一种含菊芋果聚糖1-外切水解酶基因的重组载体及其在发酵产酒精中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种含菊芋果聚糖1-外切水解酶基因的重组载 体及其在发酵产酒精中的应用。
【背景技术】
[0002] 植物果聚糖是一种在一般植物中含量较低的碳水化合物，由糖苷键连接多个果糖 基而形成，只有在菊芋（Helianthus tuberosus)的块莖；菊苣（Cichorium intybus)、牛 蒡（Arctium lappal)和鸡脚草（Dactylis glomeratus)的根；百合（Lilium brownii)和 洋葱（Allium cepa)的球莖；黑麦草（Lolium perenne)、大麦（Hordeum vulgare)和小麦 (Triticum aestivum)莖叶等少数几种植物的组织中含量相对较高。而从菊芋中提取的菊 粉（Inulin)是果聚糖的混合物，其单糖基的数目（聚合度）在3-50之间，菊粉占菊芋块茎 鲜重的20 %或干重的90 %。
[0003] 菊粉中的果糖基是通过0 (2-1)键连接，末端存在一个葡萄糖基，通过菊粉酶 (Inulinase)的水解作用可以切断0 (2-1)键而使高聚合度的果聚糖降解成低聚合度的 果聚糖。菊粉酶按作用方式可以分为外切菊粉酶和内切菊粉酶，也有果糖转移酶，但不是 常用分解途径，外切酶每次作用于末端，逐个的切掉末端的0 (2-1)键，最终产物为果糖， 而内切酶则从果糖链的中间切开，其最终产物为低聚果糖。在自然界中，菊粉酶主要来源 于植物和微生物，微生物中的菊粉酶有外切水解酶和内切水解酶。目前微生物中主要存 在外切菊粉酶，烟曲霉和毕赤酵母是最常见的产菊粉酶的微生物，酶切方式均为外切菊粉 酶。而在植物中负责果聚糖降解的是果聚糖外切水解酶（Fructan exohydrolase，FEH)， 主要包括果聚糖1_外切水解酶（Fructanl-exohydrolase, 1-FEH)和果聚糖6-外切 水解酶（Fructan 6-exohydrolase, 6-FEH)。另外果聚糖 6&1-外切水解酶（Fructan 6&l_exohydrolase，6&1-FEH)和 6_ 鹿果三糖外切酶（6-kestose exohydrolase, 6-KEH)也 能水解果聚糖。1-FH1酶能够水解果聚糖的0 (2-1)糖苷键，6-FH1水解0 (2-6)糖苷键， 而6&1-FH1能水解上述两种糖苷键，6-KH1仅仅水解最简单的蔗果三糖（6-kestose)，但并 不是所有这些酶都能在同一个植物中被发现。由于菊粉中的果聚糖都是通过0 (2-1)糖苷 键连接，而在菊芋中发现有1-FH1酶，因而主要是1-FH1酶在菊芋菊粉水解中起外切酶作 用。植物菊粉酶主要存在于含有菊粉的植物根部，如菊苣和大丽花，菊芋块茎等。微生物来 源的菊粉酶一般同时具有果聚糖外切酶和内切酶的能力，而植物来源的FH1酶只有外切酶 能力。
[0004] 菊粉通过外切水解酶的作用降解后产生果糖和葡萄糖，可以进一步产生乙醇，作 为生物能源的原料。对于利用菊芋来进行生物产乙醇的研究，目前国内主要集中在菊粉酶 的筛选和基因工程菌的构建方面。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)是产酒精率较 高的微生物，并且不受高浓度酒精的抑制，工业上常应用酿酒酵母来进行发酵产酒精，但酿 酒酵母产酶率及酶活极低，故需高效的菊粉酶将高聚合度的果聚糖分解成果糖和葡萄糖， 帮助进一步发酵产生乙醇。相关研究报道的酒精发酵用的菊粉酶主要来自微生物如细菌， 酵母等，目前Remize等人将酿酒酵母的FL01絮凝基因转入酿酒酵母ATCC36859中获得了 5g/l的酒精，48g/l的糖，其中果糖含量达到99%;0hta等将曲霉菌突变体817转入酿酒酵 母1200中发酵，产生了体积比为20-21%的高浓度的酒精；而还有研究是从海洋菌株季氏 毕赤酵母菌株（Pichia guilliermondii strain 1)中分离了重组毕赤X-33基因及INU1 基因，并将其转入酿酒酵母WO. (Saccharomycessp. W0.)中，均产生了较高浓度的酒精和果 糖，同时也提高了菊粉酶的酶活。而对于利用高等植物的水解酶转入酵母中产酒精的研究 鲜有报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用高等植物菊粉酶基因发酵产酒精的重组质粒。
[0006] 本发明的另一目的是提供所述的重组质粒在发酵产酒精中的应用。
[0007] 本发明可以通过如下技术方案实现：
[0008] -种重组质粒，是将酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因PGK1启动子插入表达载体 pUG6的EcoRV和Spel酶切位点之间，将融合了 CYC1终止子的菊芋果聚糖1-外切水解酶基 因Ht 1-FEHs插入表达载体pUG6的Spel和Hpal酶切位点之间，将酿酒酵母基因组的一段 18SrDNA序列插入表达载体pUG6的Xbal和BstEII酶切位点之间所得。
[0009] 其中，所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEHs选自菊芋果聚糖1-外 切水解酶基因Ht 1-FEHI或菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEHII，优选菊芋果聚糖 1-外切水解酶基因Ht 1-FEHII。菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEHI可以菊芋品种 "南芋1号"的基因组DNA为模板，以F-FEHI，R-FEHI为引物，利用高保真酶扩增得到，其序 列如SEQ ID NO. 1所示；菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEHII可以菊芋品种"南芋 1号"的基因组DNA为模板，以F-FEHII，R-FEHII为引物，利用高保真酶扩增得到，其序列如 SEQ ID N0. 2 所示。
[0010] 所述的酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因PGK1启动子通过以酿酒酵母6525的基 因组DNA为模板，以引物F-PGK1和引物F-PGK2进行PCR扩增得到；其中引物F-PGK1序列 如SEQ ID N0. 3所示，引物F-PGK2序列如SEQ ID N0. 4所示。
[0011] 所述的CYC1终止子通过以pPICZ a C质粒为模板，以F-CYC和R-CYC1为引物进行 PCR扩增得到；其中，以F-CYCI或F-CYCII和R-CYC1为引物进行PCR扩增得到；其中，所述 的引物F-CYCI或F-CYCII序列分别如SEQ ID N0. 11或SEQ ID N0. 12所示，引物R-CYC1 序列如SEQ ID NO. 13所示。
[0012] 所述的融合了 CYC1终止子的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEHs以CYC1和 FEHs基因的混合物为模板，以F-FEHs和R-CYC1为引物，通过PCR扩增得到；其中融合CYC1 终止子和Ht 1-FEHI时使用引物F-FEHI和R-CYC1，融合CYC1终止子和Ht 1-FEHII时使用 引物 F-FEHII 和 R-CYC1。
[0013] 所述的酿酒酵母基因组的一段18SrDNA序列通过以酿酒酵母6525的基因组DNA 为模板，以引物18SrDNA-F和18SrDNA-R进行PCR扩增得到；其中引物18SrDNA-F序列如 SEQ ID N0. 5 所示，引物 18SrDNA-R 序列如 SEQ ID N0. 6 所示。
[0014] 一种含有本发明所述的重组质粒的重组酿酒酵母6525。
[0015] 所述的酿酒酵母6525是将上述重组载体经限制性内切酶RsrII酶切线性化，将该 线性化的重组载体DNA电转化到制备的酿酒酵母6525感受态中，使线性化的重组载体与宿 主基因组DNA的ISSrDNA片段进行同源重组整合得到。
[0016] 本发明所述的重组质粒在发酵产酒精中的应用；优选在直接发酵菊粉产酒精中的 应用。
[0017] -种利用菊芋果聚糖1-外切水解酶基因发酵菊粉产酒精的方法，将本发明所述 的重组酿酒酵母6525接种到含菊粉的发酵培养基中，在30°C，恒温培养得到含酒精的产 物。
[0018] 其中，所述的发酵培养基配方为：菊粉（20% )，硫酸铵（1% )，pH 5.0(100ml)。
[0019] 发酵产物可通过HP-FFAP毛细管柱（30mX0. 25mm i. d.，0. 25m薄膜厚度），FID检 测器进行检测。
[0020] 有益效果：
[0021] 本发明对从菊芋中提取的植物菊粉酶基因Ht-FEHI和Ht-FEHII的理化性质进行 了检测，发现酶Ht-FEHII在常温下比较稳定而Ht-FEHI对温度敏感，这两种酶在pH4~8 之间酶活较稳定，而不同的金属离子和蛋白抑制剂对这两种酶有不同的抑制或促进作用， 并且巴斯德毕赤酵母X33表达的重组Htl-FEHs酶与1-kestose有着很高的亲和力，经过短 时间的发酵就能达到相当高的酶活力。
[0022] 本发明首次将从菊芋中提取的植物菊粉酶基因Ht-FEHI和Ht-FEHII导入到酿酒 酵母6525中，利用重组型酿酒酵母进行酒精发酵。以野生型酿酒酵母6525为对照，将含有 菊芋菊粉酶基因Ht-FEHI和Ht-FEHII的重组载体导入酿酒酵母中进行发酵，结果发现含菊 芋菊粉酶基因Ht-FEHI和Ht-FEHII的重组酿酒酵母产酒精量相对空白对照组的产酒精量 显著高，由此说明菊芋菊粉酶基因Ht-FEHI和Ht-FEHII可以促进酿酒酵母发酵产酒精。而 菊芋中含有大量的菊粉，可以作为一种新型的材料，从菊芋中提取的菊粉酶基因重组发酵， 为提高酿酒酵母发酵产酒精率提供了一种新的方法。
【附图说明】
[0023] 图1、重组的菊芋果聚糖外切水解酶1-FEHs的热稳定性
[0024] 图2、重组的菊芋果聚糖外切水解酶1-FEHs的pH稳定性
[0025] 图3、不同的金属化合物对重组的菊芋果聚糖外切水解酶1-FEHs活性的影响
[0026] 图4、不同的蛋白抑制剂对重组的菊芋果聚糖外切水解酶1-FEHs活性的影响
[0027] 图5、重组的菊芋果聚糖外切水解酶1-FEHs的动力学曲线
[0028] 图6、菊芋果聚糖外切水解酶基因和CYC1终止子的全长扩增结果；1:两个重复的 Ht 1-FEHII扩增结果，2 :两个重复的Ht 1-FEHI扩增结果，3 :终止子CYC1-I扩增结果，4 : 终止子CYC1-II扩增结果，M:Marker。
[0029] 图7、菊芋果聚糖外切水解酶基因和CYC1终止子融合的扩增结果；1:Ht 1-FEHII 与CYC1融合扩增的结果，2 :Ht 1-FEHI与CYC1融合扩增的结果，M:Mark