er。
[0030] 图8、利用EcoVR和Hpal内切酶对pEASY-Blunt和pUG6进行双酶切的结果； 1:对含Ht 1-FEHII基因的pEASY-Blunt进行双酶切的结果，2:对含Ht 1-FEHI基因的 pEASY-Blunt载体进行双酶切的结果，3、4:对pUG6载体进行双酶切的结果，M:Marker。
[0031] 图9、重组的pUG-PFCS载体图谱。
[0032] 图10、用内切酶RsrII将重组质粒线性化的结果；1:未经过单酶切的Ht 1-FEHII 基因的电泳结果，2:经过单酶切的Ht 1-FEHII基因的电泳结果，3:未经过单酶切的Ht 1-FEHI基因的电泳结果，4:经过单酶切的Ht 1-FEHI基因的电泳结果，M:Marker。
[0033] 图11、重组基因转入酿酒酵母6525中进行发酵产酒精的结果；CK:对照组，未转入 菊粉酶基因的酿酒酵母产酒精量，Htl-FEHII:含有Htl-FEHII的重组载体pUG-PFCS转入酿 酒酵母6525中发酵的酒精产量，Htl-FEHI:含有Htl-FEHI的重组载体pUG-PFCS转入酿酒 酵母6525中发酵的酒精产量。
【具体实施方式】
[0034] 以下实施例中所述的重组酶Htl-FEHII说明书中方法制备，按照201410479643. 9 说明书中方法制备，重组酶Htl-FEHI的粗酶液按照201210141758. 8方法制备，纯化方法同 Htl-FEHII，详见201410479643. 9实施例4纯化方法中。
[0035] 实施例1重组的菊芋Htl-FEHs的热稳定性
[0036] 纯化的重组Htl-FEHs酶温度稳定性是通过将重组酶在不同温度（4、30、35、40、 50、60、70°C )下水浴2h后，将重组酶置于冰上恢复低温，然后与最适底物1-kestose混合， pH 6, 35°C下反应过夜，测定剩余酶活性。以置于4°C的重组酶酶活为参照，确定酶的温度稳 定性。
[0037] 结果如图1所示，纯化的重组酶Htl-FEHII在40°C以下的保温2h后仍保持了 80% 以上的活性，说明此酶在常温下是很稳定的，而Htl-FEHI在35°C以上酶活会有明显的下 降，说明此酶对温度较敏感。重组菊粉酶的热稳定性对于工业生产具有重要意义。
[0038] 实施例2重组的菊芋Htl-FEHs的pH稳定性
[0039] 将纯化后的重组蛋白Htl-FEHI和II与不同pH(3、4、5、5. 5、6、6. 5、7、8)缓冲液混 合，在0°C下放置24h后测定剩余酶活，来评价重组酶对pH值的稳定性。以置于最适pH 6 下的酶活为参照，确定菊粉酶的pH稳定性。剩余酶活测定方法：以1-kestose为底物，pH 6, 35°C条件下反应过夜，测定不同pH影响下的酶活变化。结果显示（如图2)，在pH4~8 之间，重组蛋白Htl-FEHI和II的酶活均较稳定。
[0040] 实施例3不同的金属化合物对重组的菊芋Htl-FEHs活性的影响
[0041] 将纯化后的重组蛋白Htl-FEHI和II与不同金属化合物混合，离子浓度终浓度 为1. 0mM，0°C放置60min，测定菊粉酶活性，金属离子包括ZnS04, CuS04. 5H20, MgS04. 5H20， FeCl3, CaCl2, KC1，MnCl2, LiCl，FeCl2, NaCl和(：〇(：12等，对照为加同等体积蒸馏水的重组酶 的酶活，根据剩余酶活判断金属离子对酶活性的影响。
[0042]结果如图 3 所示，1. OmM 的 Li+、Ca2+、K+、Na+、Mg2+和 Co 2+对重组酶 Htl-FEHI 和 II 有不同程度的激活作用，而Fe2+和Cu 2+对重组酶1-FEHs酶活有一定抑制作用，说明它们能 够改变蛋白的构象。
[0043] 实施例4不同的蛋白抑制剂对重组的菊芋Htl-FEHs活性的影响
[0044]将各种化合物（SDS、EDTA和PMSF)与纯化的酶液混合，终浓度为10.0 mM，4°C保温 30min后，测定重组酶活性，以加同等体积蒸馏水的混合物酶活作为对照，根据剩余酶活判 断化合物对菊芋Htl-FEHs酶活性的影响。
[0045] 结果分析可知（如图4)，SDS对重组菊芋Htl-FEHs酶活有明显的抑制作用，而 EDTA和PMSF对重组酶酶活的影响不明显。
[0046] 实施例5重组的菊芋果聚糖外切水解酶1-FEHs的动力学曲线
[0047] 为测定纯化重组酶Htl-FEHs的动力学曲线以及对底物1-kestose的1和V_，分 别将不同浓度底物l-kestose(50mM磷酸缓冲液，pH6)与适量纯化的重组酶Htl-FEHs混 合，底物的最终浓度为〇. 5、1、1. 5、2. 0、4. 0、6. 0、8. 0、10. 0g/L，35°C反应至消耗的底物不超 过最大底物量的10%，95°C反应5min终止反应。根据双倒数作图法（Lineweaver-Burk)以 1/ [S]为横坐标1/V为纵坐标作图，绘制动力学曲线，直线的的斜率为K"/V_，截距为1/V_， 可分别计算出以1-kestose为底物时重组蛋白Htl-FEHI和II的动力学常数&和最大反 应速度V_。
[0048] 如图5所示，左图为Htl-FEHI的动力学曲线，计算得到的&为0? 68mg/ml，V _ 为0? 00129mg/min。右图为Htl-FEHII的动力学曲线，计算得到的&为0? 92mg/ml，乂咖为 0. 0048mg/min。Km越小与底物的亲和力越大，以上结果表明，巴斯德毕赤酵母X33表达的重 组Htl-FEHs酶与1-kestose有着很高的亲和力，经过短时间的发酵就能达到相当高的酶活 力。
[0049] 实施例6Ht 1-FEHs基因克隆载体的构建
[0050] (1) 3-磷酸甘油激酶PGK1启动子的扩增
[0051] 以酿酒酵母6525的基因组DNA为模板，用引物F-PGK1和F-PGK2扩增3-磷酸 甘油激酶PGK1启动子。为方便将启动子插入表达载体中，在上游引物中引入酶切位点 EcoRV:G|ATATC，加上保护碱基：CCG，在下游引物中引入酶切位点SpeI:A|CTAGT，加上保护 碱基：CGG，引物F-PGK1和F-PGK2的序列如下，酶切位点如下划线所示：
[0052] F-PGK1 :5,-CCGGATATCGACTTCAACTCAAGACGCACAG-3, (SEQ ID NO. 3)
[0053] F-PGK2 :5'-CGGACTAGTTGTTTTATATTTGTTGTA-3' (SEQ ID NO. 4)
[0054]反应体系（50. 0 y 1):
[0055]
[0056] PCR反应条件如下：
[0057]
[0058] (2) 18SrDNA 的扩增
[0059] 用引物18SrDNA-F和18SrDNA-R，以酿酒酵母6525的基因组DNA为模板，扩增 800bp左右的18SrDNA片段。在上游引物引入酶切位点Xbal :T|CTAGA，保护碱基：GC，下游 引物引入酶切位点BstEII :G|TCACC，保护碱基：GG，引物序列如下，酶切位点如下划线所 示：
[0060] 18SrDNA-F :5' -GCTCTAGATGAGACGGCTACCACAT-3'（SEQ ID N0. 5)
[0061] 18SrDNA-R :5'-GGGTCACCTCTGGACCTGGTGAGTTT-3'（SEQ ID NO. 6)
[0062] (3)融合PCR将菊粉酶基因和终止子融合成一个片段
[0063] 取菊芋品种"南芋1号"的基因组DNA为模板，以F-FEHI，R-FEHI，F-FEHII，R-FEHII 为引物，利用高保真酶扩增FEH基因。以pPICZ a C质粒为模板，F-CYCI和R-CYC1，F-CYCII 和R-CYC1分别为引物扩增Htl-FEHI和Htl-FEHII对应的终止子CYC1-I和CYC1-II，然后 以FEHI和CYC1-I，以及FEHII和CYC1-II的混合物分别为模板，用相应的引物F-FEHI和 R-CYC1, F-FEHII 和 R-CYC1 再进行一轮扩增，将 FEHI 和 CYC1-I 及 FEHII 和 CYC1-II 分别 融合成两个片段。为方便将FEHs基因与CYC1终止子融合，设计引物时在FEHs的下游引物 中引进一段CYC1前段的核苷酸序列，在CYC1的上游引物中引进一段FEHs末端的核苷酸 序列。为方便将FEHs基因和CYC1基因插入表达载体中，在FEHI引物的上游引入酶切位点 SpeI:A|CTAGT，加上保护碱基：GG，由于FEHII序列中含有Spel酶切位点，故在FEHII的上 游引物中引入Spel的同尾酶Xbal :T|CTAGA，加上保护碱基：GC，在CYC1的下游引物中引 入酶切位点HpaI:GTT|AAC，加上保护碱基：CCG。引物序列如下，酶切位点如下划线所示：
[0064] F-FEHI:5'-GGACTAGIatggtaaaggagatggc-3' (SEQ ID NO. 7)
[0065] R-FEHI:5'-GTGACATAACTAATTACATGATtcaatccataggaac-3'（SEQ ID NO. 8)
[0066] F-FEHII:5'-GCTCTAGAatgaaccaacttctttc-3' (SEQ ID NO. 9)
[0067] R-FEHII:5'-GTGACATAACTAATTACATGATttaagttgcactttttacg-3'（SEQ ID NO. 10)
[0068] F-CYCI:5'-gttcctatggattgaATCATGTAATTAGTTATGTCAC-3'（SEQ ID NO. 11，Ht 1-FEHI扩增上游引物）
[0069] F-CYCII :5'-cgtaaaaagtgcaacttaaATCATGTAATTAGTTATGTCAC-3'（SEQ ID NO. 12， Htl-FEHII扩增上游引物）
[0070] R-CYC1:5,-CCGGTTAACCTGGCTTATCGAAA-3, (SEQ ID NO. 13)
[0071]反应体系（50. 0 y 1):
[0072]
[0073] 融合反应体系与上述体系相同，融合PCR时将模板DNA改为FEHs产物和CYC1产 物各加 2