合蛋白的油体，本发明人根据 植物偏好性改造了重组成纤维细胞因子9基因，利用重组DNA技术将拟南芥双油体蛋白与 重组成纤维细胞因子9基因融合，插入以pl301为基本骨架改造的植物特异表达载体pOBT， 拟南芥双油体蛋白与重组成纤维细胞因子9基因表达质粒表达载体p0BT-0L-0L-FGF9,转 化至油料作物中，表达了融合蛋白，获得了含双油体蛋白与成纤维细胞因子9融合蛋白的 油体，从而使融合蛋白表达量大大提高。含双油体蛋白与成纤维细胞因子9肽融合蛋白的 油体，具有较高的成纤维细胞因子9活性，省略了成纤维细胞因子9蛋白的提纯过程，以及 成纤维细胞因子9肽与乳化剂(或保护剂）混合的加工工艺，降低了生产成本。可以直接应 用于外用制剂及其化妆品的开发，油体和油体融合蛋白为一体，可以更好地保护重组成纤 维细胞因子9肽，类似PEG修饰的作用，重组成纤维细胞因子9的油体应用于化妆品、头发 护理等产品中，同时，还可以直接携带重组成纤维细胞因子9肽直接作用于患处，更好的发 挥外用药物的效果。油体还可以作为乳化剂，含有重组成纤维细胞因子9肽的油体可以用 于治疗皮肤病类药物和口服药中的成分，促进重组成纤维细胞因子9肽的吸收。
[0017] 用本方法生产重组成纤维细胞因子9肽的方法具有操作简单、成本低廉、表达量 高等特点；在纯化阶段，由于双油体蛋白与重组成纤维细胞因子9肽相偶联表达，所以通过 不同浓度梯度离心的方法可以除去95%以上的杂蛋白，净化融合蛋白。
【附图说明】
[0018]图1菜豆启动子的核酸电泳图； 图2菜豆终止子的核酸电泳图； 图3含重组成纤维细胞因子9基因的植物双油体表达载体p0BT-0L-0L-FGF9示意图； 图4重组成纤维细胞因子9肽的SDS-PAGE检测图； 图5重组成纤维细胞因子9肽的Western Blot检测图； 图6重组成纤维细胞因子9肽的促NIH3T3细胞增值活性检测图。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1:拟南芥油体蛋白基因的克隆 取拟南芥种子，提取DNA基因组，用引物： 1 ：CCATGGCGGATACAGCTAGAGG 2 ：CACCGGGTGGAGTAGTGTGCTGG 进tx扩增拟南芥油体蛋白基因，经测序，其喊基序列如序列表4 (SEQ ID NO. 4)所不； 扩增的片段经限制性内切酶（Ncol酶和EcoRI酶）消化，克隆到pUC57克隆载体中，保存备 用。
[0020] 实施例2:重组成纤维细胞因子9肽基因FGF9的合成 首先根据植物偏好性密码子对从GENBANK中找到的成纤维细胞因子9肽的核苷酸序列 进行改造，将植物中含量较少的稀有氨基酸密码子替换成植物偏好的密码子。根据密码子 的简并性消除在本实验中所用到的酶切位点，送去上海生工生物工程有限公司进行人工合 成重组成纤维细胞因子9肽基因（SEQ ID N0. 1)。
[0021] 实施例3:克隆菜豆种子特异启动子与终止子 为了从菜豆基因组序列中克隆种子特异启动子与终止子，利用引物，采用标准的多聚 酶链式反应（PCR)，从菜豆基因组DNA中扩增得到1548bp和1220bp的DNA片段(如图1和 图2)，扩增的片段经限制性内切酶消化，克隆到pUC57克隆载体中，保存备用。经测序，其碱 基序列如序列表SEQ ID N0. 2和3所示。
[0022] 菜豆启动子引物 Primer5F:GAATTCATTGTACTCCCAG Primer5R ：AGTAGAGTAGTATTGAATATGAG 菜豆终止子引物 tem5F: AATAAGTATGAACTAAAATGC tem5R: TTAGTTGGTAGGGTGCTAGGAA 实施例4:构建植物特异表达载体pOBT 将PUC57-菜豆启动子的克隆载体用限制性内切酶pstl和EcoRI消化，回收目的片段 菜豆启动子序列，同时用pstl和EcoRI消化基本质粒p0(以pl301为基本骨架，将其T-DNA 区进行改造，获得pl301-35S-Bar-N0S基本质粒，简写为p0质粒)，将菜豆启动子与基本质 粒P〇连接，转化大肠杆菌，产生P〇l中间载体；将P01用EcoRI和Ncol消化，与克隆的拟南 芥油体蛋白基因连接，得到中间载体p〇B ;将pUC57-终止子的克隆载体用Hindlll和kpnl 消化，回收目的片段菜豆终止子，同时用这两个酶消化P〇B中间载体，将终止子与酶切后的 P〇B载体连接，转化大肠杆菌，产生了植物特异表达载体p0BT-0L (见图3)。
[0023] 实施例5 p0BT-0L-FGF9载体的构建 SEQ ID N0. 5基因和植物特异表达载体pOBT，用限制性内切酶Ncol与Hindlll进行酶 切后连接，得P0BT-0L-FGF9质粒。
[0024] 实施例6:构建含有拟南芥双油体蛋白与重组成纤维细胞因子9肽融合基因的植 物油体非特异表达载体P0BT-0L-0L-FGF9 以克隆得到的拟南芥油体蛋白基因和合成的重组成纤维细胞因子9肽基因为模板，通 过融合PCR技术，获得01e〇sin-FGF9融合基因，经测序，其碱基序列如序列表5 (SEQ ID NO. 5)所示。将融合基因用限制性内切酶Ncol与Hindlll进行酶切，同时用这两个酶对 pOBT-OL载体进行酶切，然后将融合基因与酶切后的pOBT-OL载体连接，转化大肠杆菌，产 生P0BT-0L-0L-FGF9植物双油体表达载体。
[0025] 拟南芥油体蛋白基因与〇le〇sin-FGF9融合基因引物 1 ：CCATGGCGCCTATGTCGATCTCC 2 ： CGTGTTGATGAATTCGAGGAAACC 3 ： GTGATGAATTCGAGGAAACC 4：CTATAGGAAAGAGTTAGA 实施例7:p0BT-0L-0L-FGF9质粒转化农杆菌EHA105 (1)取100yL农杆菌EHA105感受态细胞置于冰浴中lOmin使其融化备用。（2)取1 yL P0BT-0L-0L-FGF9质粒加入到农杆菌感受态细胞中，用移液枪轻轻吹打，使其混合均匀，冰 浴30分钟。（3)冰浴后立即将其置于液氮中冷冻5min，立刻取出放入37°C热击5min。 (4)加lmL不含抗性YEP液体培养基至离心管中，28°C，180rpm/min摇菌4h。 （5)使用离 心机5000rpm，离心5min，弃上清，加入100 y LYEP培养基重悬。
[0026] (6)将重悬液涂布于含三抗（100 y g/mLRif、50 y g/mLKan 和 50 y g/mL Str))的 YEP固体培养基平板内，在28 °C恒温箱内培养2~3天。
[0027] 利用该方法把P0BT-0L-0L-FGF9转化到农杆菌感受态中，挑取单菌落进行液体震 荡培养，经行菌液PCR筛选转化子，经鉴定为阳性的菌液即为含目的基因p0BT-0L-0L-FGF9 的农杆菌工程菌菌株。用70%甘油保种阳性菌株，-80°C冰箱保存。
[0028] 实施例8:Floral dip方法进行的遗传转化 首先，侵染前一天将野生型拟南芥和亚麻芥植株浇水浇透；将农杆菌工程菌株接种至 50ml 含有三抗（100 μg/ml Rif、50 μg/ml Str 和 50 μg/ml Kan)的 YEP 液体培养基中， 进行预培养（180rpm/min，28°C );取预培养的农杆菌7ml加入到含有三抗的YEP液体培养 基中，进行扩大培养，直至0D5900=1. 0~1. 2 ;把农杆菌菌液移到离心管中，20°C，4000rpm离 心20min，收集菌体，去除三抗培养基。用Floral-Dip Buffer重悬菌体，使其0D590达到 0.8~1.0。转化前剪掉种荚和开花的花芽。在钵体四周插上适当高度的竹签，以便支撑倒过 来进行侵染的钵体。将拟南芥的茎部和叶片基部浸入重悬的农杆菌菌液中，静置5分钟，然 后空掉过多的菌液。放平转化后的钵，用塑料薄膜等保湿过夜，第二天可稍露一小缝，第三 天正常放置。一周后可进行第二次侵染。待种子成熟后，可隔天采摘发黄成熟的荚，收获种 子。
[0029] 实施例9:农杆菌介导的遗传转化 取1 y g P0BT-0L-0L-FGF9质粒DNA加入到100微升EHA105感受态细胞中，轻轻混匀 冰浴放置5min ;然后置于液氮中冷