y L，ddH20 加 19 y L。
[0074] PCR反应条件如下：
[0075]扩增 CYC1:
[0076]
[0077] 扩增FEH以及融合FH1和CYC1 :
[0078]
[0079]
[0080] 将扩增产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果。结果如图6和图7显示， 得到2kb左右的片段，与预期相同，说明Htl-FEHI(1683b)，Htl-FEHII(1746b)分别和 CYCl(302b)融合成功。
[0081] (4)表达质粒pUG-PFCS的构建
[0082] 将以上获得的基因片段分别克隆到pEASY-Blunt平末端载体上，再利用相应内切 酶对pEASY-Blunt载体和pUG6载体进行双酶切，并用T4连接酶将基因融合片段与pUG6载 体相连，即得到克隆载体pUG-PFCS，如图8、9所示。
[0083] (5)重组质粒的验证
[0084]分别用 Hpal 和 SpeI、HpaI 和 EcoRV、SpeI 和 EcoRV 双酶切重组质粒 pUG-PFCS，酶 切后跑琼脂糖电泳，观察胶上是否有预计长度的条带并测序，从而验证pUG-PFCS是否正确 构建。
[0085]用引物 18SrDNA-F 和 18SrDNA-R，以质粒 pUG-PFCS 为模板，扩增 18SrDNA,将 PCR 产物跑琼脂糖电泳，如果能扩增到相应的条带，说明ISSrDNA片段被连接到质粒上了。
[0086] 实施例7酵母酿酒酵母（S. cerevisiae) 6525的转化
[0087] (1)重组质粒的线性化
[0088] 用内切酶RsrII酶切质粒pUG-PFCS，使质粒从螺旋状变成线性。
[0089] 酶切体系如下（300 yL):
[0090]
[0091] 30°C，反应过夜，纯化回收DNA。以未酶切的载体为模板作对照跑1%琼脂糖凝胶 电泳，发现未酶切的片段大小比单酶切的片段大小短，并且切下的条带大小为8kb左右，如 图10所示，说明单酶切成功。
[0092] (2)制备酵母酿酒酵母（S. cerevisiae) 6525感受态
[0093] 1)取5. OmL酿酒酵母6525种子液接入到50.0 mL YPD液体培养基中，30°C过夜培 养。
[0094] 2)取过夜培养的菌体0. 1-0. 5mL接入到100.0 mL新的YPD液体培养基中，培养至 细胞密度约为lX10scells/mL。
[0095] 3)将菌液冰浴15min使其停止生长。
[0096] 4) 3000 Xg，4°C离心5min，弃上清，用50.0 mL冰浴的无菌水重悬菌体，再次离心去 上清。
[0097] 5)重复步骤4,只是使用的无菌水的总量为100mL
[0098] 6)3000父8,4°(：离心5111111，弃上清，将菌体悬浮在20.01^冰浴的邡山梨醇中。
[0099] 7)3000父8,4°(：离心5111111，弃上清，用0.51^冰浴的说山梨醇重悬菌体，最终的细 胞密度约为1 X lOlells/mL，将细胞置于冰上，用于当天转化。
[0100] (3)酿酒酵母6525的转化
[0101] 1)在1. 5mL的无菌EP管中加入5 y 1线性化的pUG-PFCS (5-10 y g)，加入40. 0 y 1 上述感受态酵母细胞，轻轻的混匀，在冰上放置5min。
[0102] 2)将上述溶液转移至预冷的无菌的0. 2cm电转杯中。
[0103] 3)电穿孔转化电击条件：电压：1500V ;电阻：400Q ;电容：25yF ;脉冲时间： 5mS ；
[0104] 4)电击后，立即在电击转化杯中加入1. OmL 0°C预冷的1. 0M的山梨醇溶液，用微 量移液器轻轻吹打均匀，置于冰浴中。
[0105] 5)将电转杯中的混合液转移到新的无菌1. 5mL的Eppendorf管中，30°C，静置培养 4_5h〇
[0106]6)取200. 0 u 1混合液涂布在含有200. 0 u g/mL G418的YPDS平板上。
[0107] 7)平板倒置于30°C培养箱中培养3_5d后可见单克隆。
[0108] (4)菌落PCR验证阳性克隆
[0109] 将平板上的单克隆沾取少许涂抹到1. 5mL的Eppendorf管的管底，加入20 y 1 ddH20溶解，在涡旋振荡机上充分涡旋5min后在微波炉中加热5min，在液氮中冷冻lmin，再 放入微波炉中加热5min，再放入液氮中冷冻lmin，最后在微波炉中加热5min，使酵母细胞 充分破壁。将PCR反应混合溶液除Taq酶之外依次加入，混合后，用牙签挑取少许破壁的单 克隆溶液在PCR反应混合溶液中稍微蘸一下，混匀。将PCR管置于PCR仪上，95°C变性lOmin 后取出，加入Taq酶，再放回PCR仪上，设置正常的PCR程序反应，将PCR反应产物跑琼脂糖 电泳，观察电泳胶，目标条带出现，说明成功的将重组质粒PUG-PFCS转入酿酒酵母6525中。
[0110] 实施例8利用转化子直接发酵菊粉生产乙醇
[0111] 选用活性高的转化子菌株作为直接发酵菊粉的菌株，先将其在YPI培养基中 30°C，200rpm振荡培养72h，再取适量培养液接种到发酵培养基中。在装有乙醇发酵培养基 100mL的250mL三角瓶中，接种10%的培养了 3d的转化子菌株。其中，以酿酒酵母野生型 菌株6525为对照。30°C，恒温培养。每隔24h取样一次，测定发酵液中的乙醇含量、残留总 糖和还原糖的浓度。乙醇的测定条件如下
[0112] 用气相色谱（Agilent7890Hewlett_Packard，USA)进行测定。色谱条件如下：
[0113] 色谱柱：HP-FFAP 毛细管柱（30mX0. 25mm i. d.，0? 25m 薄膜厚度）
[0114] 检测器：FID
[0115] 进样 口温度：200°C
[0116] 柱温：80°C
[0117] 检测器温度：250°C
[0118] 进样体积：0. 2yL
[0119] 分流比：100:1
[0120] 结果如图11所示，转入Htl-FEHI和Htl-FEHII的重组酿酒酵母酒精产量分别 为每毫升培养基产41. 27mg乙醇和48. 42mg乙醇，均高于野生型酿酒酵母6525产酒精量 (33. 68mg/ml)。
【主权项】
1. 一种重组质粒，其特征在于是将酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因PGKl启动子插入 表达载体PUG6的EcoRV和SpeI酶切位点之间，将融合了 CYCl终止子的菊芋果聚糖1-外 切水解酶基因Ht I-FEHs插入表达载体pUG6的SpeI和HpaI酶切位点之间，将酿酒酵母基 因组的一段18SrDNA序列插入表达载体pUG6的XbaI和BstEII酶切位点之间所得。2. 根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEHs选自菊芋果聚糖1 -外切水解酶基因Ht I-FEHI或菊芋果聚糖1 -外切水解酶基 因Htl-FEHII ;所述的酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因PGKl启动子通过以酿酒酵母6525 的基因组DNA为模板，以引物F-PGKl和引物F-PGK2进行PCR扩增得到；其中引物F-PGKl 序列如SEQ IDNO. 3所示，引物F-PGK2序列如SEQ ID NO. 4所示。3. 根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述的CYCl终止子通过以pPICZ a C 质粒为模板，以F-CYCI或F-CYCII和R-CYCl为引物进行PCR扩增得到；其中，所述的引物 F-CYCI或F-CYCII序列分别如SEQ ID NO. 11或SEQ ID NO. 12所示，引物R-CYCl序列如 SEQ ID NO. 13 所示。4. 根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述的融合了 CYCl终止子的菊芋果 聚糖1-外切水解酶基因Ht I-FEHs以CYCl和FEHs基因的混合物为模板，以F-FEHs和 R-CYCl为引物，通过PCR扩增得到；其中融合CYCl终止子和Ht I-FEHI时使用引物F-FEHI 和R-CYCl，融合CYCl终止子和Ht I-FEHII时使用引物F-FEHII和R-CYCl。5. 根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于所述的酿酒酵母基因组的一段 18SrDNA序列通过以酿酒酵母6525的基因组DNA为模板，以引物18SrDNA-F和18SrDNA-R 进行PCR扩增得到；其中引物18SrDNA-F序列如SEQ ID NO. 5所示，引物18SrDNA-R序列如 SEQ ID NO. 6 所示。6. -种含有权利要求1~5中任一项所述的重组质粒的重组酿酒酵母6525。7. 权利要求1~5中任一项所述的重组质粒在发酵产酒精中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于权利要求1~4中任一项所述的重组质粒 在直接发酵菊粉产酒精中的应用。9. 一种利用菊芋果聚糖1 -外切水解酶基因发酵菊粉产酒精的方法，其特征在于将权 利要求6所述的重组酿酒酵母6525接种到含菊粉的发酵培养基中，在30°C，恒温培养得到 含酒精的产物。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于发酵培养基配方为：菊粉20wt %，硫酸铵 Iwt %, pH 5. 0〇
【专利摘要】本发明公开了一种含菊芋果聚糖1‐外切水解酶基因的重组载体及其在发酵产酒精中的应用。一种重组质粒，是将酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因PGK1启动子插入表达载体pUG6的EcoRV和SpeI酶切位点之间，将融合了CYC1终止子的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht？1-FEHs插入表达载体pUG6的SpeI和HpaI酶切位点之间，将酿酒酵母基因组的一段18SrDNA序列插入表达载体pUG6的XbaI和BstEII酶切位点之间所得。本发明所述的重组质粒在发酵产酒精中的应用。菊芋菊粉酶基因Ht-FEHI和Ht-FEHII可以促进酿酒酵母发酵产酒精，为提高酿酒酵母发酵产酒精率提供了一种新的方法。
【IPC分类】C12N1/19, C12R1/865, C12P7/06, C12N15/81
【公开号】CN105039387
【申请号】CN201510536766
【发明人】梁明祥, 张茜, 许欢欢
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月27日