专利名称：11s大豆抗原蛋白注射液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种IlS大豆抗原蛋白注射液及其制备方法。
背景技术：
大豆在我国普遍种植，具有价格便宜，蛋白质含量高等特点，是畜禽业生产中最主要的蛋白质来源。然而，大豆中存在的抗原蛋白物质能引起人和动物尤其是在婴幼儿和幼龄动物中引发过敏反应导致腹泻甚至死亡，造成重大的损失。据报道，β-伴大豆球蛋白(β -Conglycinin)和大豆球蛋白(Glycinin)是引起动物致敏的主要成分，分布于大豆种子的子叶中。β_伴大豆球蛋白，简称IlS蛋白，是由非共价键形成稳定的三聚体糖蛋白，相对分子量为180 kD,含α, α’和β三个亚基。大丑球蛋白，简称IlS蛋白，分子量为350 KD，由6个亚基组成，每个亚基由一个酸性肽链和一个碱性肽链通过一个二硫键连接起来。这两种组分约占大豆蛋白的70%左右，是引起过敏反应的主要抗原蛋白，也是国内外学者对食源性过敏反应的主要研究对象。目前，大多研究使用膨化、热乙醇变性法、热加工法等处理方法，使致敏因子变性失活；或通过改善酶的作用条件，优化酶制剂的组合，利用外源酶对IlS大豆抗原蛋白进行酶解从而去除抗原蛋白；或使用蛋白质糖基化工程对蛋白质表面的糖链进行改造，来改良蛋白质性质；或利用基因敲除的方法使某些基因无法表达，从而消除大豆中的致敏因子。这些方法不能完全去除致敏物质，而且去除条件要求高，成本增力口，虽然有新品种培育出，但需要复杂的食品安全评估过程和农业推广问题，导致其无法在生产实践中得到广泛应用。因此实现从动物体的过敏反应出发，探索出一种可以保护动物免受IlS大豆抗原蛋白物质危害的方法，不但能够减少经济损失，而且可以有效的控制该病的发生，具有长远的社会效益。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种IlS大豆抗原蛋白注射液。本发明是通过以下技术方案来实现的。一种IlS大豆抗原蛋白注射液，包括以下组分:纯化后的IlS蛋白、白油、司班、硬脂酸铝，以每ImLllS大豆抗原蛋白注射液计，白油为0.41-0.51 mL，司班为0.021-0.035mL，硬脂酸铝为 0.011-0.021g。进一步地，其包括以下组分:纯化后的IlS抗原蛋白、白油、司班、硬脂酸铝，以每ImLllS大豆抗原蛋白注射液计，白油为0.47 mL，司班为0.03mL，硬脂酸铝为0.0lgo一种制备上述IlS大豆抗原蛋白注射液的方法，包括步骤:将IlS蛋白纯化，将白油、司班、硬脂酸铝混合加热至融化，将纯化后的IlS抗原蛋白加入至白油、司班、硬脂酸铝的融化液进行混匀，再乳化得到Iis大豆抗原蛋白注射液。进一步地，上述IlS蛋白的纯化包括:将IlS蛋白溶于pH不小于7.4的磷酸盐缓冲液，凝胶过滤，用磷酸盐缓冲液洗脱得到的洗脱液经透析得纯化的IlS大豆抗原蛋白。进一步地，上述白油、司班、硬脂酸铝混合加热至融化后11(T120 °C灭菌2(Γ40min。进一步地，上述IlS大豆抗原蛋白，白油、司班、硬脂酸铝融化液混匀先用涡旋机混匀，再超声混匀。本发明的有益效果:(I)本发明能有效预防动物对大豆及其饲料的食入性过敏。解决了动物对大豆抗原蛋白食入性过敏的危害。(2)具有较好的稳定性和水溶性无需苛刻的储存条件，使用方便。(3)制备工艺简单可行，已具备扩大生产的条件和技术，更易实现产品化。总之，本发明的IlS大豆抗原蛋白注射液具有针对性强，缓释性高，效果显著等特点，可用于预防临床上动物对大豆及其饲料的食入性过敏问题，有望解决豆制品的食入性过敏带来的危害。本发明具有制备方法简单，便于储存，便于操作，易于工业化生产等优点。
具体实施例方式下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。总体而言，本发明的IlS大豆抗原蛋白注射液的制备包括:(I)抗原的纯化及纯度分析纯化:将IIS蛋白溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲液，Sepharose CL-6B凝胶过滤(1.6X120 cm层析柱)，用磷酸盐缓冲液洗脱得到的洗脱液经透析得IlS蛋白，储存于_20°C作为抗原备用。 纯度分析:将胶板上好并安装在电泳槽中，分别取10 μ 标准(样品)蛋白溶解液于EP管内，再加入10 μ 2倍样品缓冲液，上样量为10 μ 。加样前，样品在沸水中加热3飞min，冷却后备用。根据目的抗原蛋白亚基的分子量大小，选择分离胶和浓缩胶的浓度为5%的凝胶。将胶液沿着玻璃板倒入两板之间的夹缝至离上板口约1.50 cm处，在分离胶溶液上覆盖一层f 5 mm的水层用于消泡和密封。静止放置(45飞O min)待其凝固。蒸馏水冲洗胶面，用吸水纸将胶面吸干。倒好胶后，插好梳子，使梳子孔中无气泡。上样及电泳:上样量分别为10 PL，浓缩胶的电压为55 80 V，电流为16 18 mA，电泳时间1.5 h，分离胶的电压为10(Γ125 V，电流为3(T35 mA,电泳时间4 h。染色和脱色:电泳结束后，撤下胶板切去浓缩胶，轻轻揭下凝胶；37 1:以上温度，在固定液漂洗20 min;弃去固定液，放入适量新鲜染色液染色45 min。倾去染色液,用自来水漂洗直到水流无颜色为止,倒入适量脱色液进行脱色，每隔1.5 h换一次脱色液,直至蛋白亚基条带显色清晰。用Quantity One软件，用光密度法分析SDS电泳图片，并计算其纯度为90.6%。(2)佐剂制备:采用5种不同的佐剂(弗氏佐剂、白油、氢氧化铝、PBS、蜂胶)，其中I种佐剂为本发明的氢氧化铝胶体，另外4种做对比。(具体见实施例f 5)(3)乳化抗原蛋白取0.5 mL的抗原液加入等体积的佐剂(弗氏佐剂、白油、氢氧化铝、PBS、蜂胶)，放置在1.5 mL的EP管中，先用涡旋机混匀，再超声混匀，乳化完成后，4 °C冷藏保存。(4)抗原蛋白注射液检验a.乳化完全性试验
取I滴乳化液滴在一杯清水里，看此液滴是否分散，如果不分散则表明乳化完全，否则还要继续乳化。乳化完成后，37 °C室温保存。
b.稳定性试验
室温37°C保存一个月，底部有微量水析出，摇匀后再放置一周，没有出现分层和破乳的现象。
c.无菌检验
将制备好的注射液接种至营养肉汤中，37 °C培养18 24 h后再接种至营养琼脂斜面，37 °C培养48 72 h，同时取佐剂同法操作，作为阴性对照。结果判定:营养肉汤清亮透明，营养琼脂斜面无菌落生长。
d.刺激性试验和热原性试验
选取健康家兔5只，一侧后肢股四头肌内分别注射蛋白注射液I mL，另一侧后肢对应部位注射生理盐水I mL作为对照，发现眼和结膜、呼吸、饮食、行为活动均表现正常，未见有任何中毒症状和死亡，与对照组比较无差别；48 h后将家兔处死，解剖观察家兔腿部肌肉，其肌肉完整、无充血现象。注射该注射液的家兔并没有出现热原性反应，家兔体温正常。
e.小鼠试用试验及佐剂筛选
采用完全随机化，将260只昆明鼠(20±2 g)随机分为弗氏佐剂处理组、白油佐剂处理组、氢氧化铝佐剂处理组、PBS佐剂处理组、蜂胶佐剂处理组，对照组注射生理盐水，处理组使用不同佐剂IlS大豆抗原蛋白注射液，每个处理组按体重分别注射IlS大豆抗原蛋白量为 500 Pg Kg'1000 Pg Kg'2000 Pg Kg'3000 Pg Kg-1 和 4000 Pg Kg' 首次免疫，取混合乳化后大豆蛋白抗原，于小鼠颈背部皮下注射。10 d后，同样方法注射相应抗原组分(弗氏完全佐剂蛋白抗原注射液替换为弗氏不完全佐剂蛋白抗原注射液)，连续10 d后重复I次，第三次注射完成10 d后采集血液，分离血清，测定抗体效价。
取第三次采血后所得的小鼠血清(免疫不同浓度蛋白血清各一份)，利用打孔器在1%的琼脂糖平板上中心打I个孔，周围6个孔，孔直径约3 mm，孔距约4 mm，封底。用微量移液器加样于孔中，中心孔加入纯化的11S，浓度为I mg*mL'周围6孔依次加入等倍稀释(1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32)的抗血清，于37 °C湿盒中孵育18 24 h，结果显示琼脂糖凝胶扩散试验测定抗 血清的效价，抗体效价均在1:16或1:32。
具体的，参见实施例。
实施例1:一种IlS大豆抗原蛋白注射液，其组成为:
IlS大豆抗原蛋白Iml
弗氏佐剂 0.5ml
弗氏不完全佐剂 0.5ml
各取0.5 mL的抗原液加入等体积的弗氏佐剂和弗氏不完全佐剂，分别放置在1.5mL的EP管中，先用涡旋机混匀，再在超声波匀质机中混匀。并分别取I滴乳化液滴在一杯清水里，看此液滴是否分散，如果不分散则表明乳化完全，否则继续乳化，直至乳化完全，分别灌装于安瓿瓶中121°c高压30min，于37 1:常温保存一个月，看有无分层和破乳现象，如果没有，摇匀后再放置一周，仍没有出现分层和破乳的现象，方可使用。
将制备好的注射液接种至营养肉汤中，37 °C培养18 24 h后再接种至营养琼脂斜面，37 °C培养48 72 h，同时取佐剂同法操作，作为阴性对照。结果判定:营养肉汤清亮透明，营养琼脂斜面无菌落生长，则可表明注射液无菌符合规定；若肉汤混浊，营养琼脂斜面出现菌落繁殖(还需涂片镜检)，则不符合规定。
选取健康家兔5只，一侧后肢股四头肌内分别注射蛋白注射液I mL，另一侧后肢对应部位注射生理盐水I mL作为对照，48 h后将家兔处死，解剖观察注射部位肌肉组织的变化。有无出现热原性反应。
实施例2:—种IlS大豆抗原蛋白注射液，其组成为:
HS大豆抗原蛋白05ml 白油0.47 mL 司班0.0SmTv 硬脂酸铝0.0 Ig
白油，司班，硬脂酸铝，混合加热融化，116 °C灭菌30 min。在IlS蛋白中加入灭菌的白油、司班、硬脂酸铝融化液，再乳化。
取0.5 mL的抗原液加入等体积的白油佐剂，制备方法同实施例1。
实施例3:—种IlS大豆抗原蛋白注射液，其组成为:
IlS大豆抗原蛋白0.5ml
氢氧化铝 0.5ml
无水AlCl3缓慢加入到去离子水中，与适量NaOH反应，沉淀用去离子水反复洗涤数次，离心得到氢氧化铝胶体，116 °C灭菌30 min。取0.5 mL的抗原液加入等体积的氢氧化铝佐剂，制备方法同实施例1。
实施例4:一种IlS大豆抗原蛋白注射液,其组成为:
IlS大豆抗原蛋白0.5ml
PBS0.5ml
NaH2PO4-Na2HPO4 0.01 mol.L'NaCl 0.85%,pH7.4,116 °C灭菌 30 min。取 0.5mL的抗原液加入等体积的PBS佐剂，制备方法同实施例1。
实施例5:—种IlS大豆抗原蛋白注射液,其组成为:
IlS大豆抗原蛋白 0.5ml
蜂胶0.5ml
取合格蜂胶研磨，用适量950 g L4酒精纯化，并配成30 mg mL4溶液。取0.5mL的抗原液加入等体积的蜂胶 佐剂，制备方法同实施例1。
弗氏佐剂IlS蛋白血清抗体效价检测结果
权利要求
1.一种IlS大豆抗原蛋白注射液，其特征在于，包括以下组分:纯化后的IlS蛋白、白油、司班、硬脂酸铝，以每ImLllS大豆抗原蛋白计，白油为0.041-0.05 ImL，司班为0.021-0.035mL，硬脂酸铝为 0.011-0.021g。
2.根据权利要求1所述的IlS大豆抗原蛋白注射液，其特征在于，其包括以下组分:纯化后的Iis大豆抗原蛋白、白油、司班、硬脂酸铝，以每ImLllS大豆球蛋白计，白油为0.47mL ,司班为0.03mL,硬脂酸招为0.0lg。
3.一种制备如权利要求1所述的IlS大豆抗原蛋白注射液的方法，其特征在于，包括步骤: 将Iis蛋白纯化，将白油、司班、硬脂酸铝混合加热至融化，将纯化后的IlS大豆抗原蛋白加入至白油、司班、硬脂酸铝的融化液进行混匀，再乳化得到IlS大豆抗原蛋白注射液。
4.根据权利要求3所述的制备IlS大豆抗原蛋白注射液的方法，其特征在于，所述IlS蛋白的纯化包括:将IIS蛋白溶于pH不小于7.4的磷酸盐缓冲液，凝胶过滤，用磷酸盐缓冲液洗脱得到的洗脱液经透析得纯化的IlS大豆抗原蛋白。
5.根据权利要求3所述的制备IlS大豆抗原蛋白注射液的方法，其特征在于，所述白油、司班、硬脂酸铝混合加热至融化后11(T120 °C灭菌2(T40 min0
6.根据权利要求3所述的制备IlS大豆抗原蛋白注射液的方法，其特征在于，所述IlS大豆抗原蛋白，白油 、司班、硬脂酸铝融化液混匀先用涡旋机混匀，再超声混匀。
全文摘要
本发明公开了一种11S大豆抗原蛋白注射液，按照体积百分比计，其包括以下组分纯化后的11S蛋白、白油、司班、硬脂酸铝，以每1mL11S大豆抗原蛋白注射液计，白油为0.41-0.51mL ，司班为0.021-0.035mL，硬脂酸铝为0.011-0.021g。其制备方法包括将11S蛋白纯化，将白油、司班、硬脂酸铝混合加热至融化，将纯化后的11S大豆抗原蛋白加入至白油、司班、硬脂酸铝的融化液进行混匀，再乳化得到11S大豆抗原蛋白注射液。本发明的优点在于，能有效预防动物对大豆及其饲料的食入性过敏。解决了动物对大豆抗原蛋白食入性过敏的危害；具有较好的稳定性和水溶性无需苛刻的储存条件，使用方便；制备工艺简单可行，已具备扩大生产的条件和技术，更易实现产品化。
文档编号A61K9/107GK103202809SQ20131000096
公开日2013年7月17日 申请日期2013年1月5日 优先权日2013年1月5日
发明者吴金节, 寇亚楠, 孙志阔, 王希春, 马良友, 徐述亮, 陈亮, 王勇, 樊海新, 李宝 申请人:安徽农业大学