专利名称：预防大肠杆菌病的基因tsh-Ser及其制备以及利用其编码的蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于新基因的制备，特别是指一种预防大肠杆菌病的基因tsh-Ser及其制备以及利用其编码的蛋白。
背景技术：
大肠杆菌病是由大肠杆菌的某些致病性血清型菌株引起的疾病总称。禽大肠杆菌病是指部分或全部由禽致病性大肠杆菌(APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病，包括大肠杆菌性败血症，大肠杆菌性肉芽肿(Hjarre病)、气囊病(慢性呼吸道疾病即CRD)、大肠杆菌性蜂窝织炎(即炎性过程)、肿头综合症、大肠杆菌性腹膜炎、大肠杆菌性输卵管炎、大肠杆菌性骨髓炎/滑膜炎(即火鸡骨髓炎综合征)、大肠杆菌性全眼球炎及大肠杆菌性脐炎/卵黄囊感染。大肠杆菌在哺乳动物主要引起肠道疾病，而当禽类受到高致病性大肠杆菌感染而使其防御能力不足以抵抗或完全丧失时，常会引起典型的继发性局部或全身性感染。大肠杆菌病给养禽业造成了严重的损失，是禽病调查中最常报道的疾病及酮体废弃的主要原因。有资料显示:禽肉加工中43%肉鸡酮体的报废与大肠杆菌性败血症有关。现有技术主要是通过利用抗生素来进行致病性大肠杆菌的治疗，但是由于抗生素的滥用，随着细菌耐药性的增强，大肠杆菌病也越来越难以防治。从食品安全角度考虑，导致直接食用这些禽畜类产品的人群感染大肠杆菌病的几率增加。抗生素的用量越来越大，致使农产品药残量增大，导致人间接性的食用大量的养殖用药，这都给人类健康造成隐患。另外传统疫苗都是通过改变培养条件，或在不同寄主动物上传代的办法使致病微生物的毒性减弱；或是通过物理化学的方法将它们灭活。但这样的疫苗都不理想。因为弱化的菌株可能发生回复突变而变成有毒的，或者失去免疫原性，灭活不适当的疫苗还会引起疾病的流行。因此，迫切需要发展一种性能更佳的新型预防大肠杆菌病的广谱菌苗。
有研究表明，禽大肠杆菌的外膜蛋白在致病性和免疫方面都起着重要的作用。赵香汝和杨汉春的研究(赵香汝，杨汉春.不同血清型禽大肠杆菌外膜蛋白免疫原性研究[J].张家口农专学报.1999，第15卷第4期:4-6.)表明不同血清型禽大肠杆菌混合的外膜蛋白免疫，无论对同型或异型菌株的攻击，都有一定的保护作用。李晓霞和邱玉玉的研究(李晓霞，邱玉玉，王海蓉.肠致病性大肠杆菌外膜蛋白免疫保护性研究[J].中国免疫学杂志.2007，第23卷第4期:394-397.)表明肠致病性大肠杆菌外膜蛋白可以诱导兔对大肠杆菌的特异性体液免疫和细胞免疫应答。禽致病性大肠杆菌中的tsh基因在应用中主要是其翻译表达的蛋白将大肠杆菌粘附于正常的体细胞表面，在文献(陈祥，刘静，高嵩，潘志明，焦新安，刘秀梵.禽病原性大肠杆菌iro和tsh基因缺失的构建[J],生物工程学报.2008，24 (3) =401-408.)报道中出现过将tsh基因敲除后，大肠杆菌病的发病率将会降低的说明，但未见用单一细分的tsh基因及其翻译的蛋白对于对大肠杆菌病预防的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防大肠杆菌病的基因tsh-Ser。本发明的目的之二在于提供一种预防大肠杆菌病的基因tsh-Ser的制备方法。本发明的目的之三在于提供一种预防大肠杆菌病的基因tsh-Ser编码的蛋白。本发明的整体技术构思是:预防大肠杆菌病的基因tsh-Ser,其DNA序列为:atgaacagaatttattctcttcgctacagcgctgtggcccggggctttattgccatatctgagtttgctaggaaatgtgttcataagtctgtcagacgtctgtgtttcccggttttattactgatcccggtactattctctgcaggaagtcttgcgggaacggtcaataatgaactcgggtatcagttatttcgtgattttgctgaaaataaggggatgttccgcccgggggcaacgaatatcgctatttataataagcagggagaatttgtcggtacgctggataaggcagctatgcctgatttcagtgctgtggattcggaaatcggtgtggcgacactgataaacccgcagtatatcgccagcgtgaaacataacgggggatatacaaacgttagctttggtgatggtgaaaaccgttacaatatcgtggaccggaataatgcgccgtcactggattttcatgccccccggctggataaactggtgacagaggttgcccctactgcggtgacggcgcagggggcagtggctggcgcatatctggataaggagcgctatcctgttttttatcgtctggggtctggtactcagtatattaaggacagtaacggacagctgacaaaaatgggaggtgcatattcctggctgaccggcgggactgtcggtagcctgtcatcctatcagaatggagaaatgattagcaccagttcaggtctggttttt gattacaaacttaatggtgcaatgcccatttatggcgaggccggtgacagcggttcgcctttatttgcttttgatactgttcagaataaatgggtgctggtcggtgttcttactgcggggaatggcgcggggggcaggggaaataactgggctgttattccactggattttatcgggcagaaatttaatgaagacaatgatgccccggtcacgttcagaacatcggaaggtggtgcactggagtggagctttaacagcagtaccggagctggtgcgctgacacagggaaccaccacatatgccatgcacgggcagcagggaaatgacctgaatgctggtaagaacctgatatttcaggggcagaatggtcagattaaccttaaggattcggtttctcagggggcgggttccctgacgttccgtgataattacacagtaacaacctctaacggaagtacctggaccggtgccggtattgttgtggacaacggggtgtccgtaaactggcaggttaatggtgttaagggcgataacctgcataaaattggtgaaggtacgctgacggtacagggtacaggtattaatgaaggtggcctgaaggtcggggacggaaaggttgtactgaaccagcaggcggacaataaaggacaggtgcaggcgttcagcagtgttaatattgccagtggccggccgaccgtggtactgactgatgagcggcaggtaaatccggataccgtctcatggggatatcgtgggggcacactggatgttaatggtaacagtctgacgtttcatcagttgaaggcggcagattatggtgccgtgctggcgaataacgttgataaacgggccactatcacgctggactatgccctgcgggctgacaaagtagcactgaatggctggtcggaatcaggtaaaggaactgccggaaatttatataaatacaataacccgtacacaaatacgacggattactteatcctgaagcagagcacctatggttatttccccacggaccagagcagcaacgccacctgggagtttgtggggcacagtcagggggatgcgcagaaactggtagctgaccgtttcaatactgcagggtatctgtttcacggacaactgaaaggcaatctgaatgtggacaatcgcctgcctgaaggcgttaccagtgctctggtgatggacggagctgcggatatctccggtacattcacccaggaaaacgggcgtctgacgctgcaggggcatccggttatccatgcatacaatactcagcctgtggctgacaaactggctgccagtggagaccattcggttctgactcagcctacgtcattcagtcaggaggactgggagaaccgcagttttacctttgacaggctgtcactgaagaacactgattttggtcttggtcgcaatgccacactgaacacaaccatccaggcagataactccagcgtcacgctgggcgacagccgggtatttatcgacaaaaacgatggccagggaacagcctttacccttgaagaaggcacatctgttgcaactaaagatgcagataaaagtgtcttcaacggcaccgtcaacctggataatcagtcagtgctgaatatcaatgatatattcaatggcggaatacaggcgaacaacagtaccgtgaatatctcctcagacagtgccgt tctggggaactcaacactgaccagtaccgccctgaatctgaacaagggagcaaatgctctggccagtcagagttttgtttctgacggtccagtgaatatttctgatgccaccctgagtctgaacagccgtcctgatgaggtatctcacacacttttacctgtatacgattatgccggttcatggaacctgaagggagacgatgcccgcctgaacgtggggccgtacagtatgttgtcaggtaatatcaatgttcaggataaagggactgtcaccctcggaggggaaggggaa ctgagtcctgacctgactcttcagaatcagatgttgtacagcctgtttaacgggtaccgcaatatctggagcgggagcctgaatgcaccggatgccaccgtcagcatgacagacacccagtggtcgatgaacggaaactccacggcaggaaatatgaaacttaaccggacaatagtcggttttaacgggggaacatcaccgttcacgacactgacaacagataatctggacgcggttcagtcagcatttgtcatgcgtacagaccttaacaaggcagacaaactggtgataaacaagtcggcaacaggtcatgacaacagcatctgggttaacttcctgaaaaaaccttctaacaaggacacgcttgatattccactggtcagcgcacctgaagcgacagctgataatctgttcagggcatcaacacgggttgtgggattcagtgatgtcacccccatccttagtgtcagaaaagaggacgggaaaaaagagtgggtcctcgatggttaccaggttgcacgtaacgacggccagggtaaggctgccgccacattcatgcacatcagctataacaacttcatcactgaagttaacaacctgaacaaacgcatgggcgatttgagggatattaatggcgaagccggtacgtgggtgcgtctgctgaacggttccggctctgctgatggcggtttcactgaccactataccctgctgcagatgggggctgaccgtaagcacgaactgggaagtatggacctgtttaccggcgtgatggccacctacactgacacagatgcgtcagcagacctgtacagcggtaaaacaaaatcatggggtggtggtttctatgccagtggtctgttccggtccggcgcttactttgatgtgattgccaaatatattcacaatg aaaacaaatatgacctgaactttgccggagctggtaaacagaacttccgcagccattcactgtatgcaggtgcagaagtcggataccgttatcatctgacagatacgacgtttgttgaacctcaggcggaactggtctggggaagactgcagggccaaacatttaactggaacgacagtggaatggatgtctcaatgcgtcgtaacagcgttaatcctctggtaggcagaaccggcgttgtttccggtaaaaccctcagtggtaaggactggagtctgacagcccgtgccggcctgcattatgagttcgatctgacggacagtgctgacgttcatctgaaggatgcagcgggagaacatcagattaatggcagaaaagacagtcgtatgctttacggtgtggggttaaatgcccggtttggcgacaatacgcgtctggggctggaagttgaacgctctgcatttggtaaatacaacacagatgatgcgataaacgctaatattcgttattcattctga。预防大肠杆菌病的基因tsh-Ser的制备方法，以5’ -atgaacagaatttatt-3'为上游引物zxl，以5’ -gaatgaataacgaa-3’为下游引物zx2，以078血清型大肠杆菌的质粒DNA为模板，釆用PCR扩增方法获得。利用预防大肠杆菌病的基因tsh-Ser编码的蛋白，其氨基酸序列如下=METAsnArgIleTyrSerLeuArgTyrSerAlaValAlaArgGlyPhelleAlalleSerGluPheAlaArgLysCysValHisLysSerValArgArgLeuCysPheProValLeuLeuLeuIIeProValLeuPheSerAlaGlySerLeuAlaGlyThrValAsnAsnGluLeuGlyTyrGlnLeuPheArgAsp PheAlaGluAsnLysGlyMETPheArgProGlyAlaThrAsnlIeAlaIIeTyrAsnLysGlnGlyGluPheValGlyThrLeuAspLysAlaAlaMETProAspPheSerAlaValAspSerGluIIeGlyValAlaThrLeuIIeAsnProGlnTyrIIeAlaSerValLysHisAsnGlyGlyTyrThrAsnValSerPheGlyAspGlyGluAsnArgTyrAsnlleValAspArgAsnAsnAlaProSerLeuAspPheHisAlaProArgLeuAspLysLeuValThrGluValAlaProThrAlaValThrAlaGlnGlyAlaValAlaGlyAlaTyrLeuAspLysGluArgTyrProValPheTyrArgLeuGlySerGlyThrGlnTyrIIeLysAspSerAsnGlyGlnLeuThrLysMETGlyGlyAlaTyrSerTrpLeuThrGlyGlyThrValGlySerLeuSerSerTyrGlnAsnGlyGluMETIIeSerThrSerSerGlyLeuValPheAspTyrLysLeuAsnGlyAlaMETProIIeTyrGlyGluAlaGlyAspSerGIySerProLeuPheAlaPheAspThrValGlnAsnLysTrpValLeuValGlyValLeuThrAlaGlyAsnGlyAlaGlyGlyArgGlyAsnAsnTrpAlaValIIeProLeuAspPheIIeGlyGlnLysPheAsnGluAspAsnAspAlaPr0ValThrPheArgThrSerGluGlyGlyAlaLeuGluTrpSerPheAsnSerSerThrGlyAlaGlyAlaLeuThrGInGlyThrThrThrTyrAlaMETHisGlyGlnGlnGlyAsnAspLeuAsnAlaGlyLysAsnLeuIlePheGlnGlyGlnAsnGlyGlnIIeAsnLeuLysAspSerValSerGlnGlyAlaGlySerLeuThrPheArgAspAsnTyrThrVaIThrThrSerAsnGlySerThrTrpThrGlyAlaGlylleValValAspAsnGlyValSerValAsnTrpGlnValAsnGlyValLysGlyAspAsnLeuHisLysIIeGlyGluGlyThrLeuThrValGlnGlyThrGlyIIeAsnGluGlyGlyLeuLysValGlyAspGlyLysValValLeuAsnGlnGlnAlaAspAsnLysGlyGlnValGlnAlaPheSerSerValAsnlIeAlaSerGlyArgProThrValValLeuThrAspGluArgGlnValAsnProAspThrValSerTrpGIyTyrArgGlYGlyThrLeuAspValAsnGlyAsnSerLeuThrPheHisGlnLeuLysAlaAlaAspTyrGlyAlaValLeuAlaAsnAsnValAspLysArgAlaThrIIeThrLeuAspTyrAlaLeuArgAlaAspLysValAlaLeuAsnGlyTrpSerGluSerGlyLysGlyThrAlaGlyAsnLeuTyrLysTyrAsnAsnProTyrThrAsnThrThrAspTYrPhelleLeuLysGlnSerThrTyrGlyTyrPheProThrAspGlnSerSerAsnAlaThrTrpGluPheValGlyHisSerGlnGlyAspAlaGlnLysLeuValAlaAspArgPheAsnThrAlaGlyTyrLeuPheHisGlyGlnLeuLysGlyAsnLeuAsnValAspAsnArgLeuProGluGlyValThrSerAlaLeuValMETAspGlyAlaAlaAspIleSerGlyThrPheThrGlnGluAsnGlyArgLeuThrLeuGlnGlyHisProValIIeHisAlaTyrAsnThrGlnProValAlaAspLysLeuAlaAlaSerGlyAspHisSerValLeuThrGlnProThrSerPheSerGlnGluAspTrpGluAsnArgSerPheThrPheAspArgLeuSerLeuLysAsnThrAspPheGlyLeuGlyArgAsnAlaThrLeuAsnThrThrlIeGlnAla AspAsnSerSerValThrLeuGlyAspSerArgValPheIIeAspLysAsnAspGlyGlnGlYThrAlaPheThrLeuGluGluGlyThrSerValAlaThrLysAspAlaAspLysSerValPheAsnGlyThrValAsnLeuAspAsnGlnSerValLeuAsnIIeAsnAspIIePheAsnGlyGlyIIeGlnAlaAsnAsnSerThrValAsnIleSerSerAspSerAlaValLeuGlyAsnSerThrLeuThrSerThrAlaLeuAsnLeuAsnLysGlyAlaAsnAlaLeuAlaSerGlnSerPheValSerAspGlyProValAsnIIeSerAspAlaThrLeuSerLeuAsnSerArgProAspGluValSerHisThrLeuLeuProValTyrAspTyrAlaGlySerTrpAsnLeuLysGlyAspAspAlaArgLeuAsnValGlyProTyrSerMETLeuSerGlyAsnIIeAsnValGlnAspLysGlyThrValThrLeuGlyGlyGluGlyGluLeuSerProAspLeuThrLeuGlnAsnGlnMETLeuTyrSerLeuPheAsnGlyTyrArgAsnIIeTrpSerGlySerLeuAsnAlaProAspAlaThrValSerMETThrAspThrGlnTrpSerMETAsnGlyAsnSerThrAlaGlyAsnMETLysLeuAsnArgThrIIeValGlyPheAsnGlyGlyThrSerProPheThrThrLeuThrThrAspAsnLeuAspAlaValGlnSerAlaPheValMETArgThrAspLeuAsnLysAlaAspLysLeuValIIeAsnLysSerAlaThrGlyHisAspAsnSerlIeTrpValAsnPheLeuLysLysProSerAsnLysAspThrLeuAspIIeProLeuValSerAlaProGluAlaThrAlaAspAsnLeuPheArgAlaSerThrArgValValGlyPheSerAspValThrProIleLeuSerValArgLysGluAspGlyLysLysGluTrpValLeuAspGlyTyrGlnValAlaArgAsnAspGlyGlnGIyLysAlaAlaAlaThrPheMETHisIIeSerTyrAsnAsnPheIIeThrGluvalAsnAsnLeuAsnLysArgMETGlyAspLeuArgAspIIeAsnGlyGluAlaGly`ThrTrpValArgLeuLeuAsnGlySerGlySerAlaAspGlyGlYPheThrAspHisTyrThrLeuLeuGlnMETGlyAlaAspArgLysHisGluLeuGlySerMETAspLeuPheThrGlyValMETAlaThrTyrThrAspThrAspAlaSerAlaAspLeuTyrSerGlyLysThrLysSerTrpGlyGlyGlyPheTyrAlaSerGlyLeuPheArgSerGlyAlaTyrPheAspValIIeAlaLysTyrIIeHisAsnGluAsnLysTyrAspLeuAsnPheAlaGlyAlaGlyLysGlnAsnPheArgSerHisSerLeuTyrAlaGlyAlaGluValGlyTyrArgTyrHisLeuThrAspThrThrPheValGluProGlnAlaGluLeuValTrpGlyArgLeuGlnGlyGlnThrPheAsnTrpAsnAspSerGlyMETAspValSerMETArgArgAsnSerValAsnProLeuValGlyArgThrGlyValVaISerGlyLysThrLeuSerGlyLysAspTrpSerLeuThrAlaArgAlaGlyLeuHisTyrGluPheAspLeuThrAspSerAlaAspValHisLeuLysAspAlaAlaGlyGluHisGlnlIeAsnGlyArgLysAspSerArgMETLeuTyrGlyValGlyLeuAsnAlaArgPheGlyAspAsnThrArgLeuGlyLeuGluValGluArgSerAlaPheGlyLysTyrAsnThrAspAspAlalIeAsnAlaAsnIIeArgTyrSerPhe ο本发明的具体工艺步骤和工艺条件还有:制备方法中的步骤A是选用OMEGA公司提供的质粒提取试剂盒(Plasmid MiniKit I D6943-01*)，并按照其说明书进行，提取出078血清型大肠杆菌的质粒DNA。步骤B是选用全式金公司提供 的PCR试剂盒，并按照其说明书进行；通过PCR扩增来获得目的基因。设计上游引物为zxl:5，-atgaacagaatttatt-3，，下游引物为zx2:5’ -gaatgaataacgaa-3’为特异引物，以078血清型大肠杆菌质粒DNA为模板,采用PCR扩增方法获得。PCR反应体系如下:
反应物用量
IOxBuffer (含 Mg2*》2.SpL
2.Sumo I/L dNTP2, O μ L
2OiiitiioI / L zxl0, 5 μ L
2OmmoI/L zx20.5 μ L DNA 模板2.5 μ L 2.5U/mLTaq 酶0.5 μ L
d_16.5pL
总体积25.0pLPCR反应条件为:96°C预变性5分钟，94°C变性I分钟；50°C退火30-60秒，72°C延伸1-2分钟，30个循环；72°C延伸10分钟后，置于4°C冰箱保存。本发明中的引物由申请人自行设计，主要基于产物的特异性好、引物精简不冗长、不易引起错配等技术考虑。本发明中的tsh-Ser基因和大肠杆菌01血清型的温度敏感血凝素tsh基因很相似。经过序列比对，该基因与国际基因库上收录的从美国火鸡体内分离得到的大肠杆菌01血清型基因序列的同源性为99%，序列比对表明:第1900位的碱基由G突变为A，氨基酸国际基因库中的氨基酸序列由甘氨酸(Gly)突变为丝氨酸(Ser)。后续的实验表明，碱基突变之后该基因对大肠杆菌病产生很好的预防作用。tsh-Ser基因与tsh基因同源性、广谱性及免疫效果比较对照
权利要求
1.预防大肠杆菌病的基因tsh-Ser，其特征在于其DNA序列为:
2.预防大肠杆菌 病的基因tsh-Ser的制备方法，其特征在于以5’ -atgaacagaatttatt-3’ 为上游引物 zxl,以 5’ -gaatgaataacgaa-3’ 为下游引物 zx2,以078血清型大肠杆菌的质粒DNA为模板，采用PCR扩增方法获得。
3.根据权利要求2所述的预防大肠杆菌病的基因tsh-Ser的制备方法，其特征在于其工艺条件如下: A、活化培养078血清型大肠杆菌，并提取质粒DNA，以提取的质粒DNA作为PCR反应的模板； B、PCR反应体系如下: 反应物Λ量IOx Buffer (含 Mg2')2.5 μ L2.5mmol/L dNTP2.0 μ L20_oi/L zxl0.5 μ L2Ommo I/L zx20.5 μ LDNA 模板2, 5μΙ2.5U/mL Taq 酶0.5 μ LddH,016.5μΙ总体积25.0pL C、PCR反应条件:96°C预变性5分钟，94°C变性I分钟;50°C退火30-60秒，72°C延伸1-2分钟，30个循环；72°C延伸10分钟后，置于4°C冰箱保存，即得扩增后的温度敏感血凝素基因tsh-Ser。
4.利用预防大肠杆菌病的基因tsh-Ser编码的蛋白，其特征在于其序列如下:
全文摘要
本发明属于新基因的制备，特别是指一种预防大肠杆菌病的基因tsh-Ser及其制备以及利用其编码的蛋白。包括以5’-atgaacagaatttatt-3’为上游引物zx1，以5’-gaatgaataacgaa-3’为下游引物zx2，以O78血清型大肠杆菌的质粒DNA为模板，采用PCR扩增方法获得的预防大肠杆菌病的基因tsh-Ser以及利用其编码的蛋白。本发明解决了现有技术存在的菌苗广谱性差等技术问题。具有广谱性好，免疫效果好、环境友好、工业化开发前景广阔等优点。
文档编号C12N15/31GK103243112SQ20131018113
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月16日 优先权日2013年5月16日
发明者张鑫, 马兴树, 牛志勇, 陈淑芳, 李德斌 申请人:河北科星药业有限公司