专利名称：脑多头蚴热休克蛋白抗原的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以热休克(HSP)重组蛋白为抗原，建立动物多头蝴病免疫金标渗滤检测法。
背景技术：
脑多头蝴病(Coenuriasis)又叫脑包虫病，是由带科的多头带绦虫(Taenia
multiceps)的中绦期幼虫-脑多头蝴(Coenurus cerebralis)寄生于绵羊、山羊、黄牛、
牦牛和骆驼等有蹄动物的脑和脊髓 等处引起的一种寄生虫病，该病是我国草食动物的常见疾病，每年给畜牧业造成巨大的经济损失。近年来，血清学诊断技术已应用于脑多头蝴病的诊断，但由于所用的诊断抗原主要是包囊囊液、多头蝴原头节和囊壁等虫体天然抗原，它们来源十分有限，不能满足实际的需要。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种以热休克(HSP)重组蛋白为抗原，建立动物多头蝴病免疫金标渗滤检测法，旨在解决血清学诊断技术已应用于脑多头蝴病的诊断，但由于所用的诊断抗原主要是包囊囊液、多头蝴原头节和囊壁等虫体天然抗原，它们来源十分有限，不能满足实际的需要的问题。本发明实施例是这样实现的，一种脑多头蝴热休克蛋白抗原的制备方法，该方法从羊脑多头蝴原头节提取总RNA，采用RT-PCR技术首次扩增出HSP基因序列，该基因的开放阅读框为408bp，编码136个氨基酸。将此基因克隆到pET-32a(+)载体，构建重组表达质粒pET-32a-HSP，经转化大肠杆菌 BL21 (DE3)后 IPTG 诱导表达，用 SDS-PAGE 和 Western_blot检测表达产物；以纯化后的表达蛋白作为抗原，建立检测羊脑多头蝴病抗体的重组蛋白胶体金渗滤法(DIGFA)进一步，培养基和常用溶液的配制方法为:利用超纯水配制溶液，用0.22 μ m的过滤器过滤配制好的IPTG溶液；将超纯水800 mL 混合 Yeast Extract5 g, Trypton、10 gNaCllOg,调节 pH 值至
7.2，定容至I 000 mL，并于121 °C高压蒸汽灭菌20 min，再置于4°C保存；将琼脂粉加入液体LB培养基，于121°C的高压灭菌锅灭菌20min，最后将琼脂粉的浓度调节为1.5%(w/v);最后在琼脂糖培养基温度降低后加入氨苄青霉素并倒板；利用购买的氨苄青霉素和超纯水配制成工作液浓度100mg/mL，再用0.22 μ m滤器过滤除菌，于_20°C保存备用；将27.5 g、硼酸54g Tris，置于20 mL 0.5 mol/L EDTA溶液，最后加超纯水定容至 I 000 mL ；将Ig琼脂糖粉末置于90mL超纯水，再加入IOmL的5XTBE，定容至IOOmL ；0.8gN, N' 一亚甲叉双丙烯酰胺、29.2g丙烯酰胺溶于适量超纯水中，定容至lOOmL，于4°C避光保存；将18.17gTris置于超纯水中溶解，利用浓盐酸调节溶液pH为8.8，最后定容至IOOmL,并于4°C保存；将12.1lg Tris置于超纯水中溶解，利用浓盐酸调节溶液pH为6.8，最后定容至IOOmL,并于4°C保存；将IOgSDS干粉溶于80mL的灭菌超纯水中，同过加热溶解干粉，最后定容至10OmT,；将Ig过硫酸铵溶于水中，定容至IOmL ；1.6 mL 双蒸水、2 mL30% 丙烯酸胺、1.5 mol/L Tris (pH8.8)1.3 mL、0% 过硫酸铵
0.05 mL、TEMED 0.002 mL、10%SDS 0.05 mL ；10%SDS0.01 mL、0.68 mL 双蒸水、1.0 mol/L Tris(pH6.8)0.13 mL、30% 丙烯酞胺
0.17 mL、10% 过硫酸铵 0.01 mL、TEMED 0.001 mL ；取14.4g甘氨酸、3gTris混合IgSDS溶解于超纯水,最后定容至IOOOmL ；缓冲液:将0.1%溴酚蓝、25%甘油、14.4mmol/L 2-巯基乙醇、2%SDS混合于60mmol/LTris-HCl ；将45mL甲醇，45mL水，IOmL冰乙酸，0.25g考马斯亮蓝R-250 ；
90mL 甲醇:水(1:1), IOmL 冰乙酸；将Tris碱5.8g，甘氨酸2.9g，SDS (电泳级)0.37g，甲醇200mL，加去超纯水定容至 IOOOmL ；KH2PO40.24g、Na2HPO4.Η202.9g、0.2gKCl、8.8gNaCl、用超纯水定容至 lOOOmL，并
置于高压灭菌锅灭菌后4°C保存备用；将NaC18.8g、lMTris-HCl (pH8.0) 20mL、加入 800mL 超纯水充分搅拌溶解，再加Tween-200.5mL混匀，最后加超纯水定容至IOOOmL,并用高压灭菌锅灭菌后于4°C保存备用；PBSlOmL, BSA0.lg，现配先用；6.0mgDAB, 10mT.0.0lM PBS, I μ L H2O2 ；NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4.12 H2O 3.58 g, KH2PO4 0.27 g 加去离子水溶解并定容至I OOOmL ；在上述PBS中按0.05%加入Tween-20，混匀；含5%FBS 的 0.01 mol/L ρΗ7.4 PBS 溶液；临用前配制0.1 mol/L 柠檬酸(2.1 g/100 mL),0.2 mol/L Na2HPO4.12H20 6.1mL, ddH20 12.5 mL，邻苯二胺 10 mg，溶解后，加入 30%H202 40 μ L ；终止液采用2 mol/L H2SO4。本发明实施例的另一目的在于提供一种利用上述制备方法制备的脑多头蝴热休克蛋白抗原建立检测羊脑多头蝴病抗体的重组蛋白胶体金渗滤法，其特征在于，该重组蛋白胶体金渗滤法包括以下步骤:脑多头蝴总RNA的提取，将保存于液氮的脑包虫原头蝴抽屉总RNA，利用总RNA抽提试剂盒，并按照其说明书进行总RNA抽提；脑多头蝴HSP基因的RT-PCR扩增，根据测序完成的多头带绦虫转录组数据，利用Primer Primer 5.0软件设计一对引物，由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列为:上游引物:5，-CGCGGATCCATGGTGAACGATGCAGAGAAGT-3’下游引物:5，-CCGGTCTCCACCTCCTCAATGGT-3，对抽提的RNA，将抽提的脑多头蝴原头节总RNA进行反转录，反应体系同FABP扩增。合成cDNA，加入引物，进行RT-PCR扩增；Tm-HSP基因胶回收、连接、转化，将RT-PCR扩增得到的HSP基因通过胶回收、连接、转化，将其插入入PMD 18-T载体，并且转化入DH5a大肠杆菌进行扩大培养，其具体步骤同Tm-FABP ；pET-32a -Tm-HSP重组质粒的构建及鉴定；pET-32a_HSP重组质粒在大肠杆菌中的表达与鉴定；将鉴定正确的pET-32a_HSP重组质粒转入E.coli BL21(DE3)进行表达，并且通过SDS-PAGE进行验证，通过免疫印记检测其反应源性，具体操作步骤同FABP的表达与鉴定；免疫金标渗滤法(DIGFA)的建立；DIGFA 与 ELISA 比较检测。进一步，脑多头蝴HSP基因的RT-PCR扩增，根据四川农业大学动物寄生虫学实验室测序完成的多头带绦虫转录组数据，利用Primer Primer 5.0软件设计一对引物，由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列为:
上游引物:5，-CGCGGATCCATGGTGAACGATGCAGAGAAGT-3’下游引物:5’-CCGGTCTCCACCTCCTCAATGGT -3’对抽提的RNA，将抽提的脑多头蝴原头节总RNA进行反转录，反应体系同FABP扩增。合成cDNA，加入引物，进行RT-PCR扩增。扩增参数为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s，循环扩增30次，最后72°C延伸IOmin0 PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳检查结果。进一步，pET-32a -Tm-HSP重组质粒的构建及鉴定，根据测序结果，通过软件分析扩增出的Tm-HSP基因刚好为一个开放阅读框,用Primer Primer 5.0软件重新设计一对引物，并在上、下游引物的5’端设计了 Bamh I和Xho I酶切位点，引物序列为:上游引物P1: 5 ’ -CCGGAATTCATGGGTCTCAAAGAAACAG-3，下游引物 P2:5 ’ -CCGCTCGAGTCAGAATAGAGCCATTAACTC-3，以pMD-Tm-HSP质粒为模板，用上述弓I物对基因的阅读框进行PCR扩增。该PCR扩增的反应参数:94°C预变性5min ;94°C变性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec，循环扩增30次，最后72°C延伸lOmin。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检查结果，并回收目的片段。将pET-32a(+)质粒及上述胶回收的PCR产物分别用Bamh I和Xho I双酶切，酶切产物用T4连接酶16°C连接过夜，转入E.coli DH5a感受态细胞，提取质粒作双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。进一步，免疫金标渗滤法的建立，最佳抗原包被浓度的确定，在垂直流渗滤法检测盒中央NC膜上中央滴加羊IgG0.5yL，为质控点A。周围四点B、C、D、E点加HSP抗原0.5yL，浓度分别为0.5mg/mL、lmg/mL、l.5mg/mL、2mg/mL,干燥后用封闭液封闭4°C保存备用；金标试验操作流程，将检测装置置平板上，在NC膜上滴上羊血清30 μ L，待完全渗入后加洗脱液I滴，洗去未结合抗体；再加驴抗羊IgG胶体金标记物I滴，待渗入后加洗脱液两滴，肉眼判定结果；金标试验结果判定，检测NC膜中央A点显色红色表示检测有效，周围四个热休克抗原包被点显色为阳性。结果表示为“ + ”，“++”，“+++”，仅留下白色或粉红底色为无效检测；灵敏性试验:取阳性混合血清倍比稀释，用DIGFA检测；DIGFA检测血清稀释为1/5，1/10，1/20，1/40，1/80，1/160 梯度；特异性试验:将制备好的诊断膜检测健康羊血清与羊脑多头蝴血清，细粒棘球蝴血清，细颈囊尾蝴血清以评估其特异性；重复性和稳定性试验:将制备好的诊断膜保存于4°C冰箱，每隔一周取出用于脑多头蝴血清的随机检测。
进一步，DIGFA与ELISA比较检测，ELISA与DIGFA检测脑多头蝴患病动物和健康动物血清34份，其中脑多头蝴阳性血清6份，健康羊血清20份，细颈囊尾蝴阳性血清5份，细粒棘球蝴绵羊血清3份；ELISA试验用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原，按每孔100 μ L包被酶标板，置4°C过夜；用PH7.6的PBST洗涤酶标板3次，加待检血清100 μ L /孔，37°C孵育Ih ；PBST洗涤三次后加HRP-兔抗羊IgGlOO μ L /孔，37°C孵育Ih ;洗涤3次后加TMB底物溶液，100 μ L /孔。反应IOmin后用酶标仪于450nm波长处测定吸光值。本发明采用的是抗原为经过筛选的HSPs抗原，是原头节发育过程中应对宿主特异的生理环境而产生的应激性蛋白。通过Ni柱纯化后的HSP具有很高的特异性，并且由于重组蛋白表达后处于细胞裂解液上清，并不需要额外的蛋白复性操作，使HSP蛋白比较完整的保持了天然构像，有利于其保持高度的敏感性。但重组蛋白仅有一种成分，而天然抗原中含有多种蛋白成分，故重组抗原敏感性略低于纯化后的天然抗原。本实验中的胶体金作为标记物具有操作简单，省事，无毒，无致癌性物质，无需昂贵仪器等特点。故该检测板便于携带，有利于田间检测，更适宜在交通不便的偏远地区山羊脑多头蝴病诊断中进行推广应用。
图1是本发明提供的重组克隆质粒PCR产物电泳图，M:DNA分子质量标准；1，4:RT-PCR扩增产物；2，3:质粒PCR产物；图2.是本发明提供的重组质粒PCR产物电泳图，M:DNA分子质量标准DL2000, I, 23:重组质粒PCR产物；图3.是本发明提供的重组质粒PCR产物电泳及酶切，M:DNA分子质量标准DL4500 ；1:重组质粒酶切产物；2:重组质粒；3:重组质粒扩增产物；图4是本发明提供的图9.Pet32a-Tm-HSP重组表达质粒双酶切鉴定，M =DNA分子质量标准；1:重组菌PCR产物；2:双酶切产物；图5.是本发明提供的重组蛋白表达产物的SDS-PAGE ；图6.是本发明提供的IPTG浓度对重组质粒pET32a-Tm_HSP表达效果的影响；图7.是本发明提供的表达蛋白在2mmol/L IPTG条件下，诱导不同时间取样SDS-PAGE电泳检测，M:蛋白质分子质量标准；1:诱导Oh; 2:诱导3h; 3:诱导4h; 4:诱导5h;
图8是本发明提供的不同诱导温度对重组质粒表达效果的影响；图9.是本发明提供的重组表达蛋白免疫印迹；图10.是本发明提供的DIGFA检测结果。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图1至10及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明通过分子生物学的方法，人工合成了一种可以用于脑多头蝴病诊断的重组抗原，并评价了该表达蛋白在脑多头蝴病诊断中的应用价值。1.材料与方法1.1脑多头蝴样品脑多头蝴样品取自发病死亡的山羊脑部，采集的包囊置于配置好的加了双抗的生理盐水中。用灭菌的眼科剪剪破包囊，让原头蝴破囊而于双抗生理盐水中，观察其活性。反复用双抗生理盐水洗涤后，将活性好的原头蝴置于液氮中保存备用。1.2血清阳性血清采自四川某种羊场，自然死亡后剖解证实有包囊存在的患病羊。阴性血清采自从未发生过脑多头蝴病的四川某种羊场健康羊。1.3主要试剂限制性内切 酶(BamhI,Xho I),DNA Marker DL2000、T4 DNA Ligase、pMD18_T 载体、DNA Marker 10Kb、DNA Marker III和PCR引物等购自大连宝生生物工程有限公司；总RNA提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；逆转录试剂盒购自Fermentas公司；dNTP、质粒抽提试剂盒、Taq DNA聚合酶、普通琼脂糖胶DNA回收试剂盒、MasterMixPCR扩增试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司； HRP标记兔抗羊IgG购自博士德公司；96孔酶标板购自costar公司；胶体金渗滤试验中的驴抗羊IgG胶体金试剂、吸水材料、胶体金耗材套装等购自上海金标生物科技公司；硝酸纤维膜购自博士德生物科技公司。1.4菌株及质粒载体大肠杆菌BL21 (DE3)、TaKaRa pMD18_T Vector、E.coli DH5 α 克隆菌购自大连宝生物工程有限公司；原核表达载体pET32a(+)购自invitrogen公司。1.5主要仪器设备赛多利斯的电子天平(BP301S)、Eppendof公司的PCR仪、高速冷冻离心机(Eppendof 5804R)、Eppendof公司的微量加样器；美国Bio-rad公司的凝胶成像系统、FORMA公司的CO2细胞培养箱；Bio-rad公司的酶联免疫检测仪(Mode 1680);北京六一仪器厂的垂直电泳槽(DYCZ-24D型)、恒压横流电泳仪(DF-C型)、电泳槽(DYY-1II型)；三洋公司购置的-70°C超低温冰箱；购置于宁波新芝生物科技股份有限公司超声波细胞粉碎仪(JY92-1I DN);购置于苏净集团安泰有限公司的超净工作台(AIR TECH)。1.6培养基和常用溶液的配制
IPTG (24 mg/mL):利用超纯水配制溶液，用0.22 μ m的过滤器过滤配制好的IPTG溶液。LB 培养基:将超纯水 800 mL 混合 Yeast Extract (0X0ID 公司)5 g,Trypton (0X0ID 公司)、10 gNaCllOg，调节 pH值至 7.2，定容至 I 000 mL，并于 121°C高压蒸汽灭菌20 min，再置于4°C保存。LB琼脂平板:将琼脂粉加入液体LB培养基，于121°C的高压灭菌锅灭菌20min，最后将琼脂粉的浓度调节为1.5%(w/v)。最后在琼脂糖培养基温度降低后加入氨苄青霉素(100 g/mL)并倒板。氨苄青霉素(Amp):利用购买的氨苄青霉素和超纯水配制成工作液浓度IOOmg/mL,再用0.22 μ m滤器过滤除菌,于_20°C保存备用。电泳缓冲液5XTBE:将 27.5 g、硼酸 54g Tris,置于 20 mL 0.5 mol/LEDTA (pH8.0)溶液，最后加超纯水定容至I 000 mL。10g/L琼脂糖凝胶: 将Ig琼脂糖粉末置于90mL超纯水，再加入IOmL的5 X TBE,定容至lOOmL。30%丙烯酰胺母液:0.8gN, N’ 一亚甲叉双丙烯酰胺、29.2g丙烯酰胺溶于适量超纯水中，定容至IOOmL,于4°C避光保存。1.5mol/L Tris-HCl (pH8.8):将18.17gTris置于超纯水中溶解，利用浓盐酸调节溶液PH为8.8，最后定容至IOOmL,并于4°C保存。lmol/L Tris-HCl (pH6.8):将12.1lg Tris置于超纯水中溶解，利用浓盐酸调节溶液PH为6.8，最后定容至IOOmL,并于4°C保存。10% SDS:将IOgSDS干粉溶于80mL的灭菌超纯水中，同过加热溶解干粉，最后定容至 10OmT, η10%过硫酸铵:将Ig过硫酸铵溶于水中，定容至10mL。12%SDS聚丙烯酰胺(分离胶)5 mL:1.6 mL双蒸水、2 mL30%丙烯酸胺、1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 mL、0% 过硫酸铵 0.05 mL、TEMED 0.002 mL、10%SDS 0.05 mL。5% SDS 聚丙烯酰胺(浓缩胶)1 mL:10%SDS0.01 mL、0.68 mL 双蒸水、1.0 mol/LTris(pH6.8)0.13 mL、30% 丙烯酞胺 0.17 mL、10% 过硫酸铵 0.01 mL、TEMED 0.001 mL。Tris-甘氨酸电泳缓冲液(ρΗ8.3):取14.4g甘氨酸、3gTris混合IgSDS溶解于超纯水，最后定容至1000mL。5XSDS凝胶加样缓冲液:将0.1%溴酚蓝、25%甘油、14.4mmol/L 2-巯基乙醇、2%SDS 混合于 60mmol/LTris-HCl (ρΗ6.8)考马斯亮蓝染色液:将45mL甲醇，45mL水，IOmL冰乙酸，0.25g考马斯亮蓝R-250。SDS-PAGE 脱色液:90mL 甲醇:水(1:1 )，IOmL 冰乙酸。转膜缓冲液:将Tris碱5.8g，甘氨酸2.9g，SDS (电泳级)0.37g，甲醇200mL，加去超纯水定容至1000mL。0.01mol/L PBS =KH2PO40.24g,Na2HPO4.Η202.9g、0.2gKCl、8.8gNaCl、用超纯水定容至lOOOmL，并置于高压灭菌锅灭菌后4°C保存备用。TBST (清洗液):将 NaC18.8g、lMTris-HCl (pH8.0) 20mL、加入 800mL 超纯水充分搅拌溶解，再加Tween-200.5mL混勻,最后加超纯水定容至IOOOmL,并用高压灭菌锅灭菌后于4°C保存备用。P/oBSA 包被液:PBSlOmL，BSA0.1g,现配先用。显色液:6.0mgDAB, IOmL0.0lM PBS, I μ L H2O200.01 mol/L ρΗ7.4 PBS (抗原稀释液):NaCl 8 g，KCl 0.2 g, Na2HPO4.12 H2O 3.58g，KH2PO4 0.27 g加去离子水溶解并定容至I OOOmL。
0.01 mol/L ρΗ7.4 PBST (洗涤液):在上述 PBS 中按 0.05% 加入 Tween-20，混匀。封闭液:含5%FBS 的 0.01 mol/L ρΗ7.4 PBS 溶液。邻苯二胺溶液(底物):临用前配制0.1 mol/L柠檬酸(2.1 g/100 mL)，0.2 mol/LNa2HPO4.12H20 (7.163 g/1OOmL) 6.1 mL, ddH20 12.5 mL，邻苯二胺 10 mg，溶解后，加入30%H202 40 μ L。终止液(2mol/L H2SO4)。1.7主要生物信息学数据库和计算机软件BLASTx (http://www.ncb1.nlm.gov/BLAST) BLAST 检测；NCBI (GenBank)数据库:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLASTn ;2试验方法2.1脑多头蝴总RNA的提取将保存于液氮的脑包虫原头蝴抽提总RNA，利用上海舜华生物科技公司的总RNA抽提试剂盒，并按照其说明书进行总RNA抽提。其中其具体步骤为:(I)预先配置RD溶液，将TCL和Phenol等体积于灭菌空瓶中混合置于4°C保存。(2)于液氮中取出保存的原头蝴，并用0.01%的DEPC水反复冲洗，置于0.01%的DEPC水处理过后的研钵中，加入ImLRD后进行充分研磨。研磨结束后将匀浆吸至1.5mL无RNase的离心管中，最后用注射器抽打10次裂解物。(3)高速震荡裂解物2min，再于室温静置5min后，通过颠倒离心管的方式充分混勻，再静置2 5min,接着利用高速离心机12000r/min离心5min,去除沉淀后,将水相移至1.5mL离心管中。(4)接着加入相当于提取水相一半体积的W3，颠倒混匀两种溶液，接着移入平衡好的吸附柱，利用高速离心机9000r/min离心30sec，再将吸附柱装入刚才的收集管中。(5)接着在收集管中加入500 μ LRP液,利用高速离心机9000r/min离心30sec后，再将吸附柱移入下一个干净的收集管中。(6)在新的收集管中加入500μ LW3液，并于室温下静置lmin，接着通过高速离心机9000r/min离心15sec，倒掉收集管中离心废液，再将吸附柱装入同一个收集管。(7)接着往收集管中加入500 μ Lff3液,通过高速离心机9000r/min离心15sec,倒掉收集管中的废液，最后将吸附柱装入同一个收集管中。(8)高速离心机离心lmin。(9)将离心后的吸附柱放入另外一个无菌的1.5mL离心管中，接着在吸附柱吸附膜中央加入50 μ L纯水，静置lmin，再高速离心lmin，即为得到总RNA，再将总RNA放入液氮。2.2脑多头蝴HSP基因的RT-PCR扩增根据四川农业大学动物寄生虫学实验室测序完成的多头带绦虫转录组数据，利用Primer Primer 5.0软件设计一对引物，由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列为:上游引物:5’ -CGCGGATCCATGGTGAACGATGCAGAGAAGT-3 ’下游引物:5，-CCGGTCTCCACCTCCTCAATGGT-3，对抽提的RNA，将抽提的脑多头蝴原头节总RNA进行反转录，反应体系同FABP扩增。合成cDNA，加入引物，进行RT-PCR扩增。扩增参数为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，52°C退火30s，72。。延伸45s，循环扩增30次，最后72°C延伸IOmin0 PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳检查结果。2.3 Tm-HSP基因胶回收、连接、转化将RT-PCR扩增得到的HSP基因通过胶回收、连接、转化，将其插入入pMD 18_T载体，并且转化入DH5a大肠杆菌进行扩大培养，其具体步骤同Tm-FABP。2.4 pET-32a -Tm-HSP重组质粒的构建及鉴定根据测序结果，通过软件分析扩增出的Tm-HSP基因刚好为一个开放阅读框，用Primer Primer 5.0软件重新设ii^一对引物,并在上、下游引物的5’端设计了 Bamh I和XhoI酶切位点。以pMD-Tm-HSP质粒为模板，用上述弓I物对基因的阅读框进行PCR扩增。该PCR扩增的反应参数:94°C预变性5min ;94°C变性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec，循环扩增30次，最后72°C延伸lOmin。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检查结果，并回收目的片段。将pET-32a(+)质粒及上述胶回收的PCR产物分别用Bamh I和Xho I双酶切，酶切产物用T4连接酶16°C连接过夜，转入E.coli DH5a感受态细胞。提取质粒作双酶切鉴定。将鉴定正确的重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。
2.5 pET-32a_HSP重组质粒在大肠杆菌中的表达与鉴定将鉴定正确的pET-32a_HSP重组质粒转入E.coli BL21(DE3)进行表达，并且通过SDS-PAGE进行验证，通过免疫印记检测其反应源性，具体操作步骤同FABP的表达与鉴定。2.6免疫金标渗滤法(DIGFA)的建立最佳抗原包被浓度的确定在垂直流渗滤法检测盒中央NC膜上中央滴加羊IgG0.5 μ L，为质控点Α。周围四点B、C、D、E点加HSP抗原0.5 μ L，浓度分别为0.5mg/mL、lmg/mL、l.5mg/mL、2mg/mL,干燥后用封闭液(ph7.4,0.0lmolPBS, 1%BSA,0.05%Tween_20)封闭4 °C保存备用。金标试验操作流程将检测装置置平板上，在NC膜上滴上羊血清30 μ L，待完全渗入后加洗脱液(ph7.4,0.0lmolPBS, 0.05%Tween-20) I滴，洗去未结合抗体；再加驴抗羊IgG胶体金标记物I滴，待渗入后加洗脱液两滴，肉眼判定结果。金标试验结果判定检测NC膜中央A点显色红色表示检测有效，周围四个热休克抗原包被点显色为阳性。结果表示为“ + ”，“++”，“+++”，仅留下白色或粉红底色为无效检测。灵敏性试验:取阳性混合血清倍比稀释，用DIGFA检测。DIGFA检测血清稀释为1/5，1/10，1/20，1/40，1/80，1/160 梯度。特异性试验:将制备好的诊断膜检测健康羊血清与羊脑多头蝴血清，细粒棘球蝴血清，细颈囊尾蝴血清以评估其特异性。重复性和稳定性试验:将制备好的诊断膜保存于4°C冰箱，每隔一周取出用于脑多头蝴血清的随机检测。
2.7 DIGFA 与 ELISA 比较检测ELISA与DIGFA检测脑多头蝴患病动物和健康动物血清34份，其中脑多头蝴阳性血清6份，健康羊血清20份，细颈囊尾蝴阳性血清5份，细粒棘球蝴绵羊血清3份。ELISA试验用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原(20 μ g/ml )，按每孔100 μ L包被酶标板，置4°C过夜。用PH7.6的PBST洗涤酶标板3次，加待检血清(1:200稀释)100 μ L /孔，37°C孵育Ih0 PBST洗涤三次后加HRP-兔抗羊IgG (1:1000稀释)100 μ L /孔，37°C孵育lh。洗涤3次后加TMB底物溶液，IOOyL /孔。反应IOmin后用酶标仪于450nm波长处测定吸光值。3.试验结果3.1多带绦虫原头蝴Tm-HSP基因的克隆3.1.1原头蝴Tm-HSP基因的PCR扩增通过1.22步骤中的引物设计等过程进行的脑包虫多头蝴Tm-FABP基因的RT-PCR扩增，经过1%的琼脂糖凝胶电泳，观测结果显示:其扩增出来的目标条带大小约400bp (图1)，与预期的片段大小相符。3.1.2重组克隆质粒的PCR鉴定将抽提的重组质粒通过PCR鉴定，其通过1%的琼脂糖凝胶电泳显示于400bp左右出现了电泳条带，与预期的目标条带大小一致。3.1.3重组克隆质粒的序列鉴定经过PCR鉴定而出现特异 大小条带的阳性重组质粒被送往上海英骏生物技术有限公司测序。3.1.4重组克隆质粒的序列分析利用分析软件DNAMAN和DNASTAR对测序结果进行分析,本次扩增序列全长408bp，其ORF框为405bp，编码氨基酸135个。将该序列登陆到GenBank上，登录号为⑶205474。通过将该序列与到GenBank已知的登陆序列比较，可知该序列细粒棘球蝴HSP部分序列(DQ678104.1，AF450087.1)的同源性为 97%。3.2 Tm-HSP基因的亚克隆3.2.1加酶切位点引物的PCR扩增根据测序结果,通过软件分析HSP基因的开放阅读框,用Primer Primer 5.0软件重新设计一对引物，并在上、下游引物的5 ’端设计了 BamH I和Xho I酶切位点，通过PCR扩增出约400bp大小的片段。3.2.2重组质粒的PCR与酶切鉴定通过设计的酶切位点引物对重组的pMD18-T-HSP质粒进行PCR扩增，获得了与预期大小相符合的片段，初步说明该基因已经成功插入了载体。3.3 Tm-FABP基因重组表达质粒的构建与鉴定3.3.1重组表达质粒的双酶切鉴定将上一步骤中酶切亚克隆质粒而产生的Tm-HSP片段通过胶回收后与原核表达载体pET-32a (+)连接，构建pET32a (+) -Tm-HSP重组表达质粒，转化入表达菌BL21，通过单个菌落PCR鉴定和扩大培养。将培养菌液离心后抽取质粒进行双酶切，将酶切产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，隐约看到约400bp的目标片段(图5)3.4重组表达质粒的诱导表达
将构建好的pET32a(+)-Tm_HSP 转入 E.coli BL21(DE3)后，利用 IPTG 进行诱导，一定时间后利用SDS-PAGE电泳表达菌菌液获得约34KDa大小的蛋白，表明多头蝴脂肪酸结合蛋白已经在原核表达系统中表达成功(图6)。3.5重组质粒表达条件的优化3.5.1 IPTG浓度的优化将含有pET32a(+)-Tm-HSP质粒的BL21表达菌在IPTG浓度为0.2 mmol/L、0.4mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L> 1.0 mmol/L 和 2.0 mmol/L 的条件下分别进行诱导 3 小时。通过浓度比较得知2 mmol/L的IPTG浓度为最佳的诱导条件，可以选为诱导表达的工作浓度。3.5.2诱导时间的优化将含有pET32a(+)-Tm-HSP质粒的BL21表达菌在2mmol/L条件下经过3 h、4 h、5h、6h不同诱导时间进行诱导表达，结果显示在5h时间表达量最佳(图7)。3.5.3诱导温度的优化将含有pET32a(+)-Tm_HSP转入BL21表达菌在选取25 °C >30 1:和37 V温度,
0.4 mmol/LIPTG条件下经过5h的诱导。经过SDS-PAGE电泳显示结果37 °C的诱导表达量最大。(图8)。3.6重组蛋白的纯化将菌液通过Ni柱纯化后，按照不同的洗脱峰收集过柱液，最后经过SDS-PAGE进行电泳，寻找最纯的洗脱峰。3.7融合蛋白表达产物Western-Blotting检测经过Ni柱纯化后的蛋白在经过PAGE电泳后，按照1.2.10步骤进行免疫印记检测。结果显示，通过融合表达的Tm-HSP能够与山羊脑多头蝴患羊血清发生反应，该蛋白具有反应源性。见图9.
3.8免疫胶体金渗滤结果(DIGFA)本方法对阳性患病动物检出率为83.3%(5/6)，有5%(1/20)的假阳性出现，其特异性较差，与细颈囊尾蝴阳性血清有40%(2/5)的交叉反应，与细粒棘球蝴血清有66.7%(2/3)的交叉反应。重组Tm-HSP蛋白的最佳包被浓度根据DIGFA检测患病家畜血清的显色结果如图10,判定当抗原浓度为2mg/mL为最佳显色浓度“+++”, 0.5mg/mL、lmg/mL、1.5mg/mL也有显色反应(图10)。3.9 DIGFA 与 ELISA 比较检测ELISA与DIGFA检测患病动物血清结果比较两法均为阳性的有5份，两法均为阴性19份，符合率为92.3% (24/26)，如表I所示。表I DIGFA与ELISA检测结果比较Tablel Comparison of results of by DIGFA and ELISA
权利要求
1.一种脑多头蝴热休克蛋白抗原的制备方法，其特征在于，该方法从羊脑多头蝴原头节提取总RNA，采用RT-PCR技术首次扩增出HSP基因序列，该基因的开放阅读框为408bp，编码136个氨基酸；将此基因克隆到pET-32a(+)载体，构建重组表达质粒pET-32a_HSP，经转化大肠杆菌BL21 (DE3)后IPTG诱导表达，用SDS-PAGE和Western_blot检测表达产物；以纯化后的表达蛋白作为抗原，建立检测羊脑多头蝴病抗体的重组蛋白胶体金渗滤法。
2.如权利要求1所述的脑多头蝴热休克蛋白抗原的制备方法，其特征在于，培养基和常用溶液的配制方法为: 利用超纯水配制溶液，用0.22 μ m的过滤器过滤配制好的IPTG溶液； 将超纯水 800 mL 混合 Yeast Extract5 g, Trypton、10 gNaCllOg,调节 pH 值至 7.2,定容至I 000 mL，并于121°C高压蒸汽灭菌20 min，再置于4°C保存； 将琼脂粉加入液体LB培养基，于121°C的高压灭菌锅灭菌20min，最后将琼脂粉的浓度调节为1.5%(w/v);最后在琼脂糖培养基温度降低后加入氨苄青霉素并倒板； 利用购买的氨苄青霉素和超纯水配制成工作液浓度100mg/mL，再用0.22 μ m滤器过滤除菌，于_20°C保存备用； 将27.5 g、硼酸54g Tris，置于20 mL 0.5 mo I/L EDTA溶液，最后加超纯水定容至1000 mL ； 将Ig琼脂糖粉末置于90mL超纯水，再加入IOmL的5XTBE，定容至IOOmL ； .0.8gN, N' 一亚甲叉双丙烯酰胺、29.2g丙烯酰胺溶于适量超纯水中，定容至IOOmL,于4°C避光保存； 将18.17gTris置于超纯水中溶解，利用浓盐酸调节溶液pH为8.8，最后定容至IOOmL,并于4°C保存； 将12.1lg Tris置于超纯水中溶解，利用浓盐酸调节溶液pH为6.8，最后定容至lOOmL，并于4°C保存； 将IOgSDS干粉溶于80mL的灭菌超纯水中，同过加热溶解干粉，最后定容至IOOmL ； 将1g过硫酸铵溶于水中，定容至IOmL ；.1.6 mL 双蒸水、2 mL30% 丙烯酸胺、1.5 mol/L Tris (ρΗ8.8) 1.3 mL、0% 过硫酸铵 0.05mL、TEMED 0.002 mL、10%SDS 0.05 mL ； 10%SDS0.01 mL、0.68 mL双蒸水、1.0 mol/L Tris (pH6.8)0.13 mL、30%丙烯酞胺0.17mL、10% 过硫酸铵 0.01 mL、TEMED 0.001 mL ； 取14.4g甘氨酸、3gTris混合IgSDS溶解于超纯水,最后定容至IOOOmL ； 缓冲液:将0.1%溴酚蓝、25%甘油、14.4mmol/L 2-巯基乙醇、2%SDS混合于60mmol/LTris-HCl ； 将45mL甲醇，45mL水，1OmL冰乙酸，0.25g考马斯亮蓝R-250 ；90mL甲醇:水(1:1), 1OmL冰乙酸； 将Tris碱5.8g，甘氨酸2.9g，SDS (电泳级).0.37g，甲醇200mL，加去超纯水定容至1OOOmL ； KH2PO40.24g、Na2HPO4.H202.9g、.0.2gKCl、.8.8gNaCl、用超纯水定容至 lOOOmL，并置于高压灭菌锅灭菌后4°C保存备用； 将NaC18.8g、IMTris-HCl (pH8.0) 20mL、加入800mL超纯水充分搅拌溶解，再加Tween-200.5mL混匀，最后加超纯水定容至lOOOmL，并用高压灭菌锅灭菌后于4°C保存备用； PBSlOmL, BSA0.lg，现配先用；.6.0mgDAB, IOmL0.0lM PBS, I μ L H2O2 ； NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4.12 H2O 3.58 g, KH2PO4 0.27 g 加去离子水溶解并定容至 I OOOmL ； 在上述PBS中按0.05%加入Tween-20，混匀；含 5%FBS 的 0.01 mol/L ρΗ7.4 PBS 溶液； 临用前配制 0.1 mol/L 柠檬酸(2.1 g/100 mL),0.2 mol/L Na2HPO4.12H20 6.1 mL,ddH20 12.5 mL,邻苯二胺 10 mg,溶解后，加入 30%H202 40 μ L ； 终止液采用2 mol/L H2SO4。
3.一种利用权利要求1所述制备方法制备的脑多头蝴热休克蛋白抗原建立检测羊脑多头蝴病抗体的重组蛋白胶体金渗滤法，其特征在于，该重组蛋白胶体金渗滤法包括以下步骤: 脑多头蝴总RNA的提取，将保存于液氮的脑包虫原头蝴抽屉总RNA，利用总RNA抽提试剂盒，并按照其说明书进行总RNA抽提； 脑多头蝴HSP基因的RT-PCR扩增，根据测序完成的多头带绦虫转录组数据，利用Primer Primer 5.0软件设讨对引物； 对抽提的RNA，将抽提的脑多头蝴原头节总RNA进行反转录，反应体系同FABP扩增；合成cDNA，加入引物，进行RT-PCR扩增； Tm-HSP基因胶回收、连接、转化，将RT-PCR扩增得到的HSP基因通过胶回收、连接、转化，将其插入入PMD 18-T载体，并且转化入DH5a大肠杆菌进行扩大培养，其具体步骤同Tm-FABP ； pET-32a -Tm-HSP重组质粒的构建及鉴定；pET-32a_HSP重组质粒在大肠杆菌中的表达与鉴定； 将鉴定正确的pET-32a-HSP重组质粒转入E.coli BL21 (DE3)进行表达，并且通过SDS-PAGE进行验证，通过免疫印记检测其反应源性，具体操作步骤同FABP的表达与鉴定；免疫金标渗滤法(DIGFA)的建立； DIGFA与ELISA比较检测。
4.如权利要求3所述的重组蛋白胶体金渗滤法，其特征在于，脑多头蝴HSP基因的RT-PCR扩增,根据测序完成的多头带绦虫转录组数据,利用Primer Primer 5.0软件设计一对引物，由大连宝生物工程有限公司合成； 对抽提的RNA，将抽提的脑多头蝴原头节总RNA进行反转录，反应体系同FABP扩增。合成cDNA，加入引物，进行RT-PCR扩增。扩增参数为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，52°C退火30s，72。。延伸45s，循环扩增30次，最后72°C延伸IOmin0 PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳检查结果。
5.如权利要求3所述的重组蛋白胶体金渗滤法，其特征在于，pET-32a-Tm-HSP重组质粒的构建及鉴定，根据测序结果，通过软件分析扩增出的Tm-HSP基因为一个开放阅读框，用Primer Primer 5.0软件重新设计一对引物, 并在上、下游引物的5’端设计了 Bamh I和Xho I酶切位点； 以pMD-Tm-HSP质粒为模板，用上述弓I物对基因的阅读框进行PCR扩增。该PCR扩增的反应参数:94°C预变性5min ;94°C变性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec，循环扩增30次，最后72°C延伸lOmin。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检查结果，并回收目的片段。将pET-32a(+)质粒及上述胶回收的PCR产物分别用Bamh I和Xho I双酶切，酶切产物用T4连接酶16°C连接过夜，转入E.coli DH5a感受态细胞，提取质粒作双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。
6.如权利要求3所述的重组蛋白胶体金渗滤法，其特征在于，免疫金标渗滤法的建立，最佳抗原包被浓度的确定，在垂直流渗滤法检测盒中央NC膜上中央滴加羊IgG0.5 μ L，为质控点Α。周围四点B、C、D、E点加HSP抗原0.5 μ L，浓度分别为0.5mg/mL、lmg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL，干燥后用封闭液封闭4°C保存备用； 金标试验操作流程，将检测装置置平板上，在NC膜上滴上羊血清30 μ L，待完全渗入后加洗脱液I滴，洗去未结合抗体；再加驴抗羊IgG胶体金标记物I滴，待渗入后加洗脱液两滴，肉眼判定结果； 金标试验结果判定，检测NC膜中央A点显色红色表示检测有效，周围四个热休克抗原包被点显色为阳性；结果表示为“ + ”，“++”，“+++”，仅留下白色或粉红底色为无效检测； 灵敏性试验，取阳性混合血清倍比稀释，用DIGFA检测；DIGFA检测血清稀释为1/5，1/10，1/20，1/40，1/80，1/160 梯度； 特异性试验，将制备好的诊断膜检测健康羊血清与羊脑多头蝴血清，细粒棘球蝴血清，细颈囊尾蝴血清以评估其特异性； 重复性和稳定性试验，将制备好的诊断膜保存于4°C冰箱，每隔一周取出用于脑多头蝴血清的随机检测。
7.如权利要求3所述的重组蛋白胶体金渗滤法，其特征在于，DIGFA与ELISA比较检测，ELISA与DIGFA检测脑多头蝴患病动物和健康动物血清34份，其中脑多头蝴阳性血清6份，健康羊血清20份，细颈囊尾蝴阳性血清5份，细粒棘球蝴绵羊血清3份；ELISA试验用PH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原，按每孔100 μ L包被酶标板，置4°C过夜；用pH7.6的PBST洗涤酶标板3次，加待检血清100 μ L /孔，37°C孵育Ih ；PBST洗涤三次后加HRP-兔抗羊IgGlOOyL /孔，37°C孵育Ih ;洗涤3次后加TMB底物溶液，100 μ L /孔。反应IOmin后用酶标仪于450nm波长处测定吸光值。
全文摘要
本发明公开了一种脑多头蚴热休克蛋白抗原的制备方法，该方法从羊脑多头蚴原头节提取总RNA，采用RT-PCR技术首次扩增出HSP基因序列，该基因的开放阅读框为408bp，编码136个氨基酸。将此基因克隆到pET-32a(+)载体，构建重组表达质粒pET-32a-HSP，经转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达，用SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物；以纯化后的表达蛋白作为抗原，建立检测羊脑多头蚴病抗体的重组蛋白胶体金渗滤法(DIGFA)。本发明通过分子生物学的方法，人工合成了一种可以用于脑多头蚴病诊断的重组抗原，并评价了该表达蛋白在脑多头蚴病诊断中的应用价值。
文档编号G01N33/68GK103205447SQ20121056452
公开日2013年7月17日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者杨光友, 聂华明, 彭雪蓉, 古小彬 申请人:四川农业大学