按《中国药典》2010版三部"吸附 百白破联合疫苗"中附录2进行）。
[0083] 4.2白喉疫苗
[0084] 每1次人用剂量中白喉类毒素的免疫效价应不低于30IU(《中国药典》2010版三 部，附录XI C)。
[0085] 4. 3破伤风疫苗
[0086] 每1次人用剂量中破伤风类毒素的免疫效价应不低于40IU(《中国药典》2010版 三部，附录XI B)。
[0087] 5.无菌检查：依法检查（《中国药典》2010版三部，附录XII A)，应符合规定。
[0088] 6特异性毒性检查
[0089] 6. 1无细胞百日咳疫苗
[0090] 按《中国药典》2010版三部"吸附无细胞百白破联合疫苗"附录2. 5项进行。
[0091] 6.2白喉、破伤风疫苗
[0092] 用体重250~350豚鼠，每批制品不少于4只，每只腹部皮下注射2. 5ml，分两侧注 射，每侧I. 25ml，观察30天。注射部位可有浸润，经5~10天变成硬结，可能30天不完全 吸收。在第10、第20、第30天称体重，到期体重比注射前增加，局部无化脓、无坏死、无破伤 风及晚期麻痹症者为合格。
[0093] 7.毒性逆转试验：供试品置37°C四周，按《中国药典》2010版三部"吸附无细胞百 白破联合疫苗"附录2. 6项进行。
[0094] 采用上述方法对实施例1-7制备的无细胞百日破联合疫苗进行检测，实验结果如 表1所示：
[0095] 表1 :无细胞百日破联合疫苗的实验检测结果
[0096]
【主权项】
1. 一种无细胞百日破联合疫苗，其特征在于，它由下述组分的原料组成： 百日咳毒素： 5~40yg; 丝状血凝素：5~40yg; 百日咳黏附素 ：2~IOyg; 白喉类毒素：10~251f ; 破伤风类毒素 ：4~IOlf ; 氢氧化错： L 0~2. Omg/ml ; 氯化钠： 7. 5~9. 5g/L。
2. 根据权利要求1所述的一种无细胞百日破联合疫苗，其特征在于：它由下述组分的 原料组成： 百日咳毒素： 25 yg; 丝状血凝素： 25 yg; 百日咳黏附素：8yg; 白喉类毒素： 12. 51f ; 破伤风类毒素：51f ; 氢氧化铝： 1.0~I. 5mg/ml ; 氯化钠： 7. 5~9. 5g/L。
3. 根据权利要求1或2所述的一种无细胞百日破联合疫苗的制备方法，其特征在于，它 包括以下步骤：
51. 制备各单价疫苗原液
511. 制备白喉类毒素原液：开启白喉杆菌PW8株，先在产毒培养基种子管中传1~ 3代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养基采用改良林氏培养 基，34~36°C培养约48小时，培养结束后加入甲醛杀菌，在培养物中加入硫酸铵沉淀杂蛋 白，离心收集上清，超滤浓缩后再加入硫酸铵盐析沉淀白喉毒素蛋白，离心收集沉淀，加生 理盐水溶解，超滤去除毒素中的硫酸铵，加入甲醛，置35~37°C，脱毒30天，除菌过滤即为 白喉类毒素原液；
512. 制备破伤风类毒素原液：开启破伤风梭状芽孢杆菌，先在产毒培养基种子管中传 1~3代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养基采用双胨培养 基，34~36°C培养62~72小时，培养结束后加入甲醛杀菌，培养液经过滤去除菌体，加入 硫酸铵沉淀毒素蛋白，离心收集沉淀，超滤去除毒素中的硫酸铵后加入甲醛，置35~37°C， 脱毒30天，即为破伤风类毒素原液；
513. 制备无细胞百日咳疫苗原液：开启百日咳杆菌，接种于改良包-姜培养基或活性 炭半综合培养基，于35~37°C培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，生产用培养基 选用CPB培养基，采用培养罐液体培养，于细菌对数生长期后期或静止期前期收获，收获的 培养物采用离心法进行固液分离，然后分别进行分离纯化得百日咳黏附素、丝状血凝素和 百日咳毒素，将百日咳毒素采用戊二醛进行脱毒、百日咳黏附素和丝状血凝素采用甲醛进 行脱毒，除菌过滤后即为无细胞百日咳原液；
52. 合并和稀释：将无细胞百日咳原液、白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液加入已经 稀释的氢氧化铝佐剂内，调PH至5. 8~7. 2,即为无细胞百日咳疫苗。
4. 根据权利要求3所述的一种无细胞百日破联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤 S13中所述百日咳黏附素、丝状血凝素和百日咳毒素的纯化方法分别为： 所述百日咳黏附素的纯化为：将离心后收集的菌体采用60°C热释放，超滤浓缩后，上 样于Capto adhere层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，收集含百日咳黏附素的洗脱组份，再上 样于Capto SP层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，以氯化钠梯度洗脱，收集洗脱峰； 所述丝状血凝素和百日咳毒素的纯化为：离心后的上清液超滤浓缩后上样于Capto SP 层析柱，流动相采用含尿素的磷酸盐缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，分别收集含丝状血凝素和 百日咳毒素的洗脱组份，将含百日咳毒素的洗脱组份上样于CaptoMMC层析柱，缓冲液采用 Tris-HCl缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，收集百日咳毒素洗脱峰；将含丝状血凝素的洗脱峰 上样于羟基磷灰石层析柱纯化，收集洗脱峰。
【专利摘要】本发明公开了一种无细胞百日破联合疫苗及其制备方法，属于疫苗生产制备技术领域，无细胞百日破联合疫苗由下述组分的原料组成：百日咳毒素：5～40μg；丝状血凝素：5～40μg；百日咳黏附素：2～10μg；白喉类毒素：10～25lf；破伤风类毒素：4～10lf；氢氧化铝：1.0～2.0mg/ml；氯化钠：7.5～9.5g/L。制备方法包括制备各单价疫苗原液、合并和稀释。本发明的疫苗成分明确，容易进行质量控制，副作用更小，安全性更好；制备方法具有操作简单、制备方便、成本低、适宜于工业化大规模生产。
【IPC分类】A61K39-05, A61P31-04, A61K39-08, A61K39-10, A61K39-116
【公开号】CN104707134
【申请号】CN201510140594
【发明人】陈道远, 李洪光, 吴强, 陈元芬, 马礼耕, 韩炼, 罗力心
【申请人】成都欧林生物科技股份有限公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月27日