重组单链负义植物病毒侵染性克隆构建方法及质粒和病毒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组单链负义植物病毒侵染性克隆构建方法及质粒和病毒。
【背景技术】
[0002] 病毒反向遗传学（reverse genetics)技术是20世纪末发展起来的一门研究病毒 基因组结构与功能的新兴学科，其核心技术是病毒侵染性克隆构建(在动物病毒领域称为 感染性克隆，或病毒拯救技术)。利用侵染性克隆技术可在体外对病毒基因组进行各种修饰 和改造，通过分析重组病毒的表型和特性变化研究病毒基因组的结构、明确其基因及产物 的功能、理解病毒与宿主的相互作用以及改造和利用病毒载体(外源蛋白表达载体、基因沉 默载体和动物病毒疫苗载体等)，该技术是现代病毒学研究领域的最基本、最重要的技术手 段。在RNA病毒中，由于RNA病毒的基因组RNA本身不能被直接操纵，cDNA克隆技术则提 供了一种变通的方法，使RNA病毒的遗传信息通过cDNA克隆转变成可以操纵的DNA分子。
[0003] 正链RNA病毒基因组具有信使RNA (mRNA)活性，其基因组RNA -旦导入敏感细胞 后可直接作为翻译模版，合成病毒编码的复制酶等蛋白，起始病毒的侵染过程。负链RNA病 毒无论是其基因组（gRNA)，或与之互补的反基因组RNA (agRNA)，均不能直接充当mRNA进 行病毒蛋白的翻译，因而单独导入细胞后不具有侵染活性。此类病毒的最小侵染单元是基 因组RNA和核心蛋白（通常包括核衣壳蛋白、RNA聚合酶及其辅助蛋白）所组成的核糖核蛋 白复合物（ribonucleoprotein core complex, RNP) (Conzelmann等，Curr Top Microbiol Immunol，2004，283:1-41)。因此，负链RNA病毒侵染性克隆构建需要在寄主细胞内同时 表达病毒全部核心蛋白组份及全长基因组RNA。其次，导入细胞的RNA转录本两端需忠实 于病毒原始序列时才具有侵染活性（Walpita等，FEMS Microbiol Lett, 2005，244:9-18; Neumann 等，Curr Top Microbiol Immunol, 2004，283:43-60)。再次，负链病毒的 gRNA 为负链，而表达核心蛋白的mRNA为正链，当在细胞内同时表达时可形成双链RNA结构，从而 干扰这些RNA的模版活性，并引发RNA沉默现象（Roberts等，Virology, 1998，247:1-6)。 最后，负链RNA病毒基因组较大(不分段病毒基因组12 kb以上)，或者数目较多（水稻草矮 病毒为6条基因组),遗传操作困难，体内工作效率低。
[0004] 为了解决这些技术障碍，动物病毒学家经多年探索，已形成了解决动物负链病毒 侵染性克隆构建的成熟方案。其基本原理是，将可表达病毒核心蛋白和CRNA的质粒同时转 染敏感细胞，其中cRNA表达质粒通常利用以下两类启动子进行转录：一类为噬菌体T7 RNA 聚合酶启动子，利用这类启动子需要在细胞内通过重组牛痘病毒（Vaccinia virus)载体或 转基因表达T7 RNA聚合酶，以弹状病毒科的狂犬病毒和水疱性口炎病毒的反向遗传学体系 为代表（Schnell 等，EMB0 J, 1994，13:4195-4203; Lawson等，Proc Natl Acad Sci U S A 1995，92:4477-4481).(图1A);另一类为人类Pol I启动子(负责细胞内核糖体RNA转 录)，利用内源的Pol I聚合酶转录病毒cRNA，以流感病毒反向遗传学体系为代表（Neumann 等，Proc Natl Acad Sci U S A 1999，96:9345-9350)(图 1B)。这两类启动子均可通过恰 当的设计，使之在病毒5'端序列的第一个碱基起始转录，且不具有RNA加帽活性(负链RNA 病毒基因组5'端无帽子结构)，而3'端通过与丁型肝炎病毒（HDV)核酶序列融合，经核酶 自剪切加工后形成忠实于病毒序列的全长cRNA转录本。cRNA被共同表达的核衣壳蛋白所 包装，并与病毒聚合酶形成有活性的cRNP，经基因组复制后形成vRNP，并以此为模版转录 病毒mRNA，病毒蛋白翻译后即可包装形成具有侵染性的重组病毒颗粒。
[0005] 尽管植物负链RNA病毒在基因组结构、复制和侵染过程与同类群的动物病毒存在 高度的相似性，但是由于宿主(植物与动物）的显著差别，动物病毒拯救的方法不能直接应 用于植物病毒侵染性克隆的构建。植物系统内在的技术困难，使得迄今为止国际上尚无植 物负链RNA病毒侵染性cDNA克隆的成功报道。植物系统的主要技术困难包括：1)缺乏类 似于动物细胞的体外培养系统。植物悬浮细胞具有细胞壁结构，难以在单个细胞内高效转 化病毒重构所需的多个质粒，而植物原生质体细胞存活时间短(通常2-4天)，因而植物病毒 的侵染性测定只能在植株水平上进行，增加了工作难度；2) T7启动子的利用需要在细胞内 同时表达T7 RNA聚合酶，而该酶在植物体内未有高效利用的报道；Pol I启动子序列变异 大且具有种属特异性，目前该启动子仅在拟南芥等少数植株中被克隆鉴定，但不能在其它 种植物中正确起始转录（Heix等，Curr Opin Genet Dev, 1995，5: 652 - 656) ;3)植物细 胞内较强的RNA沉默活性可降解外源核酸分子的入侵，并抑制外源蛋白的高效表达（Ding 等，Nat Rev Immunol, 2010，10:632-644)。由此可见，植物负链RNA病毒侵染性克隆构建 需要采用与动物病毒不同且更为有效的策略。
[0006] 植物负链RNA病毒包括不分段的弹状病毒科（油aAt/oKirit/ae)、分段的布尼亚病 毒科番爺斑萎病毒属（TbSjOOKiriA?)、蛇形病毒科（QoAioKirit/ae)和纤细 病毒属（等病毒，如弹状病毒科的苦苣菜黄网病毒、水稻黄矮病毒和小麦丛矮 病毒、纤细病毒属的水稻条纹病毒和番茄斑萎病毒属的番茄斑萎病毒等（Kormelink等， 乂；[1'118 1^8，2011，162:184-20 2)。苦苣菜黄网病毒（5'0叱加6176^0『/76^^7>^/61，3￥觀）属 于弹状病毒科细胞核弹状病毒属OVwcJeorAg/WoKiri/6 1)成员。SYNV是植物弹状病毒的模 型病毒，也是研究最为深入的植物负链RNA病毒之一（Jackson等，Annu Rev Phytopathol, 2005，43:623-660)。SYNV 基因组(公知序列，GenBank acc L32603)为单链负义 RNA，长 约13. 7 kb。负义基因组RNA本身不编码任何蛋白，但反基因组RNA (即正义链RNA)编 码6个开放阅读框（open reading frame, 0RF)，在基因组RNA上的相对顺序依次为 3' -N-P-sc4-M-G-L-5'，6个蛋白编码mRNA以负义链基因组RNA为模板依次从基因组RNA的 3'端到5'端进行转录。这些mRNA能在侵染寄主植物细胞的过程中编码6种蛋白质，包括： 核衣壳蛋白（Nucleocapsid, N)、磷蛋白（Phosphoprotein, P)、运动蛋白（sc4)、基质蛋白 (matrix protein, M)、糖蛋白（glycoprotein, G)和 RNA 聚合酶大亚基（Large subunit of polymerase，L)。与其它所有的植物负链RNA-样，SYNV的基因组为负链，病毒的粒 子包括gRNA以及与之包裹的核心蛋白复合体。当SYNV侵入植物细胞后，在核心蛋白复合 体的作用下，以gRNA为模版，转录病毒mRNA，翻译产生病毒蛋白，新合成的病毒核心蛋白与 gRNA包装核糖核蛋白复合体，并催化合成agRNA，进而以agRNA为模版复制大量gRNA，并转 配成病毒粒子（Jackson 等，Annu Rev Phytopathol, 2005，43:623-660)。随后对其它植 物负链RNA病毒的进一步研究也发现，这类病毒的复制和侵染循环存在与SYNV共同的特点 (Kormelink等，Virus Res，2011,162:184-202)。可见，植物负链RNA病毒的结构和侵染 过程存在共性，在模式病毒研究中取得的技术突破，可以应用于其它病毒。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种重组单链负义植物病毒侵染性克隆构建方法及质粒和病毒。
[0008] -种重组单链负义植物病毒侵染性克隆构建方法，在植物细胞中导入质粒载体的 混合物，所述混合物包括（i ) 一种转录载体，所述转录载体包括一种分离的核酸分子，该核 酸分子中含有编码单链负义植物病毒反基因组的多核苷酸序列，（ii)至少一种表达载体， 包括编码所述单链负义植物病毒衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白，和（iii)可 以抑制植物体内基因沉默的沉默抑制子蛋白的多核苷酸序列的一种或多种分离的核酸分 子；所述的质粒载体导入植物细胞的过程是在足以实现所述的所有质粒载体同时转录或共 表达和产生重组病毒的条件下进行的。
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